Adesione saggio di frequenza per In Situ Analisi cinetica delle interazioni molecolari incrociati giunzionale alla cellula-cellula di interfaccia

L'obiettivo generale del seguente esperimento è misurare la cinetica dell'interazione tra recettore e ligando quando entrambe le molecole sono ancorate sulle superfici delle cellule che interagiscono. Questo viene ottenuto innanzitutto funzionalizzando i globuli rossi, che fungono da sensori di adesione, con ligandi e preparando cellule portatrici di recettori. Come secondo passaggio, si assembla la camera della micropipetta e si eseguono test di adesione per registrare gli eventi di adesione.

Successivamente, viene tracciata la curva della probabilità di adesione in funzione del tempo di contatto tra le cellule e adattata al modello. Per stimare i parametri cinetici, si ottengono risultati che mostrano l'affinità efficace di legame in due dimensioni e la velocità di dissociazione stimata dai dati. Da dove deriva allora l'idea di questo saggio?

Le persone studiano l'interazione tra recettori e leganti. Solitamente si misurano le forze di rottura e noi stiamo facendo la stessa cosa, ma un giorno ci siamo chiesti se potessimo semplicemente misurare l'esito binario: zero per assenza di adesione e uno per adesione, e derivare da queste misurazioni binarie i dati cinetici per dimostrare il saggio della frequenza micro-pipetta. La dottoressa Veronica Zana Zina, scienziata ricercatrice del mio laboratorio, vi mostrerà l'esperimento.

Le cellule rosse del sangue isolate dal sangue intero vengono biotinilate per il saggio di frequenza di adesione. Per iniziare questa procedura, centrifugare il tubo contenente le cellule rosse isolate, aliquotare 10 microlitri di pellet di globuli rossi in ciascuno di diversi vial e aggiungere la corrispondente quantità di PBS a ciascun vial per preparare diverse concentrazioni di biotinilazione delle cellule rosse. Successivamente, aggiungere 10 microlitri di tampone bore otto 0,1 molare a ciascun vial.

Quindi aggiungere una quantità calcolata di soluzione di biotina in ogni provetta e vortexare immediatamente. Per alcuni secondi, inserire ogni provetta con globuli rossi in un tubo conico da 50 millilitri e incubare su un agitatore rotante per 30 minuti a temperatura ambiente; dopo 30 minuti, aggiungere il buffer EAS 45 in ogni provetta e centrifugare per due minuti a 2000 giri al minuto. Ripetere il lavaggio con il buffer EAS 45 due volte, per un totale di tre lavaggi.

Infine, aggiungere 100 microlitri di tampone EAS 45 in ogni provetta e conservare a quattro gradi Celsius per funzionalizzare i ligandi sulla superficie dei globuli rossi. Dopo il passaggio precedente, i globuli rossi vengono incubati con una concentrazione satura di strep TTR per 30 minuti a quattro gradi Celsius e lavati tre volte con tampone EAS 45 per due minuti a 2000 rotazioni al minuto. Successivamente, incubare direttamente i globuli rossi con il ligando biotinilato oppure incubare i globuli rossi con l'anticorpo di cattura biotinilato corrispondente, seguito da un'incubazione con i ligandi. Il protocollo mostrato in questo video utilizza l'anticorpo di cattura biotinilato.

I micropipetti vengono realizzati utilizzando tubi capillari di vetro borosilicato con punto di fusione elevato. Utilizzare innanzitutto un estrattore di micropipette per tirare i tubi capillari. Successivamente, utilizzare un micromanipolatore con microfornace per tagliare la punta della micropipetta fino ad ottenere un'apertura della dimensione desiderata.

Il diametro richiesto varia solitamente da uno a cinque micron a seconda delle dimensioni delle cellule da utilizzare nello studio. Per preparare la camera per cellule, utilizzare due pezzi di vetrini per microscopio tagliati alla dimensione desiderata, rimuovere la polvere dai vetrini con una bomboletta d'aria, aggiungere il mezzo nella camera per cellule e sigillare la camera con olio minerale da entrambi i lati per evitare l'evaporazione del mezzo. Ciò modificherebbe l'osmolarità durante l'esperimento.

