Name: Determinazione del Raft Lipid partizionamento delle sonde fluorescenti-tag nelle cellule viventi da spettroscopia di fluorescenza di correlazione (FCS) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: Scopri come quantificare il partizionamento dei raft lipidici nelle cellule viventi utilizzando la spettroscopia di correlazione di fluorescenza (FCS). Questa tecnica misura i tempi di diffusione delle proteine fluorescenti per studiare la dinamica dei microdomini di membrana.

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Questo lavoro è stato sostenuto da una borsa da Agence Nationale de la Recherche (ChoAD). Siamo anche grati alla Fondazione ICM (Institut du cerveau et de la Moelle) per il loro sostegno finanziario.

1. Calibrazione del Setup FCS <ol><li> Avviare il microscopio confocale, laser, computer, incubatore per la temperatura e CO 2 di controllo. </li><li> Assicurarsi che la SPAD (Single Photon Avalanche Diode) è e che il filtro a fluorescenza all'interno della SPAD ben si adatta al vostro campione. Controllare che la SPAD è sincronizzato nel tempo. Attenzione per avviare solo il software FCS una volta le impostazioni SPAD sono pronti per l'acquisizione. </li><li> Preparare una soluzione fresca di tossina del colera-Alexa488 diluito in PBS per raggiungere una concentrazione di 1 pg / ml (17,5 nM). </li><li> Ottimizzazione confocale di soluzione con rilevamento interna del microscopio. </li><li> Passa a punto modalità di scansione e scegliere un punto nella soluzione di campione. Assicurarsi che la durata di illuminazione laser è abbastanza a lungo per eseguire le acquisizioni FCS (più di 5 minuti). </li><li> Passa alla rilevazione esterna da parte della SPAD e al software FCS. Monitorare il segnale di fluorescenza e assicurarsi che sia ben suiTed al SPAD (segnale sufficiente, ma senza saturazione, 10 000 a 50 000 conteggi / s va bene). Se necessario, modificare la posizione Z, di guadagno e / o potenza del laser per ottenere corretto segnale di fluorescenza. </li><li> Acquisire 10 serie di 30 misure secondi. Il tempo di acquisizione dovrebbe essere ottimizzato per il campione (il miglior compromesso tra campionamento e problemi photobleaching). </li><li> Analizzare i dati (vedi punto 4) per garantire che si dispone di un auto-correlazione curva corrispondente ad una specie fluorescenti diffusione in soluzione (equazione in figura. 2) e che il tempo di diffusione ottenuti dopo il montaggio è corretto (circa 0,2 ms) (Fig . 3). </li></ol> 2. La colorazione delle cellule viventi con la Lipid Marker Zattere <ol><li> Piastre su cellule HEK293 8-Labteks e rivestiti con poli-L-lisina (1mg/ml) il giorno prima di imaging per assicurarsi che la loro adesione è corretta. Utilizzare mezzo senza rosso fenolo per garantire che non perturbazione del segnale di fluorescenza. </li><li>Lavare le cellule due volte con HBSS (soluzione salina tampone di Hank). </li><li> Aggiungere tossina del colera-Alexa488 (1 pg / ml) / BSA (0,1%) in 500 pl HBSS alle cellule per 30 minuti a 37 ° C. Tossina del colera si legherà alla ganglioside GM1, note per essere preferenzialmente partizionato in lipid rafts. </li><li> Lavare le cellule due volte con HBSS (soluzione salina tampone di Hank). </li></ol> 3. FCS di acquisizione dati sulle cellule viventi <ol><li> Posizionare le cellule colorate sul palco microscopio. Assicurarsi che la temperatura e CO 2 le condizioni sono ottimali altrimenti questo può portare a manufatti in tempi di diffusione. </li><li> Ottimizzazione confocale di una cella di interesse utilizzando rilevamento interna del microscopio (Fig. 4). </li><li> Passare al punto modalità di scansione e scegliere un punto nella membrana plasmatica della cellula di interesse. Eseguire 1-2 immagini in diretta della cella per assicurarsi che la cella non è in movimento durante l'acquisizione. </li><li> Passa alla rilevazione esterna da parte della SPAD e il morbido FCSware. Monitorare il segnale di fluorescenza e assicurarsi che sia adatto alla SPAD (segnale sufficiente, ma senza saturazione, 10 000 a 50 000 conteggi / s va bene). Se necessario, modificare la posizione Z, di guadagno e / o potenza del laser per ottenere corretto segnale di fluorescenza. Se questo non è sufficiente, si può pensare di cambiare le condizioni di colorazione. </li><li> Acquisire 10 campioni di 30 misurazioni secondi. Poiché la maggior parte delle cellule sono auto-fluorescente, si può vedere una diminuzione della fluorescenza durante le prime acquisizioni, a causa di auto-fluorescenza fading. </li></ol> 4. FCS Analisi dei dati <ol><li> Impostare l'intervallo di correlazione e auto-generare le curve di correlazione con il software FCS. L'intervallo di correlazione variano tipicamente tra più breve tempo di ritardo fino al risolvibile il maggior tempo possibile (come le statistiche della misurazione diventa sempre più inadeguata quando tempo correlazione massima avvicina tempo totale di acquisizione, il tempo di ritardo massimo è limitato al 80% dei tempo di