Name: Spectral Imaging di fluorescenza confocale tag recettori nicotinici a Knock-in topi con la somministrazione cronica alla nicotina (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-10T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: Impara la quantificazione dei recettori nicotinici nel cervello di topi knock-in mediante imaging confocale spettrale dopo esposizione cronica alla nicotina. Questo metodo consente analisi ad alta risoluzione delle variazioni subcellulari.

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Antonio Renda è stata sostenuta da una Università di Victoria Graduate Fellowship Award. Questa ricerca è stata sostenuta da un scienze naturali e ingegneria Research Council of Canada Discovery Grant, uno NARSAD Young Investigator Award (per RN), una Fondazione Victoria - Myre e Winifred Sim Fund, una Fondazione canadese per l&#39;innovazione sovvenzione, un Fondo di conoscenza Columbia Britannica per lo sviluppo e scienze naturali e ingegneria Research Council del Canada strumenti di ricerca e Grant Strumentazione. Ringraziamo Jillian McKay, Christina Barnes, Ariel Sullivan, Jennifer MacDonald e Daniel Morgado per l&#39;allevamento del mouse eccellente.

1. Pompa impianto <ol><li> Prima dell'impianto della pompa, riempire e preparare le Alzet mini-pompe osmotiche (Alzet, Modello 2002, Cupertino, USA) facendo attenzione a non introdurre bolle d'aria. Questo modello di mini-osmotica pompa eroga soluzione ad una velocità di 0,5 pl / h per 14 giorni. Garantire condizioni di sterilità. Pesare pompe di vuoti e pieni. Al termine dell'esperimento (10 giorni dopo l'impianto), il liquido rimanente nel pompa può essere rimosso con una siringa e pesato per calcolare il volume pompato. </li><li> Le pompe con soluzione di controllo contengono salina (0,9% w / v, Teknova, S5819, Hollister, USA). Per preparare la soluzione di nicotina, una soluzione stock 1 M di (-)-nicotina sale tartrato acido (Sigma, cat # N5260) viene diluito in soluzione salina (0,9% w / v) e sterilizzato per filtrazione attraverso una siringa 0,22 um-end filtro. Abbiamo precedentemente somministrato nicotina a 0,4 e 2 mg / kg / hr (calcolato in base libera di nicotina) per 10 giorni. </li><li> Preparare tre bagni salina (tre10 salina centimetri riempito capsule di Petri). Una volta che la pompa è stato riempito e sigillato, lavare accuratamente la pompa di ogni bagno successive soluzione fisiologica per rimuovere eventuali tracce del farmaco sul guscio esterno. Immergere riempito pompe in soluzione salina per lo stoccaggio fino a un intervento chirurgico, mantenendo il controllo e le pompe di nicotina in contenitori separati saline. </li><li> Per favorire una ripresa sana e ridurre il rischio di infezione post-chirurgica, hanno gabbie pulite preparati a lungo termine di recupero. </li><li> Per la ripresa a breve termine subito dopo l'intervento, preparare una gabbia contenente un rilievo di riscaldamento e una lampada di calore. </li><li> Per esaminare gli effetti della nicotina cronici dobbiamo 5-6 α4YFP omozigote knock-in topi (2-3 mesi) in ciascun gruppo (di controllo o di nicotina). Il knock-in α4YFP linea di topi sono stati re-incrociata per 10 generazioni, al ceppo di topi C57BL/6J. Facciamo che l'età e il sesso di tutti i topi sono uguali per lo studio e che tutti gli interventi chirurgici vengono eseguiti nello stesso giorno per ridurre al minimo la variabilità. Per impedire HYpothermia ai topi durante e dopo l'intervento chirurgico, dotare tavolo operatorio con un tampone sterile riscaldante rivestito in telo chirurgico. </li><li> Indurre il α4YFP topo knock-in con 3 L / min di ossigeno e il 3% isoflurano e poi mantenere l'anestesia a 2,5 L / min di ossigeno e 1% isoflurano. Noi preferiamo anestesia con isoflurano causa a completamento dell'intervento isoflurano cancella il sistema rapido ed i topi sono consapevoli e mobile all'interno ~ 2 min. Applicare collirio immediatamente (tear-Gel, Novartis) per evitare danni alla cornea. </li><li> Le pompe sono impiantato per via sottocutanea attraverso un'incisione cutanea sul retro del collo e la pompa viene spinto caudalmente lungo il dorso della schiena. Pulire l'area sul retro tra le zampe anteriori con 95% di etanolo al matte la pelliccia. Pizzicare la pelle con 0,8 mm pinza Graefe (strumenti per le scienze Belle 11050-10) e fare un cm 1 taglio centrale laterale che utilizza le forbici iris (strumenti per le scienze Belle, 14060-10). </li><li> Per creare uno spazio sottocutaneo per la pompa, inserire forbice modello standards (Strumenti Scienza Arti, 14101-14), nell'incisione e spingere con la massima attenzione verso la fine caudale dell'animale. </li><li> Utilizzando 1.0 mm pinze Graefe (strumenti per le scienze Belle, 11650-10), rimuovere la pompa dal salino. Tenere le pinze aperte mediante incisione e inserire la pompa nell'incisione con il tappo pompa osmotica affacciata all'estremità caudale dell'animale e spingere la pompa al fine caudale. </li><li> Pinch