Il sistema di micropipette utilizzato in questo saggio è composto da tre sottosistemi: un sottosistema di imaging per osservare, registrare e analizzare i movimenti della cellula aspirata nella micropipetta, un sottosistema di micromanipolazione per consentire la selezione delle cellule dalla camera per cellule e un sottosistema di pressione per aspirare le cellule all'interno delle micropipette. Il componente principale del sottosistema di imaging è un microscopio invertito dotato di un obiettivo ad immersione in olio con ingrandimento 100 volte. Le immagini degli obiettivi vengono rilevate da una telecamera a dispositivo a accoppiamento di carica e inviate a un registratore video.

Un timer video è collegato al sistema per tenere traccia del tempo. Dopo aver riempito la micropipetta con acqua deionizzata, posizionarla nel suo supporto su un attuatore meccanico montato sul microscopio. La micropipetta può essere posizionata con precisione mediante un micromanipolatore idraulico a tre assi.

Uno dei supporti per micropipette è montato su un traduttore piezoelettrico programmato tramite computer. Ciò consente di muovere la pipetta in modo preciso e all'interno di un ciclo di prova di adesione. Il sottosistema di regolazione della pressione viene utilizzato per controllare l'aspirazione.

Durante l'esperimento, una linea idraulica collega il supporto della micropipetta a un serbatoio di fluido. Un posizionatore meccanico fine permette di manipolare con precisione l'altezza del serbatoio. Dopo aver assemblato la camera, si posizionano le micropipette, si iniettano le cellule nella camera per iniziare il saggio, si aspirano le cellule in interazione mediante le rispettive pipette e si utilizza il traslatore elettrico PSO per muovere il globulo rosso a contatto e fuori contatto con il neutrofilo, controllandone l'area di contatto e la durata.

Un evento di adesione viene osservato quando il globulo rosso si allunga durante la separazione cellulare; un evento di assenza di adesione corrisponde all'assenza di allungamento del globulo rosso. Registrare gli eventi di adesione osservati aggiungendo uno per l'adesione o zero per l'assenza di adesione in una colonna di un foglio di calcolo Excel.

Registrare la curva della frequenza di adesione in funzione del tempo di contatto utilizzando almeno tre coppie diverse di cellule per ogni tempo di contatto. Per ottenere una media e un errore standard della media (SEM) come controllo, registrare la curva di legame non specifico utilizzando globuli rossi rivestiti con ligandi pertinenti e/o bloccando i ligandi o i recettori mediante specifici inibitori funzionali. Gli anticorpi monoclonali consentono di calcolare la frequenza specifica di adesione in ciascun punto di tempo di contatto sottraendo la frequenza di adesione non specifica.

I dati della frequenza specifica di adesione in funzione del tempo di contatto vengono adattati mediante un modello probabilistico che descrive un'interazione in un singolo passo, con ordine secondario diretto e ordine primario inverso, tra una singola specie di recettori e una singola specie di ligandi. In questa equazione, KA è l'affinità 2D. KA è la velocità di dissociazione 2D.

MR e ML sono rispettivamente le densità del recettore e del ligando e AC è l'area di contatto. L'adattamento della curva presenta due parametri, ac, k, a e K off, poiché AC e KA sono raggruppati insieme e definiti collettivamente affinità efficace 2D; il prodotto di questa con la velocità di dissociazione (off rate) è la velocità efficace di associazione 2D: AC K on = AC KA × K off. Qui viene mostrato un esempio della determinazione dell'integrina alfa L beta due.