acquisizione sul Picoquant software). </li><li> Per ciascun campione, esportare file corrispondenti alle fluttuazioni di fluorescenza e di auto-correlazione in funzione del tempo. </li><li> Utilizzare un software di analisi dei dati e montaggio, come Origin Pro per importare i file. </li><li> Per ogni campione, assicurarsi che non vi è alcuna photobleaching durante l'acquisizione ovvero la fluorescenza rimane stabile durante i 30 secondi. Eliminare la visualizzazione di qualsiasi misura photobleaching in quanto può provocare artificiali tempi di diffusione più lunghi. </li><li> Verificare che la forma dei restanti curve FCS è corretta (vedi Fig. 5). Determinare la curva media FCS. </li><li> Montare la curva con il modello matematico appropriato (Fig. 2). Questa misura darà il tempo di diffusione (s) e la proporzione di molecole che diffondono con questo (ESE) tempo di diffusione (s). </li></ol> 5. Risultati rappresentativi Un esempio di calibrazione FCS con una tossina colera-Alexa488 soluzione è mostrata in figura 3 (Figura 3A), individuale e media curve FCS sono stati calcolati. Significano curve FCS sono stati dotati di corrispondenti equazioni di diversi modelli di diffusione (esempi della Figura 2). Il parametro classicamente considerata per determinare la qualità di un accoppiamento è il coefficiente di determinazione R 2. La stretta R 2 è a 1, migliore è la vestibilità. In questo caso, il modello più accurato per adattarsi alla curva media FCS è quella che descrive una popolazione di molecole fluorescenti diffondono liberamente in tre dimensioni (equazione 1 in Figura 2 e Figura 3B). Il tempo di diffusione deriva dal fit è 0,32 ms. Residui di curva-montaggio (Figura 3C) e R 2 fattore (0,99,906 mila) fornire una stima della qualità della calzata. Un esempio di analisi per la tossina colerica FCS-Alexa488 tinto HEK293 celle è mostrata in Figura 5. La forma della curva media multifasico FCS rivela l'esistenza delle popolazioni di molecole fluorescenti con tempi di diffusione diversi. La soluzione migliore per questa curva corrisponde ad un modello a tre popolazioni di sonde fluorescenti: due con una diffusione ostacolato (diffusione in due dimensioni, come nel piano di membrana) e una liberamente diffusore in tre dimensioni (equazione 2 nella figura 2 e figura 5) . Questa popolazione seconda corrisponde al molecole fluorescenti che si spostano al di fuori del piano di membrana, cioè, sia vincolante o non vincolante ai loro bersagli membrana, raggiungendo la membrana attraverso il percorso secrezione o riciclaggio, o lasciando la membrana per endocitosi. I due tempi di diffusione a livello della membrana, corrispondenti alla tossina del colera legato GM1, erano 2 ms (25% di molecole), corrispondente alla diffusione al di fuori di zattere lipidiche, e 75 ms (50% di molecole), corrispondente alla diffusione in zattere lipidiche . Si prega di notare che qualsiasi fotosbiancanteING durante l'acquisizione porterà ad artificiali più lunghi tempi di diffusione, quindi, eventualmente creando una tendenza verso la localizzazione di GM1 in domini raft lipidici. <img src="/files/ftp_upload/3513/3513fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Rappresentazione schematica del FCS set-up (foto modificata da Marquer et al. 12) <img src="/files/ftp_upload/3513/3513fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Esempio di modelli di diffusione ed equazioni corrispondenti usati per soddisfare le curve di autocorrelazione. Il parametro struttura S può essere scritta come S = 0 z / w 0 con z 0 il raggio effettivo focale lungo l'asse ottico a 1/2 e l'intensità e W0 efficace lateral raggio focale a 1/2 e intensità. Questi valori possono essere estratte da un classico spread punto funzione (PSF) misurazione. <img src="/files/ftp_upload/3513/3513fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Valutazione del tempo di diffusione della tossina del colera-Alexa488 in soluzione per la calibrazione FCS. A) fluttuazione di fluorescenza in funzione del tempo per un esempio rappresentativo di una acquisizione 30 secondi. B) indica la curva ottenuta autocorrelazione da 10 campioni di acquisizione 30 secondi munito equazione 1 (vedi figura 2). C) Residui di adattamento della curva. <img src="/files/ftp_upload/3513/3513fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. HEK-293 cellule colorate con tossina colerica-Alexa488. Le cellule sono state proietta sulla SP5 un microscopio confocale (Leica Microsystems, Wetzlar, Germania) con la linea interna laser 488nm. La fluorescenza è stata raccolta con un obiettivo apocromatico x60 piano di immersione in olio tra i 500e 650 nm. <img src="/files/ftp_upload/3513/3513fig5.jpg" alt="Figura 5" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 5"> Figura 5. Valutazione del tempo di diffusione della tossina del colera-Alexa488 alla membrana plasmatica di cellule HEK293. A) media curva autocorrelazione munito equazione 2 (vedi figura 2). B) I residui di curve fitting. (Modificato da Marquer et al. 12)