ferita chiusa 0,8 mm con pinze e applicare una quantità adeguata di Vetbond (3M, cat # 1469SB) colla. Tenere premuto fino a quando ferita è sigillata. </li><li> Rimuovere l'animale dalla maschera isoflurano, iniettare con l'analgesico, meloxicam (0,1 mg / kg sc), e il luogo in un breve termine gabbia di recupero fino al cosciente e mobile. Quindi mettere in un lungo periodo di recupero con gabbia ad libitum cibo e acqua a disposizione. </li></ol> 2. α4YFP knock-in fissazione mouse perfusione intracardiaca <ol><li> Fai soluzioni un giorno prima procedura e lasciare a 4 ° C. Per minimizzare la variabilità tutti i topisaranno perfusi lo stesso giorno e con lo stesso lotto di soluzioni. </li><li> Eseguire fissazioni di perfusione in una zona ben ventilata. Linea Flush della pompa peristatic (Load Masterflex Easy, 7518-00; Masterflex Pump Controller, 60.648) con ddh 2 O. </li><li> Aggiungi ~ 0.0015g di eparina (Sigma, cat # H4784), un anticoagulante, a 20 ml di PBS pH 7,6 (Invitrogen, cat # 70011). </li><li> Anestetizzare α4YFP knock-in topo iniettando per via intramuscolare una miscela di ketamina (25 mg / kg, la salute degli animali Wyeth) e cloridrato medatomidine (0,25 mg / kg, Pfizer) nel muscolo della zampa posteriore e collocare immediatamente l'animale di nuovo nella sua gabbia di casa. </li><li> Pin animale ad un coperchio di polistirolo inserito in un vassoio di metallo. Pulire torace con il 95% di etanolo. Pinch pelle con Adson pinza (strumenti per le scienze Belle 91106-12) e tagliare aprire la cassa toracica con le forbici iris. Fissare la cassa toracica con un emostatico ultra fine (strumenti per le scienze Belle 13021-12) ed esporre il cuore. </li><li> Iniziare a pompare PBS a 4 ml / min ed iNSERIRE un ago 23G farfalla (Becton Dickinson, 367.253) nel ventricolo sinistro dell'animale. Immediatamente snip l'atrio destro per permettere al sangue e perfusato a fuggire. </li><li> Perfondere 20 ml di PBS (pH 7,6), quindi 30 ml di paraformaldeide al 4% (pH 7,6, diluito con PBS da un archivio di PFA 16%, Sciences microscopia elettronica, cat # 15.710), quindi 20 ml di 5% di saccarosio (pH 7,6) . Abbiamo scoperto che più aumenta la fissazione autofluorescenza. Perfusione con 5% di saccarosio risciacqua residua PFA dal cervello, che abbassa autofluorescenza. </li><li> Togliere il cervello e conservare nel 30% di saccarosio per 3 giorni. </li><li> Per congelare il cervello per il sezionamento coronale, tagliare il cervelletto con una lametta e il cervello svolge in uno stampo in plastica embedding (VWR, cat # 18986-1) parte rostrale e immergerlo in Compound ottobre montaggio (Tissue-Tek, cat # 4583) . Congelare in ghiaccio secco e conservare a -20 ° C prima di affettarlo. </li><li> Sezione cervelli (30 micron di spessore) su un criostato e poi il trasferimento al vetrini rivestiti. Conservare le sezioni di cervello a -20 &amp;deg; C in scatole di diapositive contenenti una pietra solfato di calcio anidro. La casella di scorrimento dovrebbe essere in un sacchetto di chiusura lampo sigillato per evitare l'umidità e la successiva masterizzazione freezer, se conservato a -20 ° C. </li></ol> 3. Imaging nAChRs fluorescenti a spettrale microscopia confocale <ol><li> Assicurarsi diapositive hanno una minima esposizione a qualsiasi fonte di luce per ridurre al minimo photobleaching. </li><li> Coprioggetti i vetrini cerebrali sezione con un mezzo di fissaggio che non inibisce la fluorescenza proteina fluorescente. Abbiamo un buon successo con Mowiol 4-88 (pH 8,5 in Tris-HCl e glicerolo, EMD-Calbiochem, cat # 475904), che indurisce dopo poche ore. Assicurarsi che il Mowiol equilibra a temperatura ambiente prima di scivolare coperchio in modo da evitare bolle d'aria. Non usare lo smalto quando si coperchio scivolare come spegnerà fluorescenza YFP. </li><li> Le immagini vengono acquisite utilizzando una Nikon C1si sistema spettrale microscopio confocale. Dettagli per il calcolo delle spettrale confocale e unmixing lineari sono provvisted altrove 13-15. Il razionale per l'utilizzo di un microscopio confocale spettrale è che il tessuto cerebrale fisso ha autofluorescenza intrinseca. Spectral confocale sul C1si Nikon utilizza un array di 32 rilevatori di tubi fotomoltiplicatori quel campione un determinato intervallo di lunghezze d'onda della luce fluorescente emessa, rifratta spazialmente nelle sue diverse lunghezze d'onda tramite un elemento dispersivo reticolo proprio come un prisma di rifrazione della luce bianca in un arcobaleno di colori 16. Che cosa è raccolto lambda è una pila di immagini - immagini raccolte in diverse lunghezze d'onda della luce in modo che uno spettro di emissione sono raccolti per ogni pixel di una pila di immagini lambda. Poiché YFP autofluorescenza e tessuti hanno ciascuno caratteristici firme spettrali, la pila lambda possono essere deconvolved utilizzando un algoritmo lineare unmixing algebrica in YFP separato e segnali autofluorescenti (Fig. 2). Così, quantificazione molto accurata