Densità del sito sui neutrofili. I neutrofili sono stati prima incubati con un microgrammo per millilitro di E-selectina Ig, quindi con concentrazioni sature di anticorpo monoclonale anti-CD11a coniugato con PE o con IgG murina come controllo. Dopo 30 minuti di incubazione, i campioni sono stati lavati e analizzati mediante citometria a flusso con quantità standard.

Perle di calibrazione PE brillanti. Il pannello A mostra gli istogrammi di fluorescenza delle perle di calibrazione insieme a quelli di cellule trattate o non trattate con E-selectina IG. La colorazione specifica con anticorpo monoclonale CD11A è mostrata con curve continue, mentre la colorazione con anticorpo di controllo dell'isotipo corrispondente è mostrata con curve tratteggiate.

Il pannello B mostra il processo di quantificazione della densità. È stato calcolato il logaritmo in base 10 dell'intensità fluorescente media di ciascuno dei quattro microsfera. Valore del picco di calibrazione del pannello A e delle molecole di PE per microsfera specifiche per il lotto.

È stata tracciata una regressione lineare del log₁₀ di molecole di PE per microsfera rispetto al log₁₀ della fluorescenza per le cellule reselezionate. Il valore log₁₀ fi è pari a 3,99, indicato con il cerchio blu pieno, e a 2,23, indicato con il cerchio blu vuoto, per l'anticorpo monoclonale specifico e per l'anticorpo di controllo rispettivamente. Risolvendo l'equazione lineare per X, il numero totale di alfa L beta due o neutrofili è stato calcolato in 9.587.

La densità superficiale è stata calcolata pari a 43 siti per micron quadrato, utilizzando 8,4 micron come diametro del neutrofilo. Il grafico successivo mostra la frequenza di adesione progressiva fi per il legame specifico a un secondo e a 10 secondi. I tempi di contatto sono stati misurati da cicli ripetuti di test di adesione tra globuli rossi rivestiti con ICAM-1 e neutrofili umani che esprimono l'integrina alfa L beta 2.

In contrasto, qui viene mostrata la frequenza di adesione dinamica fi per il legame non specifico a tempi di contatto di un secondo e dieci secondi, misurata da cicli ripetuti del test di adesione tra globuli rossi rivestiti con IgG umana e neutrofili umani che esprimono l'integrina alfa L beta due. Questo grafico finale illustra la cinetica delle probabilità di legame di I A uno all'integrina alfa L beta due dei neutrofili; le probabilità di adesione misurate per tre coppie di cellule per ogni tempo di contatto sono state mediate e riportate in funzione del tempo di contatto, al fine di controllare il legame non specifico. Sono state utilizzate due condizioni diverse.

Un globulo rosso ricoperto con l'anticorpo di cattura anti-TFC e incubato con IgG umana anziché con ICAM, un IG e due neutrofili legati a globuli rossi non ricoperti con l'anticorpo di cattura. Il legame non specifico registrato come curva di controllo con IgG umana è stato utilizzato per ottenere una curva di probabilità di adesione specifica. Utilizzando l'equazione precedentemente mostrata per la correzione del legame non specifico.

La curva della probabilità di adesione specifica corretta è stata adattata mediante un'analisi di modellizzazione. La curva della probabilità di adesione specifica ha restituito l'affinità di legame efficace. Un CKA è uguale a 1,4 volte 10 alla meno quattro micrometri alla quarta potenza e koff è uguale a 0,3 s alla meno uno.

Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come misurare la cinetica delle interazioni recettore-legante quando entrambe le molecole sono ancorate alle superfici delle cellule di interazione I. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che le prime prove devono prevedere diverse densità sul lato del legante in modo che la frequenza di adesione rientri in un intervallo medio, e ricordare che lavorare con sangue e alcune sostanze utilizzate per trattamenti specifici, ad esempio sodio azide e DM, può essere estremamente pericoloso. Pertanto, sono necessarie precauzioni come la lettura accurata della scheda di sicurezza (MSDS) dei reagenti e l'uso di guanti durante l'esecuzione di questa procedura.