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Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

Il metodo qui presentato FCS permette una analisi sensibile e rapida la compartimentazione lipidi serie di sonde fluorescenti di interesse in cellule viventi. FCS combina l&#39;accuratezza della localizzazione della microscopia confocale con la sensibilità di conteggio di singolo fotone. La differenza principale tra FCS e tecniche standard biochimiche che è FCS permette la determinazione assoluta della partizione lipidi zattere del bersaglio e non la partizione relativo come è il caso per l&#39;isolamento DRM o co-patch...

<html><table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Comments </td></tr><tr><td> Subunità B della tossina colerica Alexa-488 </td><td> Invitrogen </td><td> C-34775 </td><td> MW (pentamero) = 57 kg / mol </td></tr><tr><td> Microscopio confocale </td><td> Leica </td><td> SP5 </td><td></td></tr><tr><td> Incubatore per temperatura e CO 2 di controllo </td><td> Vita di imaging servizi </td><td> Il cubo e il Box </td><td></td></tr><tr><td> SPAD (Single Photon Avalanche Diode) </td><td> MPD (Micro Photon Devices) </td><td> PDM serie (100 micron zona sensibile) </td><td></td></tr><tr><td> Passa alto 488 nm filtro </td><td> Semrock </td><td> 488 nm blocco bordo Brightline lungo filtro passa Part #ails.aspx? id = &quot;target =&quot; _blank FF01-488/LP-25 &quot;&gt; FF01-488/LP-25 </td><td></td></tr><tr><td> FCS unità di rivelazione </td><td> Picoquant </td><td> Picoharp 300 Modulo </td><td></td></tr><tr><td> Acquisizione e di auto-correlazione software </td><td> Picoquant </td><td> SymPhoTime </td><td></td></tr><tr><td> Software di fitting </td><td> OriginLab </td><td> OriginPro8 </td><td></td></tr></tbody></table>

determinazione del raft lipid partizionamento delle sonde fluorescenti-tag nelle cellule viventi da spettroscopia di fluorescenza di correlazione (fcs)

Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS)

Negli ultimi quindici anni l&#39;idea che le membrane cellulari non sono omogenee e si basano su microdomini di esercitare le loro funzioni è stato ampiamente accettato. Raft lipidici sono microdomini di membrana arricchiti di colesterolo e sfingolipidi. Essi giocano un ruolo nella cellulari processi fisiologici quali la segnalazione, e 1,2 il traffico, ma sono anche pensato di essere protagonisti in diverse malattie tra cui infezioni virali o batteriche e malattie neurodegenerative 3. Eppure la loro esistenza è ancora oggetto di controversia 4,5. Infatti, zattera dimensioni dei lipidi è stata stimata essere di circa 20 nm 6, ben al di sotto del limite di risoluzione della microscopia convenzionale (circa 200 nm), precludendo così la loro immagine diretta. Fino ad oggi, le principali tecniche utilizzate per valutare la partizione di proteine ​​di interesse all&#39;interno rafts lipidici sono membrane resistente ai detergenti (DRM) isolamento e co-patching con anticorpi. Anche se ampiamente utilizzati Becautilizzo della loro attuazione piuttosto facile, queste tecniche erano inclini a manufatti e quindi criticato 7,8. I miglioramenti tecnici sono pertanto necessarie per superare questi manufatti e di poter sondare lipidi partizione zattere in cellule viventi. Presentiamo qui un metodo per l&#39;analisi sensibile di partizione lipidi zattere di proteine ​​fluorescenti-etichetta o lipidi nella membrana plasmatica di cellule viventi. Questo metodo, denominato spettroscopia di fluorescenza di correlazione (FCS), si basa sulla disparità nei tempi di diffusione di sonde fluorescenti situati all&#39;interno o all&#39;esterno delle zattere lipidiche. Infatti, come evidenziato in entrambe le membrane artificiali e colture cellulari, le sonde avrebbero diffondere molto più velocemente fuori che dentro lipid rafts dense 9,10. Per determinare tempi di diffusione, minute fluttuazioni fluorescenza vengono misurati in funzione del tempo in un volume focale (circa 1 femtoliter), situato a livello della membrana plasmatica di cellule con un microscopio confocale (Fig.1). Le auto-correlazione curve possono quindi trarre da queste fluttuazioni e dotate di adeguati modelli matematici di diffusione 11. FCS può essere utilizzato per determinare la zattera lipidica partizionamento di sonde diverse, purché siano fluorescenti tag. Fluorescente etichettatura può essere ottenuto mediante l&#39;espressione di proteine ​​di fusione fluorescenti o dal legame di ligandi fluorescenti. Inoltre, FCS può essere utilizzato non solo nelle membrane artificiali e linee cellulari, ma anche in colture primarie, come descritto di recente 12. Può anche essere utilizzata per seguire la dinamica di partizionamento lipidi zattera dopo aggiunta farmaco o lipide cambiamento composizione della membrana 12.

Una tecnica per sondare il partizionamento zattera lipidi di proteine ​​fluorescenti a livello della membrana plasmatica delle cellule viventi è descritto. Si avvale della disparità nei tempi di diffusione delle proteine ​​situati all&#39;interno o all&#39;esterno delle zattere lipidiche. Acquisizione può essere eseguita dinamicamente in condizioni di controllo o dopo l&#39;aggiunta farmaco.

Determinazione del Raft Lipid partizionamento delle sonde fluorescenti-tag nelle cellule viventi da spettroscopia di fluorescenza di correlazione (FCS)

Negli ultimi quindici anni è stata ampiamente accettata l'idea che le membrane cellulari non siano omogenee e che dipendano da microdomini per esercitare le proprie funzioni.

