Ripiegamento di analisi intracellulari
24 gennaio 2012
In questo protocollo un metodo per misurare ripiegamento delle proteine intracellulari dopo shock termico è descritto. Questo metodo può essere utilizzato per studiare foldases come chaperon molecolari e la loro co-fattori o composti in grado di influenzare la loro attività. Attività Firefly luciferasi viene utilizzato come reporter per misurare l'attività ripiegamento accompagnatore.
L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di misurare la proteina intracellulare chaperone dipendente, che si ripiega dopo uno shock termico. Utilizzando un reporter di luciferasi, prima di tutto trasfettare le cellule con plasmidi che rivestono il gene reporter della luciferasi e il chaperone di interesse. Quindi dividere le cellule trasfettate per i punti temporali di recupero nel disegno sperimentale.
Il giorno successivo, lo shock termico delle cellule induce il dispiegamento delle proteine. Consentire il recupero per riacquistare il ripiegamento intracellulare delle proteine e quindi misurare l'attività del reporter della luciferasi. I risultati misurano il ripiegamento delle proteine dipendente dal tempo e dallo chaperone in base al saggio della luciferasi.
Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come il saggio di ripiegamento in vitro, è la possibilità di avere una lettura fisiologica dell'effetto di composti o proteine sull'attività del chaperone. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia di una vasta gamma di malattie come le malattie neurodegenerative o il cancro perché gli chaperoni svolgono un ruolo importante nello sviluppo di queste patologie. Per prima cosa, preriscaldare il terreno di coltura, il PBS e la tripsina a 37 gradi Celsius a bagnomaria.
Lavare una coltura confluente di cellule HEK 2 93 con cinque millilitri di PBS. Quindi applicare un millilitro di tripsina contenente lo 0,025% di EDTA, ruotare delicatamente la piastra per una distribuzione uniforme della tripsina e incubare a 37 gradi Celsius. Agitare periodicamente la piastra per verificare il distacco della cella.
Ora sospendi le cellule in 10 millilitri di terreno DMEM completo e trasferiscile in una provetta di falco da 50 millilitri. Quindi enumerare le celle utilizzando una contropiastra Beckman. Le cellule a circa il 60-70% di cofluenza e incubano per sei-otto ore.
Equilibrare il gene estremo, nove reagenti a temperatura ambiente e l'aliquota del terreno libero dal siero a 37 gradi Celsius. Pipettare il terreno privo di siero in due provette einor. Quindi aggiungere il reagente extreme gene nine senza toccare la parete del tubo einor, incubare per cinque minuti a temperatura ambiente.
Nel frattempo, preparare le miscele di trasfezione 2D NA nel tubo uno, aggiungere la lucciola vaniglia ran e un controllo vettoriale vuoto nel tubo due. Aggiungere la lucciola alla vaniglia e l'chaperone molecolare. Aggiungere il DNA al vortice di miscelazione del reagente di trasfezione e incubare a temperatura ambiente per 20 minuti.
Continuare ad aggiungere questa miscela sulle celle piastrate e incubare per 24 ore. Raccogliere le cellule trasfettate utilizzando le cellule dei semi di tripsina al 60-70% di fluenza di co in piastre a sei pozzetti e lasciarle nell'incubatore per una notte. Aspirare il terreno dalle cellule trasfettate.
Quindi aggiungere un millilitro di tampone per shock termico e incubare per 30 minuti. Per interrompere la sintesi proteica di Denovo, sigillare i coperchi con strisce paraformali e incubare in un bagno d'acqua a 45 gradi Celsius per 30 minuti. Ora rimuovi la paraforma e rimetti le cellule nell'incubatore per il recupero in momenti specificati.
Raccogliere le cellule e lavarle una volta in PBS Per un'efficiente schiocca di lisi cellulare, congelare il pellet cellulare in azoto liquido, aggiungere 200 microlitri di tampone di lisi passiva diluito. Ora aliquote in triplice copia. 30 microlitri di lisato cellulare per pozzetto di una piastra a 96 pozzetti.
Per valutare l'efficienza della trasfezione, iniziare con i campioni di riferimento non shockati. Per misurare l'attività della luciferasi run, preparare un nuovo Lucifer da 0,2 millimolari in un tampone di reazione con tampone Gly contenente un millimolare A TP e un tampone di reazione ezine micromolare da 0,2. Inserire la piastra a 96 pozzetti nel luminometro e avviare il programma.
