Visualizzazione dei Vascolare Ca 2 + Segnalazione Innescato dal paracrini Derivato ROS
21 dicembre 2011
Un metodo efficiente per acquisire conoscenze in visualizzando il paracrino derivato induzione di ROS endoteliali Ca2 + segnalazione è descritto. Questo metodo si avvale della misurazione paracrini derivati ROS innescato mobilitazione Ca2 + in cellule endoteliali vascolari in una co-coltura modello.
L'obiettivo generale di questa procedura è visualizzare la segnalazione vascolare del calcio attivata da specie reattive dell'ossigeno derivate dal sistema pericrino o r os. Ciò si ottiene visualizzando prima R os utilizzando coloranti sensibili all'ossidazione nei macrofagi attivi. I ROS possono anche essere visualizzati nelle cellule endoteliali utilizzando sensori fluorescenti basati su plasmidi.
Quindi procedere alla visualizzazione simultanea dei macrofagi attivati marcati in rosso e dell'influenza di quattro cellule endoteliali marcate in un modello di co-coltura. Infine, misurare la segnalazione del calcio nelle cellule endoteliali attivata da R os derivata dai macrofagi. Utilizzando un sistema di imaging confocale.
Questi risultati possono dimostrare i livelli di R os in modo indipendente e contemporaneamente valutare la mobilizzazione intracellulare del calcio innescata dai ROS derivati da Peregrine. Questo metodo consente la valutazione simultanea di due diverse molecole di segnalazione che suscitano intimamente una segnalazione vascolare e un simulatore di impostazione fisiopatologica. Due postdoc nel mio laboratorio, Karthik e Raj, dimostreranno la procedura sulle misurazioni grezze e di calcio e sulle interazioni tra le cellule endoteliali dei macrofagi.
Macrofagi derivati da monociti di topo su piastre da 35 millimetri con fondo di vetro. Quindi sfida le cellule con agonisti del recettore toll-like e incuba per sei ore a 37 gradi Celsius. Per la visualizzazione del citosolico.
I ROS aggiungono colorante sensibile all'ossidazione e incubano le cellule per 20 minuti. Ora visualizza le cellule su uno stadio a temperatura controllata di un sistema di imaging confocale. In alternativa, per visualizzare i ROS mitocondriali nelle cellule attivate dai TLR, aggiungere l'indicatore di superossido mitocondriale e incubare le cellule per 30 minuti a 37 gradi Celsius.
Per un controllo negativo, trattare le cellule con PBS o DMSO per un controllo positivo. Trattare le cellule con due millimolari di antimicina. A procedere alla visualizzazione di tutte le cellule sullo stadio a temperatura controllata di un sistema di imaging confocale.
Utilizzando il software Image J, analizza tutti i dati dell'immagine. Il sensore fluorescente iper-sensore rileva in modo specifico le concentrazioni submicromolari di perossido e, in base all'espressione dei mammiferi, il design del vettore può essere mirato sia al citoplasma che ai mitocondri. Utilizzando l'elettroporazione, creare linee stabili di cellule endoteliali microvascolari polmonari di topo che portano plasmidi di iperespressione inappropriati.
Per facilitare la crescita delle cellule della piastra di colonia a bassa densità in TMEM completo e incubare per 48 ore, sostituire il terreno con un terreno di coltura completo integrato con un antibiotico di selezione. Screening dei cloni per la più alta percentuale di cellule iperpositive e amplificazione della coltura per creare linee iper positive stabili nei singoli esperimenti. Semina le cellule su vetrini coprioggetti rivestiti di gelatina allo 0,2% e la coltura durante la notte fino all'80% di confluenza.
Ora attiva le cellule con i ligandi TLR e incuba per sei ore a 37 gradi Celsius. Per la rilevazione dei ROS citoplasmatici, montare i vetrini coprioggetti delle cellule su una camera cellulare adel. Aggiungere un millilitro di serbatoi di preriscaldamento, bilanciare la soluzione salina e posizionare la camera su uno stadio a temperatura controllata del sistema di imaging confocale.
Registrare i cambiamenti di fluorescenza nelle cellule per la rilevazione dei mitocondriali. ROS. Includere un controllo positivo di due micromolari di antimicina A.Quindi preparare i vetrini coprioggetti delle cellule trattate per la microscopia confocale. Eseguire l'analisi delle immagini utilizzando il software Image J.