I raft lipidici sono microdomini all'interno della membrana plasmatica che fungono da centri di organizzazione per processi cellulari come il segnale e il traffico intracellulare. Qui, la partizione dei raft lipidici nella membrana plasmatica di cellule vive viene quantificata mediante spettroscopia di correlazione della fluorescenza per esaminare la partizione del ganglioside GM1. Le cellule di mammifero vengono analizzate con le subunità B della tossina colerica marcate con Alexa 488.Le proteine fluorescenti si legano al ganglioside GM1, che si localizza preferenzialmente nei raft lipidici, mediante microscopia confocale. Vengono misurate piccole fluttuazioni della fluorescenza alla membrana plasmatica. Vengono generate curve di autocorrelazione, che vengono adattate con modelli matematici di diffusione appropriati per determinare i tempi di diffusione del fluoroforo.Dato che le sonde si diffondono molto più rapidamente all'esterno rispetto all'interno delle dense zattere lipidiche, i risultati ottenuti indicano il livello di ripartizione. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'isolamento delle membrane resistenti ai detergenti o il co-rafting con anticorpi, è che la FCS consente di determinare il modello assoluto di distribuzione del lipido bersaglio e non semplicemente quello relativo. Inoltre, può essere utilizzata sia per lipidi che per proteine, purché siano marcati fluorescentemente.Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nel campo della malattia di Alzheimer, ad esempio qual è l'importanza dei lipidi nella produzione dell'amiloide beta? Ciò porterà a scoperte importanti, come l'individuazione di nuovi inibitori che si legano specificamente ai componenti del trapianto lipidico. Iniziare questa procedura calibrando il sistema di spettroscopia di correlazione della fluorescenza o FCS.Questa configurazione FCS è composta da un microscopio confocale collegato a un'unità di rilevamento esterna dotata di un filtro di rilevamento e un fotodiodo a valanga, nonché da un sistema di conteggio di fotoni singoli con correlazione temporale. Accendere i laser del microscopio confocale, il computer per l'immagine confocale e il computer per l'acquisizione FCS. Successivamente, accendere l'incubatore e impostarlo a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.Assicurarsi che il diodo a valanga a singolo fotone (SPAD) sia acceso e che il filtro di fluorescenza all'interno del SPAD sia adeguato al campione. Verificare che il SPAD sia sincronizzato temporalmente. Una volta che le impostazioni del SPAD sono pronte per l'acquisizione, avviare il software FCS PICO quant.Preparare una soluzione fresca di tossina colerica Alexa 488 diluita in PBS a una concentrazione finale di un microgrammo per millilitro. Pipettare la soluzione su un coprivetrino. Successivamente, regolare le impostazioni Z del microscopio per individuare il piano in cui la fluorescenza è più intensa.Per passare alla modalità di scansione puntuale, fare clic sul pulsante del punto di sbiancamento, quindi fare clic sullo schermo dell'immagine per selezionare una regione di interesse puntiforme nel campione in soluzione. Utilizzando il software, impostare il tempo di esposizione superiore a cinque minuti. Questo garantisce che l'illuminazione del laser sia sufficientemente lunga da permettere le acquisizioni FCS.Quindi, utilizzando il software FCS, passare al rilevamento esterno mediante lo SPAD. Assicurarsi che il segnale fluorescente sia compreso tra 10.000 e 50.000 conteggi al secondo. L'obiettivo è ottenere un buon segnale senza alcuna saturazione.Acquisire 10 serie di misurazioni in trentaduesimi sullo stesso campo. Il tempo di acquisizione deve essere ottimizzato in base al campione, in modo da ottenere un campionamento di alta qualità senza provocare il foto-sbiancamento. Una volta acquisiti i dati del campione di ottimizzazione, questi vengono utilizzati per generare curve di autocorrelazione, dalle quali saranno determinati i tempi di diffusione delle specie