Name: Germ trapianto di cellule e di tessuto testicolare xenotrapianto in topi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-06T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: Impara le tecniche di trapianto di cellule germinali e xenotrapianto di tessuto testicolare nei topi per studiare la spermatogenesi e identificare le cellule staminali spermatogoniali.

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Il lavoro del laboratorio autori è stata sostenuta da USDA / CSREES / NRICGP (2007-35203-18213); NIH / NCRR (2 RR17359 R01-06), NIH / NIEHS (1 R21 ES014856-01A2) e Alberta Innovates - Health Solutions.

Germe di trapianto di cellule A. PART nei topi 1. Preparazione di topi riceventi <ol><li> I destinatari devono essere immunologicamente tolleranti (sia geneticamente identiche al donatore o con deficit immunitario) alle cellule del testicolo il donatore. </li><li> I destinatari devono essere naturalmente privo di spermatogenesi (ad esempio w / w v topi) o impoverito di cellule germinali endogene. Deplezione delle cellule di germe può essere raggiunto da radiazioni o da farmaci chemioterapici come il Busulfan. In questo protocollo, si descrive il metodo di preparazione di topi riceventi con Busulfan. </li><li> Trattare i destinatari a 4-6 settimane di età mediante iniezione ip di busulfan. La dose ottimale di busulfan è sforzo dipendente. In ceppi beneficiarie comunemente utilizzati, una dose di 40-50 mg / kg è sufficiente deplezione delle cellule germinali endogene (ad esempio 44 mg / kg per topi nudi, 50 mg / kg per B6/129 destinatari F1). </li><li> Sciogliere Busulfan polvere in DMSO e quindi aggiungere un uguale volume di sterile t acqua distillataØ fare una concentrazione finale di 4 mg / ml. Mantenere soluzione calda a 35-40 ° C prima dell'uso per evitare la precipitazione di busulfan. Eliminare la soluzione se si osserva la precipitazione. </li><li> Dopo il trattamento Busulfan, lasciare almeno un mese prima di utilizzare i destinatari. I destinatari possono essere utilizzati tra 1 mese e 3 mesi post-trattamento Busulfan. </li></ol> 2. Preparazione di pipette microiniezione <ol><li> Scegliere pipette in vetro borosilicato (tubi capillari) con un diametro 1,0 millimetri esterno, uno diametro 0,75 mm interno, e una lunghezza di 3 pollici. </li><li> Siliconize pipette di vetro con Sigmacote, lavare pipette con metanolo e asciugare. </li><li> Tirare le pipette con un estrattore pipetta. Diverse macchine estrattori pipette hanno impostazioni diverse, di conseguenza, verificare alcune impostazioni. Generalmente, un'impostazione simile a quella utilizzata per rendere pipette enucleazione può funzionare. </li><li> Rompere i punte di pipetta sotto microscopio da dissezione prima di utilizzare per raggiungere un diametro di circa 50 umsulla punta. </li></ol> 3. Preparazione di cellule del donatore per il trapianto <ol><li> Choise di ceppo donatore è dipende dalla questione sperimentale studiato. Se la quantificazione della spermatogenesi viene utilizzato come endpoint, l'uso di donatori con un marker genetico facilmente identificabile come ad esempio Lac-Z (ad esempio B6.129S7-Gt (ROSA) 26Sor / J dal Jackson Laboratory) o GFP (ad es C57BL/6-Tg ( CAG-EGFP) 1Osb / J dal Jackson Laboratory). </li><li> Preparare 7 ml di collagenasi in DMEM a 1 ml mg / ml, 4 ml di tripsina-EDTA (0,25% trypsin più 1 mM EDTA), e 2 di DNase in DMEM a 7 mg / ml. Tale importo è per digerire 2 testicoli di topo donatori. </li><li> Raccogliere testicoli in modo asettico e togliere la tunica albuginea. Diffusione tubuli seminiferi delicatamente con una pinza sottile per facilitare la digestione enzimatica. </li><li> Tubuli trasferimento in collagenasi, incubare