Iniziate con le cellule endoteliali cresciute all'80% di confluenza su vetrini di vetro rivestiti di gelatina per la visualizzazione e la misurazione delle variazioni intracellulari del calcio. Incubare le cellule nel colorante fluorescente influenzale alle 4:00 del mattino a temperatura ambiente per 30 minuti per ridurre al minimo la perdita di colorante, lavare le cellule con una soluzione di imaging sperimentale contenente suen pyro zone. Ora montate i vetrini copricoperchio su una camera cellulare adelo a 800 microlitri di soluzione di imaging sperimentale preriscaldata e posizionate le cellule su uno stadio a temperatura controllata del sistema di imaging confocale in un tubo separato.
Utilizzare 500 nanogrammi per millilitro di cell tracker rosso C-M-T-P-X per 15 minuti per etichettare la popolazione di macrofagi in esame, lavare le cellule e risospendere i pellet in 200 microlitri di soluzione di imaging sperimentale. Ora aggiungi i macrofagi etichettati sull'influenza oh 4:00 AM caricato. Le cellule endoteliali nell'assemblaggio della camera confocale registrano la fluorescenza verde e rossa ogni tre secondi per 10 minuti.
In questo esperimento, le cellule J 7 74 0.1 sono state messe alla prova con TLR due, tre e quattro ligandi per sei ore. Le immagini confocali rappresentative mostrano un aumento della R os citosolica misurata dal DCF. È interessante notare che la fluorescenza rossa delle calze mitosi indica un aumento simile dei ROS mitocondriali.
Questi cambiamenti di fluorescenza sono quantitativi. Quindi i risultati devono essere normalizzati ed espressi come variazione relativa del fold per trattamento, il segnale dell'antimicina a convalida un controllo positivo per la produzione di ROS mitocondriali. Questa figura mostra immagini dei livelli di perossido endoteliale, citosolico e mitocondriale in ipercitocito o iper D mito che esprimono stabilmente.
MP ECS stimolato con agonisti TLR. La quantificazione della variazione media della fluorescenza dimostra un aumento dell'ipercitofluorescenza e dell'iper D mito fluorescenza dopo sei ore di stimolazione in un sistema di co-coltura. Per valutare la segnalazione dei ROS di Peregrine, i macrofagi mirin appena isolati sia da topi wild type che da topi GP 91 Fox null sono stati attivati da un microgrammo per millilitro di LPS per sei ore.
I macrofagi sono stati etichettati in rosso con C-M-T-P-X e aggiunti al quattro verde dell'influenza. Caricato. MPM ecs. È interessante notare che i macrofagi attivati da LPS isolati da topi wild type hanno innescato un'ampia e rapida mobilizzazione del calcio nel MPM ECS rispetto ai macrofagi di topi GP 91 Fox null.
Durante il tentativo di LI di eseguire questa procedura, è importante ricordare che il download prolungato o l'esposizione al laser portano all'ossidazione automatica del DCF. È fondamentale evitare il fotosbiancamento dell'ipercitocito e dell'iper D mitrale. Una volta padroneggiata, la misurazione dell'artrite reumatoide nei macrofagi e nelle cellule endoteliali può essere eseguita in sette ore se eseguita correttamente.
Visualizza la trascrizione completa e accedi a migliaia di video scientifici
Panoramica
Questo articolo descrive un metodo per visualizzare la segnalazione del calcio vascolare indotta da specie reattive dell'ossigeno (ROS) derivate da paracrine. L'approccio utilizza coloranti sensibili all'ossidazione e sensori fluorescenti per osservare le ROS nei macrofagi e nelle cellule endoteliali all'interno di un modello di co-coltura.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Neuroscienza
- Biologia cellulare
- Biologia vascolare
Contesto
- Le specie reattive dell'ossigeno (ROS) svolgono un ruolo critico nella segnalazione cellulare.
- Le cellule endoteliali rispondono ai segnali paracrini dai macrofagi.
- La segnalazione del calcio è essenziale per varie funzioni cellulari.
- La visualizzazione di queste interazioni può migliorare la nostra comprensione della biologia vascolare.
Obiettivo dello studio
- Visualizzare la segnalazione del calcio nelle cellule endoteliali innescata dalle ROS derivate dai macrofagi.