di YFP fluorescenza può essere determinato anche in tessuto con livelli significativi di autofluorescence. </li><li> Le diverse impostazioni possono essere regolate per ottimizzare la qualità dell'immagine e l'efficienza di raccolta fluorescenza. Ci riporterà le impostazioni che usano di solito, ma queste impostazioni possono essere regolate a seconda del campione e il microscopio confocale. Per quantificare con precisione i cambiamenti nell'espressione subunità α4YFP con la nicotina cronica garantire che il livello di scala di grigio di intensità dei segnali di tutti i pixel sono al di sotto del valore di saturazione (&lt;4.095 per 12 bit scala di grigio). Inoltre, per accogliere potenziale aumento del segnale a causa della sovra-regolazione del recettore regolando le impostazioni confocale in modo che i pixel sono circa un terzo del valore di saturazione (~ 1300-1400) o meno. Una volta che le impostazioni sono ottimizzate, le impostazioni vengono mantenute identiche per tutte le sessioni di imaging e di campioni. </li><li> Usiamo le seguenti impostazioni per l'imaging α4YFP utilizzando un olio di 60X CFI Plan Apo VC obiettivo (NA 1,40, 0,13 mm di distanza lavoro): 488 nm laser linea al 15% di trasmissione massima di 40 mW Argon laser, Guadagno rivelatore spettrale a 220, gamma spettrale ripreso da 496,5 a 656,5 nm nm a 5 risoluzione nm, 512 x 512 pixel su un um x 50 um zona 50, una dimensione media foro (60 diam um), un pixel 4,08 tempo di sosta, media di oltre due scansioni e 12 bit di scala di grigi. </li></ol> 4. Unmixing lineare di immagini spettrali confocale e analisi di immagine <ol><li> Per eseguire lineare unmixing spettrale su un'immagine campione prelevato con un microscopio confocale spettrale, si deve prima acquisire uno spettro di riferimento per YFP e uno spettro di riferimento per autofluorescenza dei tessuti. </li><li> Un requisito importante per qualsiasi spettro di riferimento è quello di ottenere un segnale alto a spettro del rumore di fluorescenza ripreso con la linea laser stessa utilizzata per l'imaging dei campioni. Sebbene la linea laser 514 nm di Argon ha una maggiore efficienza di eccitazione per eccitare YFP preferiamo YFP immagine con la linea 488 nm del laser perché vi è una migliore separazione dal picco di emissione della YFP e la linea 488 nm è meno likely di falsare la vetta e si può ottenere l'intero spettro di emissione YFP tra cui l'ascesa al picco. Abbiamo YFP immagine solubile transfettato in una linea cellulare in modo che un segnale YFP forte e si ottiene lo spettro YFP risultante viene memorizzato nella nostra libreria di spettri di riferimento. Α4YFP trasfettate sopra espressa in linee cellulari possono anche essere utilizzati in quanto fornirà un segnale alto alla spettro di fondo. </li><li> Per ottenere uno spettro di riferimento di autofluorescenza ci autofluorescenza immagine da una sezione di tipo selvatico cervello di topo dalle varie regioni del cervello che abbiamo intenzione di immagine dal mouse α4YFP e ottenere la loro spettri corrispondente. Usiamo la stessa linea laser, 488 nm, e l'immagine con parametri quasi identici, anche se possono alterare il guadagno del rivelatore, l'intensità del laser o eseguire l'imaging media per massimizzare il segnale al rumore. </li><li> Dopo aver ottenuto una immagine confocale spettrale da una regione del cervello di topo α4YFP, l'immagine viene poi deconvolved nella sua YFP e autofluorsegnali escence applicando un algoritmo lineare unmixing spettrale utilizzando lo spettro di riferimento della YFP e lo spettro di riferimento di autofluorescenza del mouse tipo selvatico della stessa regione cerebrale. </li><li> L'immagine α4YFP miscelato può poi essere aperto in un software di analisi di immagine come ImageJ ( <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> ) e quindi l'intensità media dei pixel viene calcolato per la regione di interesse. Un plugin per ImageJ chiamato "loci_tools.jar" ( <a href="http://www.loci.wisc.edu/bio-formats/imagej" target="_blank">http://www.loci.wisc.edu/bio-formats/imagej</a> ) può essere utilizzato per importare Nikon ics / ids file confocale. </li><li> Si ripete la stessa unmixing lineare spettrale e analisi di tipo selvatico topi nella stessa regione cerebrale per ottenere un valore residuo di fondo. </li><li> Poi, si ottiene la corretta intensità α4YFP media sottraendo il valore residuo di fondo (4.6) dal valore medio non corretta α4YFP (4.5). </li></ol> 5. Risultati rappresentativi Abbiamo mostra una proiezione rappresentante vero colore di una pila lambda di immagini del habenula mediale da un topo omozigote α4YFP (Fig. 3A) preso con un microscopio confocale spettrale. Abbiamo inoltre mostra lo spettro di emissione da una regione di interesse contenente α4YFP neuroni positivi dalla stessa immagine pila lambda (fig. 3B). Un picco di emissione distinta è evidente a ~ 527 nm, che è il picco di emissione di fluorescenza di YFP. La regione confinante con lo habenula mediale