a 37 ° C per 5-10 minuti ed agitare spesso. </li><li> Lavare tubuli due volte da spinning (200-300 g per 3 min) e ri-sospensione in PBS w / o Ca 2 + + </li><li> Risospendere tubuli in tripsina-EDTA e agitare fino a farli diventare appiccicoso e poco nuvoloso. Monitorare la digestione di tubuli a 37 ° C come dovrebbe accadere entro 1-2 min. </li><li> Aggiungi DNasi e agitare bene. Incubare per 1-2 min. </li><li> Aggiungere 3 ml di FBS fermare l'azione di enzimi. </li><li> Sospensione cellulare filtro con una maglia in nylon con 40-70 micron dimensioni dei pori per rimuovere cellule / tessuti pezzi. </li><li> Raccogliere le cellule a 600 g per 5 min e risospendere cellule in una piccola quantità di DMEM (&lt;100 pl). </li><li> Contare le cellule e regolare il volume ad una concentrazione finale desiderata (in genere 100 x 10 6). Mantieni sospensione cellulare sul ghiaccio prima dell'uso. </li><li> Ogni Busulfan-trattati con testicolo mouse sarà riempito con solo il 10-15 microlitri di sospensione cellulare. A causa della potenziale spreco e perdita, mirano ad avere 30-50 pl per testicolo. </li></ol> 4. Transplantation procedura (Figura 1) <ol><li> Anestetizzare seguenti destinatari protocolli approvati. </li><li> Luogo in dorsaledecubito e chirurgicamente preparare l'area addominale. Fai una ~ 1 centimetro incisione addominale mediana per esporre la parete addominale. Sollevare parete addominale utilizzando una pinza di piccole dimensioni in corrispondenza del punto della linea bianca per evitare di ferire accidentalmente organi addominali, e procedere per fare un 0,5 cm ~ incisione sulla linea mediana della parete addominale per esporre la cavità peritoneale. </li><li> Utilizzare una pinza dell'iride per tenere la parete addominale, e utilizzare un altro paio di pinze dell'iride per cercare i cuscinetti di grasso collegati alla epididimo e testicolo nella cavità peritoneale. Estrarre delicatamente il cuscinetto adiposo fino a che la testicolo viene esteriorizzato e l'arteria testicolare e dell'epididimo sono chiaramente visibili. Lavorare su una testicolo alla volta. </li><li> Posizionare un telino sterile sottile a base di schede in autoclave sotto il cuscinetto adiposo / testicolo per una migliore identificazione visiva (opzionale). Il drappo lavora anche per assorbire fluido. </li><li> Aggiungere una goccia di colorante Trypan Blue nella sospensione cellulare e accuratamente caricare la sospensione cellula nel polietitubazione Lene collegato ad una siringa 1 ml. Fissare la pipetta tirato nel tubo e delicatamente forzare la sospensione cellula nel pipetta applicando pressione alla siringa. </li><li> Identificare i condotti efferenti (che collegano le testicolo per l'epididimo) e rimuovere delicatamente il tessuto grasso attorno ai dotti. Lavorare con cura, come i condotti e la membrana che li circondano sono trasparenti. </li><li> Inserire con cautela la pipetta in un condotto nel fascio di condotti efferenti, delicatamente infilare pochi mm verso il testicolo. </li><li> Mentre evitando muovendo il pipetta di iniezione, raggiungere per la siringa, delicatamente prema lo stantuffo della siringa per assicurare che la sospensione fluisce nel rete testis e seminiferi tubuli cominciano a riempire. </li><li> La velocità di iniezione e la portata di sospensione cellulare è regolato da pressione con il pollice. Evitare aumento improvviso di pressione; monitorare il movimento di sospensione in tubuli. </li><li> Interrompere l'iniezione, quando quasi tutti i tubuli di superficie sono stati riempiti prima che il testicolo inizia a become ischemico. </li><li> Riportare il testicolo alla cavità addominale. Ripetere la procedura sul testicolo