fluorescenti. Primo.Utilizzando il software FCS, impostare l'intervallo di correlazione e generare una curva di autocorrelazione corrispondente alle specie fluorescenti che diffondono in soluzione. Per ogni 32° misurazione, il software analizzerà ciascun campione 32° in modo indipendente e genererà curve di autocorrelazione a partire dalle intensità di fluorescenza, utilizzando una funzione matematica classica che riporta la similarità tra osservazioni in funzione del tempo di separazione tra di esse. L'intervallo di correlazione varierà tipicamente dal tempo LAC più breve risolvibile fino al tempo più lungo possibile.Come si può vedere qui, la misurazione diventa meno accurata quando il tempo di correlazione massimo si avvicina al tempo totale di acquisizione. In questo caso, il tempo di ritardo massimo è limitato all'80% del tempo di acquisizione. Successivamente, per ogni campione, esportare i file corrispondenti alle fluttuazioni di fluorescenza e alla correlazione incrociata in funzione del tempo. Quindi importare i file in un software di analisi e fitting dei dati, come Origin Pro, per verificare che non si sia verificato alcun fotoblesamento durante l'acquisizione.Esaminare il file delle fluttuazioni della fluorescenza. La fluorescenza dovrebbe essere stabile durante i 30 secondi e dovrebbe essere rappresentata come una linea piatta. Quando le misure di fluorescenza mostrano fotodegradazione.Non utilizzare le curve FCS corrispondenti per ulteriori analisi, poiché ciò potrebbe causare tempi di diffusione artificialmente più lunghi con le curve FCS rimanenti. Determinare la curva media FCS calcolando la media dei valori di autocorrelazione per ciascun punto temporale. Infine, per adattare la curva con il modello matematico appropriato, utilizzare il modulo di fitting di Origin Pro con l'equazione appropriata.Questo adattamento fornirà il tempo di diffusione delle molecole e della soluzione. In questo caso, esiste una sola popolazione che diffonde liberamente per diffusione. Se il tempo di diffusione ottenuto è corretto, sarà di circa 0,2 millisecondi.L'allestimento è ben calibrato e può essere utilizzato per ulteriori esperimenti. Ora che l'allestimento è stato verificato per la calibrazione, il sistema può essere impiegato per misurare il frazionamento lipidico RAFs di una flora. Quattro cellule vive di interesse rimuovono le cellule HEC 2 93 dall'incubatore.Le cellule dovrebbero essere state seminate il giorno precedente su otto camere da coltura rivestite con poli-L-lisina in modo che abbiano il tempo di aderire. Utilizzare un mezzo privo di fenolo. Deve essere utilizzato un mezzo rosso per assicurare che non vi siano interferenze con il segnale di fluorescenza. Usare una pipetta per rimuovere delicatamente la maggior parte del mezzo dal pozzetto, facendo attenzione a non far asciugare le cellule.Quindi aggiungere delicatamente HBSS al pozzetto. Ripetere questo lavaggio una volta per ciascun pozzetto. Aggiungere 500 microlitri di tossina colerica diluita, Alexa 488, alle cellule per 30 minuti.A 37 gradi Celsius, la tossina colerica si legherà al ganglioside GM1, noto per essere preferenzialmente localizzato nei raft lipidici dopo l'incubazione. Lavare le cellule due volte con HBSS; a questo punto le cellule sono pronte per l'acquisizione dei dati FCS. Posizionare le cellule colorate sul palchetto del microscopio e verificare le impostazioni di temperatura e anidride carbonica.Ottimizzare l'immagine confocale di una cellula di interesse utilizzando il rilevamento interno del microscopio. Individuare una cellula con una membrana ben marcata. Passare alla modalità di scansione puntuale come in precedenza e selezionare un punto nella membrana plasmatica della cellula di interesse.Acquisire uno o due fotogrammi della cellula per assicurarsi che non si stia muovendo durante l'acquisizione. Passare al rilevamento esterno mediante lo SPAD e al software FCS come in precedenza, per garantire un segnale adeguato compreso tra 10.000 e 50.000. Modificare la posizione Z, il