presenta uno spettro di emissione manca un picco spettrale a 527 nm, che indica l'assenza di α4YFP subunità nAChR. Dopo lineare unmixing spettrale utilizzando spettri di riferimento YFP e cervello autofluoresence topo con sovrapposizione significative di emissione (Fig. 4), la separazione dei segnali e YFP autofluorescente è possibile cedimento un'immagine α4YFP mescolate, un'immagine autofluorescente mescolate e un canale resto. La localizzazione di chiara influenza α4YFPorescence può essere identificato nel soma fitto del menisco mediale habenula (Fig. 4). Nel α4YFP ippocampo è localizzato principalmente nel percorso perforante mediale, la temporo-ammonico percorso e il alveus 12. Questi sono tutti innervazione glutamatergica dell'ippocampo. Abbiamo esaminato gli effetti della nicotina cronica sull'espressione α4YFP nel percorso perforante ippocampale (Fig. 5). La somministrazione cronica di nicotina (2 mg / kg / ora per 10 giorni) ha determinato un aumento significativo (69 ± 14%) in α4YFP fluorescenza da topi di controllo trattati con soluzione salina per topi alla nicotina cronici trattati (p = 0,001, test di Wilcoxon rank sum) ( Fig. 5). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3516/3516fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Diagramma di flusso che mostra procedura per l'immagine cambia in subunità nAChR α4YFP con nicotina cronica. Mini-osmotici pompe sono riempita di soluzione fisiologica o nicotina e impiantato per via sottocutanea in &amp; alpha; 4YFP topi omozigoti. Dopo 10 giorni i topi sono perfusi e fissate con paraformaldeide al 4% e il cervello del mouse sono sezionate (30 micron di spessore) su vetrini. La sezione di cervello è ripreso su un microscopio confocale spettrale (Nikon C1si) e spettralmente puro nella YFP immagini e autofluorescente. Poi le immagini vengono analizzate α4YFP ulteriormente con il software ImageJ. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3516/3516fig2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Un diagramma schematico di una pila lambda ripreso da un microscopio confocale spettrale e linearmente puro nella sue componenti spettrali. (A) Una pila lambda di immagini viene raccolta. (B) Una pila lambda consiste di immagini raccolte a differenti lunghezze d'onda in modo che uno spettro di emissione viene raccolto per ciascun pixel attraverso l'intera pila. (C) Poiché YFP e autofluorescenza dei tessuti hanno ciascuno caratteristiche firme spettrali, lo stack lambda può essere deconvolved utilizzando un algoritmo lineare unmixing algebrica in sYFP eparate e segnali autofluorescenti. Così, quantificazione molto accurata di YFP fluorescenza può essere determinato anche in tessuto con elevati livelli di autofluorescenza. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3516/3516fig3.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Confocale spettrale immagine di una regione del cervello che esprime nAChRs α4YFP. (A) A proiezione vero colore di una pila lambda di immagini del habenula mediale da un mouse α4YFP presa con un microscopio Nikon C1si spettrale confocale. (B) Piazzole di spettri di una regione di interesse, che comprende i neuroni contenenti α4YFP (verde), ed una regione di interesse al di fuori del habenula mediale (rosso). <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3516/3516fig4.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Lineare unmixing spettrale del habenula mediale. (A) Immagini di α4YFP non miscelati e (B) a seguito di autofluorescenza unmixing lineare spettrale. (C) spettri di riferimento YFP (verde triangoli) e autofluorescenza (cerchi gialli) utilizzato per unmixing spettrale. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3516/3516fig5.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 5"> Figura 5. Upregulation di a4 nAChRs nell'ippocampo di α4YFP knock-in topi esposti alla nicotina cronica. (A) Un montaggio di piastrelle α4YFP fluorescenza dall'ippocampo. Le due aree di selezione sono tratteggiate le posizioni approssimative sulla parte inferiore del percorso perforante dell'ippocampo in cui sono state eseguite analisi per ciascun topo. (B) α4YFP fluorescenza è stata significativamente maggiore nel percorso perforante di topi esposti alla nicotina cronica della soluzione salina cronica (*, p = 0,001, test di Wilcoxon rank sum). I risultati rappresentano la media ± SEM di n = 20 misure per topi alla nicotina sia saline e cronica trattati (5 topi per ogni gruppo di trattamento). <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/3516/3516fig6.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 6"> Figura 6. Meglio despressione di epth α4YFP rispetto all'etichettatura degli anticorpi. XZ viste ortogonali di α4YFP fluorescenza (A) e VGlut2 anticorpo con Cy5 come etichetta secondaria (B). (C) grafici che mostrano una maggiore intensità del segnale di fluorescenza degradazione della profondità di colorazione anticorpale (quadrati neri) rispetto al α4YFP (cerchi vuoti).