controlaterale. Suturare la parete addominale con suture in seta 6-0 e chiudere la pelle con clips metalliche ferita. Monitorare i topi su un pad riscaldamento fino al recupero completo. </li></ol> 5. Analisi dei testicoli beneficiarie <ol><li> Lasciare 2-4 mesi dopo il trapianto prima dell'analisi. </li><li> Euthanize il mouse destinatario secondo la cura degli animali e le linee guida di utilizzo e raccogliere il testicolo e all'epididimo in PBS. Quando un Lac-Z ceppo donatore transgenico è stato utilizzato, l'epididimo può essere utilizzato come controllo colorazione positivo in quanto ha endogena beta-galattosidasi attività. </li><li> Per il rilevamento di cellule del donatore da Lac-Z colorazione, fissare il testicolo per 1-2 ora a 4 ° C in 4% paraformaldeide (PFA) in PBS. Sciacquare 3 x 30 min a temperatura ambiente in lacZ risciacquo tampone. </li><li> Incubare notte a 37 ° C in soluzione colorante lacZ. Testicolo può essere colorato nel suo insieme o dopo la dispersionei tubuli. </li><li> Fissare e memorizzare in 10% formalina tamponata neutra. Se le sezioni è necessario utilizzare rosso neutro veloce come anti-macchia. </li></ol> PARTE B. ectopica xenotrapianto in topi (Da Dobrinski e Rath 2008 15 e-Sosa Rodriguez et al. 2011 16). 1. Raccolta di tessuto di donatore <ol><li> Ottenere tessuto testicolare con la castrazione o la biopsia da un maschio donatore. </li><li> Testicolo di luogo in PBS o biopsie in terreno di coltura, mantenendo condizioni di sterilità. </li><li> Tenere il tessuto raccolti su ghiaccio e trasporto al laboratorio. </li></ol> 2. Preparazione di tessuto di donatore <ol><li> Eseguire in la cappa coltura tissutale per mantenere la sterilità. </li><li> Lavare ogni testicolo in gelide antibiotici PBS contenente due o tre volte prima di trasferire in una cultura piatto con PBS. Nel caso di biopsie, lavare frammenti testicolo due o tre volte con ghiaccio-freddo medi culturaum contenenti antibiotici, facendo girare a 150 g per 2 minuti e risospensione in acqua dolce ghiacciata terreno di coltura. </li><li> Per testicoli intatti, rimuovere tunica vaginale facendo un'incisione lungo la superficie e estrudere testicolo. Togliere dal testicolo tutte le strutture annesse (spermatico cavo, epididimo, tessuto connettivo). Lavare i testicoli una volta in PBS freddo e il trasferimento in una cultura-piatto con PBS. </li><li> Rimuovere con cura la tunica albuginea del testicolo utilizzando una lama da bisturi e un paio di forbici. Se il testicolo è molto piccola, la tunica può essere rimosso dalla spremitura del tessuto testicolare fuori dalla tunica attraverso una piccola incisione fatto su uno estremità tenendo la tunica con un paio di pinze piccole sull'altra estremità. </li><li> A seconda delle dimensioni del testicolo sia il tessuto testicolo intero può essere tagliato in piccoli pezzi di circa 1 - 2 mm 3 in dimensioni usando pinze curve e una lama bisturi, o pezzi grandi di tessuto testicolare può prima essere rimosso dal testicolo e poi tagliati in piccolipezzi. Tutto ciò dovrebbe essere fatto in ghiacciato terreno di coltura e in condizioni sterili in un piccolo piatto di coltura (60 x15 mm). </li><li> Trasferire i frammenti di tessuto preparate per ghiacciata terreno di coltura in piccoli piatti di cultura nel ghiaccio fino innesto. </li></ol> 3. La castrazione del destinatario del mouse <ol><li> Anestetizzare il mouse come sopra e preparare sterile campo chirurgico il taglio i capelli (non necessario in topi nudi), asciugandosi con il 70% di etanolo e la soluzione di Betadine. </li><li> Fare un 0,5 -1 cm ventrale incisione cutanea mediana per esporre la parete addominale. </li><li> Con attenzione esporre il testicolo, l'arteria