Ripiegamento di analisi intracellulari
January 24th, 2012
In questo protocollo un metodo per misurare ripiegamento delle proteine intracellulari dopo shock termico è descritto. Questo metodo può essere utilizzato per studiare foldases come chaperon molecolari e la loro co-fattori o composti in grado di influenzare la loro attività. Attività Firefly luciferasi viene utilizzato come reporter per misurare l'attività ripiegamento accompagnatore.
L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di misurare la proteina intracellulare chaperone dipendente, che si ripiega dopo uno shock termico. Utilizzando un reporter di luciferasi, prima di tutto trasfettare le cellule con plasmidi che rivestono il gene reporter della luciferasi e il chaperone di interesse. Quindi dividere le cellule trasfettate per i punti temporali di recupero nel disegno sperimentale.
Il giorno successivo, lo shock termico delle cellule induce il dispiegamento delle proteine. Consentire il recupero per riacquistare il ripiegamento intracellulare delle proteine e quindi misurare l'attività del reporter della luciferasi. I risultati misurano il ripiegamento delle proteine dipendente dal tempo e dallo chaperone in base al saggio della luciferasi.
Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come il saggio di ripiegamento in vitro, è la possibilità di avere una lettura fisiologica dell'effetto di composti o proteine sull'attività del chaperone. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia di una vasta gamma di malattie come le malattie neurodegenerative o il cancro perché gli chaperoni svolgono un ruolo importante nello sviluppo di queste patologie. Per prima cosa, preriscaldare il terreno di coltura, il PBS e la tripsina a 37 gradi Celsius a bagnomaria.
Lavare una coltura confluente di cellule HEK 2 93 con cinque millilitri di PBS. Quindi applicare un millilitro di tripsina contenente lo 0,025% di EDTA, ruotare delicatamente la piastra per una distribuzione uniforme della tripsina e incubare a 37 gradi Celsius. Agitare periodicamente la piastra per verificare il distacco della cella.
Ora sospendi le cellule in 10 millilitri di terreno DMEM completo e trasferiscile in una provetta di falco da 50 millilitri. Quindi enumerare le celle utilizzando una contropiastra Beckman. Le cellule a circa il 60-70% di cofluenza e incubano per sei-otto ore.
Equilibrare il gene estremo, nove reagenti a temperatura ambiente e l'aliquota del terreno libero dal siero a 37 gradi Celsius. Pipettare il terreno privo di siero in due provette einor. Quindi aggiungere il reagente extreme gene nine senza toccare la parete del tubo einor, incubare per cinque minuti a temperatura ambiente.
Nel frattempo, preparare le miscele di trasfezione 2D NA nel tubo uno, aggiungere la lucciola vaniglia ran e un controllo vettoriale vuoto nel tubo due. Aggiungere la lucciola alla vaniglia e l'chaperone molecolare. Aggiungere il DNA al vortice di miscelazione del reagente di trasfezione e incubare a temperatura ambiente per 20 minuti.
Continuare ad aggiungere questa miscela sulle celle piastrate e incubare per 24 ore. Raccogliere le cellule trasfettate utilizzando le cellule dei semi di tripsina al 60-70% di fluenza di co in piastre a sei pozzetti e lasciarle nell'incubatore per una notte. Aspirare il terreno dalle cellule trasfettate.
Quindi aggiungere un millilitro di tampone per shock termico e incubare per 30 minuti. Per interrompere la sintesi proteica di Denovo, sigillare i coperchi con strisce paraformali e incubare in un bagno d'acqua a 45 gradi Celsius per 30 minuti. Ora rimuovi la paraforma e rimetti le cellule nell'incubatore per il recupero in momenti specificati.
Raccogliere le cellule e lavarle una volta in PBS Per un'efficiente schiocca di lisi cellulare, congelare il pellet cellulare in azoto liquido, aggiungere 200 microlitri di tampone di lisi passiva diluito. Ora aliquote in triplice copia. 30 microlitri di lisato cellulare per pozzetto di una piastra a 96 pozzetti.
Per valutare l'efficienza della trasfezione, iniziare con i campioni di riferimento non shockati. Per misurare l'attività della luciferasi run, preparare un nuovo Lucifer da 0,2 millimolari in un tampone di reazione con tampone Gly contenente un millimolare A TP e un tampone di reazione ezine micromolare da 0,2. Inserire la piastra a 96 pozzetti nel luminometro e avviare il programma.
Stazione di lavoro Wallach 1420. Introduca la pompa uno nel tubo Falcon contenente 0,2 tampone di reazione ezine micromolare. Scegli dal menu, l'opzione manutenzione dell'erogatore e spunta la pompa.
Selezionare l'opzione Riempimento per modificare il layout della piastra. Scegli l'opzione, esplora il protocollo e i risultati nel menu. Seleziona il protocollo.
Ora seleziona i pozzetti da leggere. Torna a Wallach manager e fai clic su Inizia per misurare le emissioni del campione. A 482 nanometri, procedere alla manutenzione dell'erogatore e selezionare vuoto e pompare uno per rilasciare tutta la soluzione residua nel tubo.
Ora sposta il tubo su un falco contenente acqua e spunta, sciacqua. Continuare selezionando vuoto. Quindi posizionare il tubo della pompa uno nel tampone di reazione e il tubo della pompa due nella soluzione LUCIFERIANA.
Modificare il layout della piastra. Selezionare il riempimento per la pompa uno e la pompa due. Dal menu di manutenzione dell'erogatore, selezionare il protocollo e iniziare a misurare la lunghezza d'onda di reazione della luciferasi della lucciola di 560 nanometri.