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</ol>

Non abbiamo nulla da rivelare.

<p class="jove_content"&gt; L&#39;uso di un recettore fluorescente in un knock-in modello di topo per determinare la quantità e la localizzazione di un canale ionico specifico fornisce un certo numero di vantaggi. In contrasto con proteine ​​come actina, che è ubiquitariamente espresso in tutte le cellule, canali ionici sono presenti in numero molto inferiore e la loro espressione varia tra sottotipi neuronali rendendo accurata analisi mediante tradizionali tecniche immunoistochimiche impegnativi. Il prodotto genico α4YFP è espressa a livelli W...

<table border="1"><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Comments </td></tr><tr><td> mini-pompe osmotiche </td><td> Alzet </td><td> modello 2002 </td><td></td></tr><tr><td> salino </td><td> Teknova </td><td> S5819 </td><td></td></tr><tr><td> (-)-Nicotina idrogeno sale tartrato </td><td> Sigma </td><td> N5260 </td><td></td></tr><tr><td> colliri </td><td> Novartis </td><td> Tear-Gel </td><td></td></tr><tr><td> Vetbond colla </td><td> 3M </td><td> 1469SB </td><td></td></tr><tr><td> sale di sodio eparina </td><td> Sigma </td><td> H4784 </td><td></td></tr><tr><td> 10x PBS </td><td> Invitrogen </td><td> 70011 </td><td></td></tr><tr><td> ketamina </td><td> Wyeth Animal Health </td><td> 0856-4403-01 </td><td></td></tr><tr><td> medatomidine cloridrato </td><td> Pfizer </td><td> 1950673 </td><td></td></tr><tr><td> 23G farfalla ago </td><td> Becton Dickinson </td><td> 367253 </td><td></td></tr><tr><td> paraformaldeide </td><td> Scienze della microscopia elettronica </td><td> 15710 </td><td></td></tr><tr><td> embedding stampi in plastica </td><td> VWR </td><td> 18986-1 </td><td></td></tr><tr><td> Ottobre Compound di montaggio </td><td> Tissue-Tek </td><td> 4583 </td><td></td></tr><tr><td> Mowiol 4-88 </td><td> EMD-Calbiochem </td><td> 475904 </td><td> pH 8,5 </td></tr></table>

spectral imaging di fluorescenza confocale tag recettori nicotinici a knock-in topi con la somministrazione cronica alla nicotina

Spectral Confocal Imaging of Fluorescently tagged Nicotinic Receptors in Knock-in Mice with Chronic Nicotine Administration

Ligand-canali ionici nel sistema nervoso centrale (CNS) sono coinvolti in numerose condizioni con gravi conseguenze mediche e sociali. Per esempio, la dipendenza da nicotina tramite il fumo di tabacco è la principale causa di morte prematura in tutto il mondo (World Health Organization) ed è probabilmente causato da un&#39;alterazione della distribuzione dei canali ionici nel cervello 1. L&#39;esposizione cronica alla nicotina sia nei roditori e nell&#39;uomo i risultati in aumento del numero di recettori nicotinici dell&#39;acetilcolina (nAChR) nei tessuti cerebrali 1-3. Allo stesso modo, alterazioni nei glutamatergici GluN1 o GluA1 canali sono stati implicati nello scatenare sensibilizzazione ad altre sostanze stupefacenti come la cocaina, anfetamine e oppiacei 4-6. Di conseguenza, la capacità di mappare e quantificare i modelli di distribuzione e di espressione di specifici canali ionici è di fondamentale importanza per comprendere i meccanismi della dipendenza. Lo studio del cervello specifica di un&#39;area efGli effetti di singoli farmaci è stata avanzata con l&#39;avvento di tecniche come ligandi radioattivi. Tuttavia, la bassa risoluzione spaziale di legame ligando radioattivo impedisce la possibilità di quantificare ligando canali ionici in specifici sottotipi di neuroni. Geneticamente codificati reporter fluorescenti, come ad esempio la proteina fluorescente verde (GFP) e le sue molte varianti di colore, hanno rivoluzionato il campo della biologia 7. Con tagging geneticamente un reporter fluorescente ad una proteina endogena è possibile visualizzare le proteine ​​in vivo 7-10. Un vantaggio di proteine ​​fluorescenti etichettatura con una sonda è l&#39;eliminazione dell&#39;uso di anticorpo, che hanno il problema della aspecificità e accessibilità alla proteina bersaglio. Abbiamo usato questa strategia per fluorescente nAChRs etichette, che hanno permesso lo studio di montaggio del recettore con Förster Resonance Energy Transfer (FRET) trasfettate in cellule in coltura 11. Più recentemente, abbiamo usato il Knock-in approccio alla topi ingegnere con giallo proteina fluorescente con tag a4 subunità nAChR (α4YFP), che consente una precisa quantificazione del recettore ex vivo a risoluzione submicrometer nei neuroni del SNC attraverso la microscopia confocale spettrale 12. Il mirata fluorescente knock-in mutazione è incorporato nel locus endogeno e sotto il controllo del suo promotore nativo, producendo normali livelli di espressione e regolazione del recettore rispetto ai recettori untagged nei topi di tipo selvatico. Il knock-in approccio può essere esteso per codificare fluorescente altri canali ionici e offre un approccio efficace di visualizzazione e quantificare i recettori nel SNC. In questo articolo descriviamo una metodologia per quantificare i cambiamenti nell&#39;espressione nAChR in specifici neuroni del sistema nervoso centrale dopo l&#39;esposizione cronica alla nicotina. I nostri metodi includono mini-pompa osmotica l&#39;impianto, la fissazione perfusione intracardiaca, imaging e analisi di fluorescenza tagged rec nicotinicosubunità eptor da α4YFP topi knock-in (Fig. 1). Abbiamo ottimizzato la tecnica di fissazione per minimizzare autofluorescenza da tissue.We cervello fisso descrivere in dettaglio la metodologia di immagini utilizzando un microscopio confocale spettrale in combinazione con un algoritmo lineare unmixing spettrale per sottrarre il segnale autofluoresent per ottenere con precisione α4YFP segnale di fluorescenza. Infine, mostrare i risultati di nicotina cronica indotta upregulation dei recettori α4YFP nel percorso perforante mediale dell&#39;ippocampo.