testicolare e dell'epididimo, come descritto in Parta, 4,2-4,3. </li><li> Staccare la coda dei epidydimis dal gubernaculum per via smussa. </li><li> Legare l'arteria testicolare, e dei vasi deferenti insieme con il vaso sanguigno con la seta, e la sezione delle strutture ligati tagliando tra il testicolo e la legatura. </li><li> Ripetere la procedura per il second testicolo. </li><li> Suturare la parete addominale con uno o due punti di sutura chirurgici. </li><li> Chiudere l'incisione cutanea con uno o due clip Michel. </li></ol> 4. Ectopica xenotrapianto <ol><li> Posizionare il mouse in decubito ventrale e preparare un campo sterile chirurgico sulla sua schiena come sopra. </li><li> A seconda di quanti innesti sono di essere inserito (generalmente 4-8/mouse), rendono ~ 0.5 cm incisioni cutanee lunghe su ciascun lato della linea metà del retro del mouse. </li><li> Utilizzare pinze per tenere un bordo di incisione cutanea, e fare una cavità sottocutanea da prendere in giro a parte il tessuto connettivo con le forbici. </li><li> L'utilizzo di un posto iris forcipe un pezzo di tessuto testicolare in profondità nella cavità sottocutanea, tenendo il bordo della incisione cutanea con un altro pinza iris. </li><li> Chiudere l'incisione della pelle con una clip Michel e tenere il mouse sul tappetino di riscaldamento fino a quando non inizia a riprendersi dall'anestesia. </li><li> Trasferire il mouse in una gabbia con isolamento supplementare e cover e il monitor fino a quando i topi sono completamente recuperati. </li></ol> 5. Raccolta di xenotrapianti testicolo per l'analisi e la raccolta dello sperma <ol><li> Euthanize il mouse ospite secondo la cura degli animali e le linee guida d'uso, e fare una incisione mediana della pelle sulla pelle running back dalla coda al collo e la pelle aperto. Questo espone i innesti che possono essere situate sia sul tessuto sottocutaneo o attaccate alla pelle. </li><li> Rimuovere con cautela gli innesti utilizzando una pinza coppia e un paio di forbici. </li><li> Numero record di innesti recuperato, le dimensioni e il peso dei singoli innesti. </li><li> Recuperare le vescicole seminali dall'addome del mouse e registrare il loro peso come un'indicazione di produzione di testosterone da parte del tessuto innestato. </li><li> Per l'analisi istologica <ol class="lalpha"><li> Sospendere xenotrapianti in flaconcino campione contenente soluzione di Bouin (o fissativo altro) in un volume ~~~V 10x che del xenograft, e flaconcino etichetta adeguatamente. </li><li> Covarenotte in frigorifero seguita da lavaggio almeno 3 volte in etanolo 70% ad intervalli di 24 ore preferibilmente. </li><li> Procedere per l'elaborazione e l'incorporamento in paraffina. </li></ol></li><li> Per raccolta spermatozoi <ol class="lalpha"><li> Lavare xenotrapianti facendo girare giù a 300g per 1 min e risospensione in coltura terreno contenente antibiotici. </li><li> Tagliare innesti a pezzetti e tritate accuratamente con le pinze in un piatto di coltura contenente 3 - 5 ml di terreno di coltura. </li><li> Filtrare il tessuto tritato attraverso il filtro 40 micron cell. </li></ol></li></ol> PARTE C. rappresentativi Risultati 1. Trapianto di cellule germinali Se la sospensione di cellule del donatore trapiantato contiene cellule staminali spermatogoni che trasportano un marcatore genetico come il transgene LacZ, colonizzazione della SSC donatori nel testicolo destinatari possono essere visualizzati da X-gal colorazione come distintivi segmenti blu della seminiferous tubuli dopo 2-3 mesi post-trapianto 3 (Figura 2A). Una consolidata colonia dovrebbero avere un lungo tratto blu scuro di segmenti completamente riempite di due o più strati di cellule blu più vicini al centro, e regioni macchiati relativamente più deboli sia finisce dove una rete di singolo, coppia o piccoli gruppi di cellule blu è apparente 3 (Figura 2B). Una sezione trasversale della regione blu scuro tubulo seminifero dovrebbe rivelare una realtà consolidata e ben organizzata spermatogenesi con le cellule germinali blu ai vari stadi di differenziazione (Figura 2C). 