guadagno e/o la potenza del laser.Acquisire 10 campioni di misurazioni al 32° come nella maggior parte delle cellule sono autofluorescenti. Potrebbe verificarsi una diminuzione della fluorescenza durante le prime acquisizioni a causa dell'attenuazione dell'autofluorescenza. Analizzare le fluttuazioni della fluorescenza come in precedenza per determinare la curva media FCS.Quindi, per adattare la curva media FCS multifasica con il modello matematico appropriato, utilizzare il modulo di fitting di Origin Pro con l'equazione appropriata. Questo adattamento fornirà i tempi di diffusione e la proporzione di molecole che diffondono con questi tempi di diffusione.Questa figura mostra un esempio di calibrazione FCS con una soluzione di tossina colerica marcata con Alexa 488. Dopo aver verificato che le singole misure di fluorescenza in funzione del tempo non mostrassero alcun fotoblesamento, sono state calcolate le curve FCS singole e medie. Le curve FCS medie sono state adattate con equazioni corrispondenti a diversi modelli di diffusione.Il parametro classico considerato per determinare la qualità di un adattamento è il coefficiente di determinazione R quadro. Più R quadro è vicino a uno, migliore sarà l'adattamento; in questo caso, il modello più accurato per l'adattamento. La curva media FCS è quella che descrive una popolazione di molecole fluorescenti che diffondono liberamente in tre dimensioni.Il tempo di diffusione ottenuto dall'adattamento della curva è di 0,32 millisecondi. I residui dell'adattamento della curva e il coefficiente R quadro forniscono una stima della qualità dell'adattamento in questo caso. Il valore di R quadro è 0,99906, indicando un ottimo adattamento.Un esempio di analisi FCS per cellule HC 2 93 marcate con tossina colerica Alexa 4 88 è mostrato qui. In questo esempio, la tossina sta iniziando a essere endocitata, come dimostrato dalla presenza di piccoli punti fluorescenti intracellulari per valutare la diffusione. Tempo di permanenza della tossina colerica Alexa 4 88 sulla membrana plasmatica.I dati sono stati raccolti e analizzati come descritto in questo video. La forma della curva media FCS multifasica rivela l'esistenza di popolazioni di molecole fluorescenti con diversi tempi di diffusione. L'adattamento migliore per questa curva corrisponde a un modello con tre popolazioni di sonde fluorescenti, due delle quali con diffusione ostacolata.Diffusione in due dimensioni come nel piano della membrana, e una popolazione che diffonde liberamente in tre dimensioni. Quest'ultima popolazione corrisponde a molecole fluorescenti che si muovono al di fuori del piano della membrana. In altre parole, le molecole fluorescenti si legano o si dissociano da bersagli presenti nella membrana, raggiungendo la membrana attraverso il percorso di secrezione o di riciclo, oppure abbandonano la membrana mediante endocitosi.Sono stati osservati due tempi di diffusione sulla membrana. Il 25% delle molecole presentava velocità di diffusione di due millisecondi, corrispondenti alla diffusione al di fuori delle zattere lipidiche. Il 50% delle molecole aveva tempi di diffusione di 75 millisecondi, corrispondenti alla diffusione all'interno delle zattere lipidiche.Seguendo questa procedura, accoppiando una configurazione ottica alternativa e successivamente effettuando la rilevazione di singole molecole, è possibile operare al di sotto del limite di diffrazione, consentendo così l'accesso a un intervallo più ampio di tempi di diffusione dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dei raft lipidici per studiare la dinamica legata alle malattie del processo di partizionamento dei raft lipidici dopo modifiche alla composizione lipidica della membrana indotte da farmaci, in linee cellulari e colture primarie.

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Determinazione del Raft Lipid partizionamento delle sonde fluorescenti-tag nelle cellule viventi da spettroscopia di fluorescenza di correlazione (FCS)

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