Abbiamo sviluppato una nuova tecnica di quantificazione dei recettori nicotinici dell&#39;acetilcolina cambiamenti all&#39;interno delle regioni subcellulari di sottotipi specifici di neuroni del sistema nervoso centrale per comprendere meglio i meccanismi della dipendenza da nicotina utilizzando una combinazione di approcci tra tagging proteina fluorescente del recettore con il knock-in approccio e spettrale confocale.

Spectral Imaging di fluorescenza confocale tag recettori nicotinici a Knock-in topi con la somministrazione cronica alla nicotina

I canali ionici ligando-dipendenti nel sistema nervoso centrale (SNC) sono implicati in numerose condizioni con gravi conseguenze mediche e sociali. Per...

L'obiettivo generale di questa procedura è quantificare le variazioni nei recettori nicotinici marcati con fluorescenza nel cervello di topo in seguito a un'applicazione cronica di nicotina. Questo viene ottenuto innanzitutto impiantando pompe osmotiche miniaturizzate contenenti soluzione salina o nicotina in topi knockin per alpha4-YFP. Dopo il trattamento, i topi vengono fissati per via intracardiaca e i cervelli sono sottoposti a sezione criostatica.Successivamente, i cervelli con coprivetrino vengono analizzati mediante microscopia spettrale e focale. L'ultimo passaggio della procedura consiste nell'analisi lineare spettrale del mescolamento e dei livelli di espressione di alpha four YFP. In definitiva, i risultati dimostrano la capacità della microscopia confocale spettrale e dell'analisi lineare del mescolamento di quantificare con precisione l'upregolazione delle subunità recettoriali nicotiniche alfa four YFP del recettore della colina a risoluzione submicrometrica nei neuroni cerebrali del topo esposti a nicotina cronica.Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come il legame di anticorpi o di radioleganti, è che la Y FPS è codificata geneticamente per essere associata al recettore, consentendo così un'immagine diretta e più precisa del recettore marcato. Ciò facilita l'acquisizione di immagini subcellulari ad alta risoluzione della localizzazione del recettore nei neuroni del sistema nervoso centrale ed elimina ogni potenziale problema relativo alla specificità della sonda, alla colorazione non uniforme o all'accesso della sonda agli antigeni negli strati profondi del tessuto.Il procedimento sarà dimostrato da Anthony Rda, uno studente laureato del mio laboratorio. Dopo aver rimosso il cervello fissato mediante perfusione intracardiale, tagliare il cervelletto con una lametta. Posizionare una piccola goccia di composto di montaggio sul fondo dello stampo, sotto il cervello, e collocare il cervello in uno stampo di inclusione in plastica con la parte rostrale rivolta verso l'alto. Successivamente, posizionare lo stampo nell'anidride carbonica solida.Una volta che il cervello è congelato nella corretta orientazione, riempire il resto dello stampo con composto di montaggio. Successivamente, utilizzare un criostato per raccogliere sezioni cerebrali spesse 30 micron. Trasferire le sezioni su vetrini rivestiti usando due pennelli fini.Ricordare di proteggere le sezioni cerebrali dalla luce coprendole sempre con il coperchio del vassoio per vetrini. Conservare le sezioni cerebrali in scatole per vetrini contenenti un cubetto di solfato di calcio anidro. La scatola per vetrini deve essere posta in un sacchetto sigillato Ziploc per evitare l'umidità e conseguenti danni da congelamento quando conservata a meno 20 gradi Celsius.Assicurarsi che i vetrini abbiano un'esposizione minima a qualsiasi fonte luminosa per ridurre al minimo lo sbiancamento fotoindotto prima dell'acquisizione delle immagini. Mantenendoli coperti con il coperchio del vassoio per vetrini, è possibile tagliare la punta della pipetta per ridurre la formazione di bolle durante l'applicazione del coprioggetto. Utilizzare un mezzo di montaggio che non inibisca la fluorescenza delle proteine fluorescenti, come MO Wild 4 88.Assicurarsi che il mezzo raggiunga la temperatura ambiente prima di applicare il coprioggetto. Per evitare bolle d'aria, applicare il coprioggetto una diapositiva alla volta. Non utilizzare smalto per unghie durante