Stazione di lavoro Wallach 1420. Introduca la pompa uno nel tubo Falcon contenente 0,2 tampone di reazione ezine micromolare. Scegli dal menu, l'opzione manutenzione dell'erogatore e spunta la pompa.
Selezionare l'opzione Riempimento per modificare il layout della piastra. Scegli l'opzione, esplora il protocollo e i risultati nel menu. Seleziona il protocollo.
Ora seleziona i pozzetti da leggere. Torna a Wallach manager e fai clic su Inizia per misurare le emissioni del campione. A 482 nanometri, procedere alla manutenzione dell'erogatore e selezionare vuoto e pompare uno per rilasciare tutta la soluzione residua nel tubo.
Ora sposta il tubo su un falco contenente acqua e spunta, sciacqua. Continuare selezionando vuoto. Quindi posizionare il tubo della pompa uno nel tampone di reazione e il tubo della pompa due nella soluzione LUCIFERIANA.
Modificare il layout della piastra. Selezionare il riempimento per la pompa uno e la pompa due. Dal menu di manutenzione dell'erogatore, selezionare il protocollo e iniziare a misurare la lunghezza d'onda di reazione della luciferasi della lucciola di 560 nanometri.
Al termine della ripetizione ripetere la procedura, vuoto, sciacquone, vuoto. Per la prima e la seconda pompa, visualizzare i risultati nel Wallach 1420 Explorer. Ogni esperimento è associato ad un saggio.
Numero, nome utente, data di inizio e fine, risultati dell'esportazione come file Excel. Per l'analisi, il ripiegamento delle proteine è direttamente correlato al tempo di recupero. In questo esperimento, le cellule vengono valutate in diversi punti temporali dopo lo shock termico.
In assenza e in presenza di chaperone molecolare. Come previsto, la percentuale di luciferasi ripiegata aumenta con il tempo di recupero prolungato sia nei controlli che nelle cellule trasfettate con il chaperone molecolare. Al contrario, un set di dati non valido visualizza valori R quadrati scadenti per la correlazione tra il tempo e il ripiegamento.
Seguendo questa tecnica, è possibile eseguire altri metodi come il test TPA in vitro per rispondere a ulteriori domande come l'inibizione dell'attività enzimatica del chaperone. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come misurare le proteine intracellulari. Seguiamo dopo lo shock dell'intoppo.
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Panoramica
Questo protocollo descrive un metodo per misurare il ripiegamento intracellulare delle proteine dopo uno shock termico, concentrandosi sul ruolo delle chaperoni molecolari. L'attività della luciferasi della lucciola funge da reporter per valutare l'attività di ripiegamento delle chaperoni.
Componenti Chiave dello Studio
Ambito Scientifico
- Biologia cellulare
- Il ripiegamento delle proteine
- Chaperoni molecolari
Sfondo
- Comprendere il ripiegamento delle proteine è fondamentale per la funzione cellulare.
- Lo shock termico può causare lo svolgimento delle proteine, rendendo necessari meccanismi di ripiegamento.
- Le chaperoni molecolari assistono nel processo di ripiegamento.
- I saggi della luciferasi forniscono una misura quantitativa dell'attività di ripiegamento.
Scopo dello studio
- Misurare il ripiegamento intracellulare delle proteine dipendente dalle chaperine.
- Studiare gli effetti dello shock termico sulla struttura delle proteine.
- Utilizzare la luciferasi come reporter per valutare l'attività delle chaperine.
Metodi Utilizzati
- Trasfezione delle cellule con plasmidi contenenti i geni della luciferasi e delle chaperonine.
- Stabilizione dei tempi di recupero dopo la trasfezione.
- Induzione dello shock termico per favorire lo svolgimento delle proteine.
- Misurazione dell'attività della luciferasi per valutare l'efficienza del ripiegamento.
Risultati principali
- È stato osservato un ripiegamento dipendente dal tempo delle proteine.
- L'attività delle chaperone è stata confermata mediante saggi con la luciferasi.
- I risultati hanno indicato l'efficacia delle chaperone nel recupero proteico.
- I dati supportano il ruolo delle chaperone molecolari nelle risposte cellulari allo stress.