Al termine della ripetizione ripetere la procedura, vuoto, sciacquone, vuoto. Per la prima e la seconda pompa, visualizzare i risultati nel Wallach 1420 Explorer. Ogni esperimento è associato ad un saggio.
Numero, nome utente, data di inizio e fine, risultati dell'esportazione come file Excel. Per l'analisi, il ripiegamento delle proteine è direttamente correlato al tempo di recupero. In questo esperimento, le cellule vengono valutate in diversi punti temporali dopo lo shock termico.
In assenza e in presenza di chaperone molecolare. Come previsto, la percentuale di luciferasi ripiegata aumenta con il tempo di recupero prolungato sia nei controlli che nelle cellule trasfettate con il chaperone molecolare. Al contrario, un set di dati non valido visualizza valori R quadrati scadenti per la correlazione tra il tempo e il ripiegamento.
Seguendo questa tecnica, è possibile eseguire altri metodi come il test TPA in vitro per rispondere a ulteriori domande come l'inibizione dell'attività enzimatica del chaperone. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come misurare le proteine intracellulari. Seguiamo dopo lo shock dell'intoppo.
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Panoramica
Questo protocollo descrive un metodo per misurare il rimodellamento delle proteine intracellulari dopo uno shock termico, concentrandosi sul ruolo delle chaperon molecolari. L'attività della luciferasi delle lucciole serve come reporter per valutare l'attività di rimodellamento delle chaperon.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Biologia cellulare
- Rimodellamento delle proteine
- Chaperon molecolari
Sfondo
- Comprendere il rimodellamento delle proteine è cruciale per la funzione cellulare.
- Lo shock termico può portare allo svolgimento delle proteine, necessitando meccanismi di rimodellamento.
- Le chaperon molecolari assistono nel processo di rimodellamento.
- I test della luciferasi forniscono una misura quantitativa dell'attività di rimodellamento.
Obiettivo dello studio
- Misurare il rimodellamento delle proteine intracellulari dipendenti dalle chaperon.
- Investigare gli effetti dello shock termico sulla struttura delle proteine.
- Utilizzare la luciferasi come reporter per valutare l'attività delle chaperon.
Metodi utilizzati
- Trasfezione di cellule con plasmidi contenenti geni della luciferasi e delle chaperon.
- Punti temporali di recupero stabiliti dopo la trasfezione.
- Induzione dello shock termico per promuovere lo svolgimento delle proteine.
- Misura dell'attività della luciferasi per valutare l'efficienza del rimodellamento.
Risultati principali
- È stato osservato un rimodellamento delle proteine dipendente dal tempo.
- L'attività delle chaperon è stata confermata attraverso i test della luciferasi.
- I risultati hanno indicato l'efficacia delle chaperon nel recupero delle proteine.
- I dati supportano il ruolo delle chaperon molecolari nelle risposte cellulari allo stress.
Conclusioni
- Il metodo misura efficacemente il rimodellamento delle proteine dopo uno shock termico.
- I test della luciferasi sono uno strumento affidabile per studiare l'attività delle chaperon.
- I risultati contribuiscono alla comprensione dell'omeostasi proteica nelle cellule.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
This intracellular refolding assay provides a cell-based readout for measuring molecular chaperone activity, enabling target validation in protein homeostasis pathways. By linking chaperone function to luciferase refolding, it supports mechanistic de-risking in oncology and neurodegeneration drug discovery. The assay facilitates compound screening for modulators of chaperone activity, informing lead identification and predictive confidence in preclinical models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of chaperone-dependent protein refolding as a therapeutic hypothesis in stress response pathways.
- Operational Value: Provides a quantitative, luciferase-based readout for assessing chaperone function in live cells.
- Predictive Value: Supports target confidence by measuring compound effects on intracellular refolding activity.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates dose-response data for compounds that inhibit or stimulate chaperone-mediated refolding.
- Operational Value: Uses a normalized dual-luciferase system (firefly/renilla) to control for transfection efficiency and variability.
- Scalability: Compatible with 96-well plate formats for medium-throughput screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models chaperone involvement in cancer chemoresistance and neurodegeneration, supporting translational biomarker alignment.
- Preclinical Continuity: Bridges target validation to functional assessment of chaperone activity in disease-relevant systems.
- Risk-Adjusted Decisions: Enables go/no-go decisions based on compound effects on proteostasis mechanisms.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical evaluation, particularly for modulators of protein folding networks.
- Discovery Biology: Tests hypotheses about chaperone function in intracellular refolding after heat shock-induced protein unfolding.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative luminescence readouts suitable for compound library screening.
- Analytics: Provides time-dependent and chaperone-dependent refolding metrics for comparing experimental conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical models where chaperones influence disease progression in cancer and neurodegeneration.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for assessing chaperone modulators across multiple target classes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Measures target engagement through functional refolding output, reducing mechanistic ambiguity in chaperone modulation.
- Operational Value: Standardizes assay conditions using defined transfection and recovery protocols for cross-lab reproducibility.
- Strategic Value: Improves portfolio prioritization by identifying compounds with desired effects on proteostasis pathways.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement of chaperone-targeted candidates in oncology and CNS therapeutic areas.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mammalian cell transfection and luciferase reporter assays.
- Dependent on luminometer compatibility for dual-wavelength luciferase detection.
- Necessitates standardized heat shock and recovery conditions across experimental batches.
- Adaptation to other chaperone-client pairs may require validation of refolding dependence.
- Limited to soluble, refoldable protein reporters like luciferase; not suitable for aggregation-prone clients without modification.