l'applicazione del coprioggetto, poiché potrebbe causare quenching.Fluorescenza di YFP. Acquisire immagini di regioni cerebrali utilizzando un sistema microscopico confocale spettrale, che consente una quantificazione molto accurata della fluorescenza di YFP anche in tessuti con livelli significativi di autofluorescenza. Per eseguire la separazione spettrale lineare su un'immagine campione acquisita con un microscopio confocale spettrale, è necessario innanzitutto ottenere spettri di riferimento sia per YFP sia per l'autofluorescenza del tessuto.Per prima cosa, ottenere uno spettro di riferimento fluorescente con un elevato rapporto segnale/rumore mediante l'immagine di una linea cellulare transfettata con YFP solubile, utilizzando la linea laser a 488 nanometri. Successivamente, utilizzando la stessa linea laser, ottenere uno spettro di riferimento della autofluorescenza nella regione cerebrale desiderata da una sezione di cervello di topo di tipo selvaggio. Dopo aver acquisito un'immagine confocale spettrale da una regione cerebrale del topo alpha four YFP, separare l'immagine nei segnali di YFP e di autofluorescenza applicando un algoritmo di separazione spettrale lineare che utilizzi gli spettri di riferimento sia di YFP sia dell'autofluorescenza del topo di tipo selvaggio provenienti dalla stessa regione cerebrale.Aprire l'immagine non miscelata di alpha quattro YFP in un software di analisi delle immagini come ImageJ, quindi calcolare l'intensità media dei pixel per la regione di interesse. Ripetere la stessa analisi spettrale e miscelazione lineare su un'immagine spettrale e focale proveniente dalla stessa regione cerebrale in una sezione di cervello di topo wild type per ottenere un valore residuo di fondo. Ora l'intensità corretta di alpha quattro YFP può essere ottenuta sottraendo il valore medio residuo di fondo, calcolato come media su tre-cinque topi wild type, dal valore non corretto di alpha quattro YFP mostrato qui è una proiezione a colori reali di uno stack Lambda di immagini della regione mediale dell'ULA da un topo alpha quattro YFP, acquisita con un microscopio confocale spettrale Nikon C1si. Di seguito sono riportati grafici degli spettri di una regione di interesse, che include neuroni contenenti alpha quattro YFP in verde con un picco distintivo di YFP a 527 nanometri, e una regione di interesse al di fuori della regione mediale dell'ULA in rosso, priva del picco di YFP. La separazione dei segnali di YFP e autofluorescenza è possibile mediante l'analisi spettrale lineare non miscelata, utilizzando gli spettri di riferimento di YFP e autofluorescenza cerebrale wild type, ottenendo un'immagine non miscelata di alpha quattro YFP e un'immagine non miscelata autofluorescente. Sono mostrati qui sotto i grafici degli spettri di riferimento di YFP e autofluorescenza, significativamente sovrapposti, utilizzati per la separazione, rispettivamente in verde e giallo. Mediante microscopia confocale spettrale, l'upregolazione dei recettori nicotinici di acetilcolina alpha quattro nell'ippocampo di topi knockin alpha quattro YFP esposti a nicotina cronica può essere osservata qui in un mosaico di immagini della fluorescenza di alpha quattro YFP provenienti dall'ippocampo.Le due aree di selezione corrispondono alle posizioni approssimative sul braccio inferiore del perent path in cui sono state effettuate le analisi per ogni topo. La fluorescenza di alfa quattro YFP era significativamente più elevata nel perent path dei topi esposti a nicotina cronica rispetto a quelli trattati con soluzione salina cronica. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una chiara comprensione di come ottenere immagini delle variazioni dei recettori nicotinici alfa quattro YFP nei cervelli di topi knock-in in seguito a somministrazione cronica di nicotina, conoscendo i passaggi necessari per fissare e criosezionare il cervello del topo e per acquisire immagini mediante microscopia confocale spettrale, nonché per elaborare immagini spettralmente lineari e combinate a partire dalle sezioni cerebrali.Questi concetti di base possono essere applicati ed estesi anche allo studio dell'espressione di altri canali ionici e recettori.