- Utilizzare un modello di co-coltura per studiare le interazioni cellulari.
- Impiegare tecniche di imaging avanzate per l'osservazione in tempo reale.
Metodi utilizzati
- Coloranti sensibili all'ossidazione per visualizzare le ROS nei macrofagi.
- Sensori fluorescenti basati su plasmidi per rilevare le ROS nelle cellule endoteliali.
- Modello di co-coltura di macrofagi attivati e cellule endoteliali.
- Sistema di imaging confocale per misurare la segnalazione del calcio.
Risultati principali
- Visualizzazione di successo delle ROS sia nei macrofagi che nelle cellule endoteliali.
- Mobilitazione del calcio dimostrata nelle cellule endoteliali dopo l'esposizione alle ROS.
- Evidenziata l'importanza della segnalazione paracrina nelle risposte vascolari.
- Fornito un quadro per futuri studi sulle interazioni di segnalazione cellulare.
Conclusioni
- Il metodo visualizza efficacemente il ruolo delle ROS nella segnalazione del calcio endoteliale.
- Le intuizioni acquisite possono informare strategie terapeutiche che mirano alla disfunzione vascolare.
- Ulteriori ricerche sono giustificate per esplorare le implicazioni di questi risultati.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
This method enables visualization of paracrine ROS-induced calcium signaling in vascular endothelial cells, providing a mechanistic link between inflammatory cell activation and vascular dysfunction. It supports target validation by demonstrating how macrophage-derived ROS trigger intracellular signaling pathways relevant to ischemia/reperfusion injury and sepsis. The approach offers predictive value for de-risking therapeutic candidates aimed at modulating ROS-mediated endothelial activation in preclinical disease models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates the hypothesis that paracrine ROS from activated macrophages induce calcium signaling in adjacent endothelial cells.
- Operational Value: Enables functional validation of ROS sources (e.g., NADPH oxidase) in inflammatory pathways using co-culture systems.
- Scientific Value: Supports mechanistic de-risking by linking ROS production to downstream calcium-dependent signaling in vascular cells.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares standardized endothelial and macrophage co-culture systems for quantitative assessment of ROS-triggered calcium flux.
- Operational Value: Utilizes oxidation-sensitive dyes and genetically encoded sensors to generate reproducible, normalized fluorescence readouts.
- Scientific Value: Enables simultaneous detection of ROS and calcium mobilization, supporting multiplexed assay design for pathway interrogation.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Models disease-relevant vascular inflammation by using TLR-activated macrophages to stimulate endothelial calcium responses.
- Operational Value: Provides a scalable platform to compare wild-type and genetically modified macrophages (e.g., gp91phox-null) in ROS-dependent signaling.
- Scientific Value: Supports translational biomarker alignment by quantifying calcium mobilization as a functional readout of paracrine ROS activity.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to preclinical validation, enabling iterative assessment of ROS-mediated vascular signaling in inflammatory contexts.
- Discovery Biology: Tests the mechanistic link between macrophage activation and endothelial calcium signaling via ROS.
- Screening: Delivers assay-ready co-culture systems with quantitative, simultaneous readouts of ROS and calcium flux.
- Analytics: Generates normalized fold-change fluorescence data enabling comparison across genetic or pharmacological conditions.
- Translational Research: Connects paracrine ROS signaling to endothelial dysfunction models relevant to sepsis and ischemia/reperfusion.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging-based platform for studying cell-cell communication in vascular inflammation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by visualizing causal ROS-to-calcium signaling in vascular cells.
- Operational Value: Standardizes co-culture preparation and imaging protocols for reproducible ROS and calcium measurements across laboratories.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by reducing mechanistic ambiguity in ROS-driven vascular pathways.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds targeting NADPH oxidase or ROS-scavenging mechanisms.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary cell culture, fluorescent dye loading, and confocal microscopy.
- Dependent on access to oxidation-sensitive dyes (e.g., DCF), fluorescent calcium indicators (e.g., Fluo-4), and plasmid-based ROS sensors.
- Necessitates standardization of macrophage activation (e.g., TLR ligand dose and duration) and endothelial cell confluence for consistent signaling.
- Involves adaptation considerations when extending to human primary cells or alternative vascular cell types.
- Includes practical limitations such as photobleaching of dyes and auto-oxidation risks during prolonged imaging.