Conclusioni
- Il metodo misura in modo efficace il ripiegamento delle proteine dopo lo shock termico.
- I saggi con luciferasi sono uno strumento affidabile per lo studio dell'attività delle chaperone.
- I risultati contribuiscono alla comprensione dell'omeostasi proteica nelle cellule.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Metodo
Questo saggio di ripiegamento intracellulare fornisce un'analisi basata su cellule per misurare l'attività delle chaperone molecolari, consentendo la validazione degli obiettivi nei percorsi di omeostasi proteica. Collegando la funzione delle chaperone al ripiegamento della luciferasi, supporta la riduzione del rischio meccanicistica nella scoperta di farmaci per l'oncologia e le malattie neurodegenerative. Il saggio facilita lo screening di composti in grado di modulare l'attività delle chaperone, fornendo informazioni per l'identificazione di composti promettenti e una maggiore affidabilità predittiva nei modelli preclinici.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Consente l'analisi dell'ipotesi terapeutica basata sul ripiegamento proteico dipendente dalle chaperone nelle vie di risposta allo stress.
- Valore operativo: Fornisce un'uscita quantitativa basata sulla luciferasi per valutare la funzione delle chaperone in cellule vive.
- Valore predittivo: Supporta la fiducia sul bersaglio misurando gli effetti dei composti sull'attività intracellulare di ripiegamento.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera dati di risposta dose-effetto per composti che inibiscono o stimolano il ripiegamento mediato da chaperoni.
- Valore operativo: Utilizza un sistema dual-luciferasi normalizzato (luciferasi di lucertola/di renilla) per controllare l'efficienza di trasfezione e la variabilità.
- Scalabilità: Compatibile con formati di piastre a 96 pozzetti per campagne di screening a media produttività.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per le Malattie: Modella il coinvolgimento delle chaperone nella chemioresistenza tumorale e nella neurodegenerazione, favorendo l'allineamento traslazionale dei biomarcatori.
- Continuità Preclinica: Collega la validazione del bersaglio alla valutazione funzionale dell'attività delle chaperone in sistemi rilevanti per la malattia.
- Decisioni Basate sul Rischio: Permette decisioni di avanzamento o interruzione basate sugli effetti del composto sui meccanismi di proteostasi.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il saggio si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla validazione del bersaglio all'identificazione del capostazione fino alla valutazione preclinica, in particolare per i modulatori delle reti di ripiegamento delle proteine.
- Biologia della scoperta: Verifica ipotesi sulla funzione delle chaperoni nel ripiegamento intracellulare dopo lo svolgimento delle proteine indotto da shock termico.
- Screening: Fornisce letture luminometriche quantitative e riproducibili, adatte allo screening di librerie di composti.
- Analisi: Offre parametri di ripiegamento dipendenti dal tempo e dalle chaperoni, utili per confrontare diverse condizioni sperimentali.
- Ricerca traslazionale: Si collega a modelli preclinici in cui le chaperoni influenzano l'evoluzione della malattia in patologie oncologiche e neurodegenerative.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per valutare modulatori delle chaperoni in diverse classi di bersagli.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Misura l'interazione con il bersaglio attraverso l'output funzionale di ripiegamento, riducendo l'ambiguità meccanicistica nella modulazione delle chaperone.
- Valore operativo: Standardizza le condizioni del saggio utilizzando protocolli definiti di trasfezione e recupero per garantire riproducibilità tra diversi laboratori.
- Valore strategico: Migliora la priorizzazione del portafoglio identificando composti con effetti desiderati sulle vie di proteostasi.
- Impatto sul portafoglio: Favorisce l'avanzamento, corretto per il rischio, di candidati mirati alle chaperone nei settori terapeutici dell'oncologia e del sistema nervoso centrale.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche nella trasfezione di cellule di mammifero e nei saggi con reporter luciferasi.
- Dipende dalla compatibilità del luminometro per la rilevazione della luciferasi a doppia lunghezza d'onda.
- Necessita di condizioni standardizzate di shock termico e recupero tra i diversi lotti sperimentali.
- L'adattamento ad altre coppie chaperone-cliente potrebbe richiedere la validazione della dipendenza dal ripiegamento.
- Limitato a reporter proteici solubili e ripiegabili come la luciferasi; non adatto a clienti con tendenza all'aggregazione senza modifiche.