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Questo video dimostra come l'attivazione mediata dalla nicotina dei recettori nicotinici dell'acetilcolina nell'ippocampo ventrale del topo si traduca in una segnalazione sostenuta del calcio lungo gli assoni.

Imaging della segnalazione del calcio indotta dalla nicotina lungo gli assoni dell'ippocampo ventrale in co-colture sinaptiche

Fonte: Heredia, D. J., et. Al. Imaging ex vivo della segnalazione del calcio cellulo-specifica alla sinapsi tripartita del diaframma del topo. J. Vis. Exp. (2018) Questo video mostra l'imaging a fluorescenza della dinamica del calcio alle giunzioni neuromuscolari (NMJ) in un topo transgenico che esprime indicatori di calcio geneticamente codificati. Un NJM è identificato da recettori dell'acetilcolina marcati in fluorescenza nel diaframma con il nervo frenico. Uno splitter di immagini viene...

Imaging a fluorescenza della dinamica del calcio nelle giunzioni neuromuscolari nel diaframma di un topo transgenico

In questo articolo, si descrive un metodo utile per lo studio ligando funzione di canale ionico in neuroni di fettine di cervello acuto isolato. Questo metodo comporta l'uso di un farmaco-riempita micropipetta per applicazione locale di farmaci per neuroni registrati utilizzando tecniche standard di patch clamp.

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Abbiamo sviluppato una preparazione gene-chimerica del circuito ventrale ippocampale – accumbens in vitro che consente l'imaging diretto dal vivo per analizzare i meccanismi presinaptici della trasmissione sinaptica mediata dai recettori nicotinici dell'acetilcolina (nAChR). Questa preparazione fornisce anche un approccio informativo per studiare i meccanismi pre- e post-sinaptici della plasticità sinaptica.

Immagini dal vivo di nicotina indotta segnalazione Calcio e neurotrasmettitori uscita Lungo ventrali Hippocampal assoni

Questo articolo presenta un metodo per lo studio dei recettori nicotinici per l'acetilcolina (nAChR) nelle fette del cervello del mouse di nicotina uncaging. Quando accoppiato con simultanea patch clamp registrazione e microscopia a scansione laser di 2 fotoni, nicotina uncaging collega la funzione del recettore nicotinico con morfologia cellulare, fornendo una più profonda comprensione della neurobiologia colinergico.

Funzione del recettore nicotinico dell'acetilcolina in fettine di cervello del Mouse tramite Laser fotolisi di nicotina fuse di sondaggio

Questo protocollo descrive un metodo per l'analisi morfometrica delle giunzioni neuromuscolari mediante microscopia combinata confocale e STED che viene utilizzata per quantificare i cambiamenti patologici in modelli murini di SMA e CMS correlati a ColQ.

Caratterizzazione delle giunzioni neuromuscolari nei topi mediante microscopia combinata confocale e super-risoluzione

Questo protocollo descrive l'espressione e la quantificazione delle sottounità dei recettori neuronali dell'acetilcolina nicotinica utilizzando la linea cellulare Neuro-2a dei mammiferi. I tag fluorescenti sensibili al pH e la microscopia confocale permettono una valutazione precisa della localizzazione dei recettori nella membrana plasmatica rispetto a quelli espressi nei compartimenti intracellulari a pH neutro, facilitando lo studio del traffico e della modulazione farmacologica della nAChR.

Localizzazione della membrana plasmatica e dei recettori intracellulari dell'acetilcolina nicotinica tramite imaging quantitativo nelle cellule di mammiferi

In questo protocollo, che aggiorniamo i recenti progressi nel campo dell'imaging...

Calcio Risposte imaging in neuroni GFP-tagged fette di cervello di topo ipotalamici

Qui si descrive un adattamento dei protocolli usati per indurre plasticità omeostatica nei neuroni per lo studio della plasticità dei recettori accoppiati a proteina G astrociti. Utilizzati di recente per esaminare i cambiamenti nel gruppo astrociti I mGluRs nei topi giovani, il metodo può essere applicato per misurare il ridimensionamento di diversi GPCR astrocitiche, in tessuto dai topi adulti in situ e in vivo, e di ottenere un migliore apprezzamento della sensibilità dei recettori...

Indurre Plasticità di astrociti recettori per manipolazione del neuronali di cottura Prezzi

Durante lo sviluppo postnatale del cervelletto, le cellule granulari immature originate dalla zona germinale mostrano modalità distinte di migrazione per raggiungere la loro destinazione finale e per stabilire reti neuronali. Questo protocollo descrive la preparazione di fette cerebellari e l'approccio macroscopico confocale utilizzato per studiare i fattori che regolano la migrazione neuronale.

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Impara la quantificazione dei recettori nicotinici nel cervello di topi knock-in mediante imaging confocale spettrale dopo esposizione cronica alla nicotina. Questo metodo consente analisi ad alta risoluzione delle variazioni subcellulari.

Spectral Imaging di fluorescenza confocale tag recettori nicotinici a Knock-in topi con la somministrazione cronica alla nicotina (Video) | JoVE Journal

Spectral Imaging di fluorescenza confocale tag recettori nicotinici a Knock-in topi con la somministrazione cronica alla nicotina

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