2. Testicolo tessuto xenotrapianto La vitalità del tessuto testicolare dopo il trapianto è inversamente correlato con la fase di sviluppo del donatore, il miglior risultato si ottiene quando il tessuto da neonati maschi è usato, mentre il tessuto adulto mostra una forte tendenza a degenerare e morire 17-21. Generalmente, successo eterotrapianto diminuisce come tessuto donatore me subisceiosis della prima ondata della spermatogenesi. Tempo di pieno sviluppo del tessuto del donatore immature e la spermatogenesi completa è specie-specifico, e spesso un po 'più breve rispetto ai testicoli in situ. Il numero dei tubuli seminiferi con la spermatogenesi completa è variabile secondo le specie. Mentre in ovini, caprini e maiali che numero è maggiore di 50%, nei bovini e gatti è inferiore al 15% 14 (figura 3). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3545/3545fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Procedura di trapianto di cellule Germ. Place destinatari in decubito dorsale dopo l'anestesia e fare un 0.4-pollici ~ un'incisione addominale mediana (A). Esporre testicolo con la revoca della cuscinetto adiposo attaccato al epididimo e testicolo e posizionare un telino sterile sottile sotto il cuscinetto adiposo / testicolo per una migliore identificazione visiva (B). Posizionare il testicolo e all'epididimo in modo che i condotti efferenti sepolti nel cuscinetto adiposo sono discernibili (C, D, E). Identità i condotti efferenti e rimuovere delicatamente il tessuto grasso attorno ai dotti. Un pezzo di carta colorata o di plastica può essere collocato sotto i condotti per una migliore visualizzazione (G). Rompere o macinare la punta della pipetta base alle dimensioni dei condotti e cella di sospensioni di carico nella pipetta (H). Inserire con cautela la pipetta in un condotto nel fascio di condotti efferenti, delicatamente infilare pochi mm verso il testicolo (la freccia in H indica la direzione di pipetta di iniezione e threading). Un testicolo con iniezione con successo nel tubuli seminiferi è mostrato (I). Ts: testicolo; Ep: epididimo. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3545/3545fig2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Risultati rappresentativi per il trapianto di cellule germinali A) Un testicolo iniettati colorati con X-gal. I segmenti blu dei tubuli seminiferi rappresentano le colonie stabilite da SSCS donatori LacZ transgenici (transgene). B) ingrandimento superiore di una colonia SSC a 3 mesi post-trapianto. The nella regione blu scuro al centro rappresenta spermatogenesi completa e le regioni celesti alle estremità rappresentano l'estensione crescente della colonia. C) Una sezione istologica del buio blu tubulo seminifero (3 mesi post-trapianto) mostra spermatogenesi ben organizzata. Barre di scala in B e C sono 200 micron e 30 micron, rispettivamente. (Figure adattato dalla cella Annu Rev Dev Biol 2008;. 24:263-86 e Reprod Biol giugno 1999;. 60 (6) :1429-36). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3545/3545fig3.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Xenotrapianto ectopica di tessuto testicolare immaturi da animali di grandi dimensioni in topi immunodeficienti. Frammenti di testicolo donatori immaturi (~ 1 mm 3) trapiantate sotto la pelle dorsale di topi immunodeficienti (A) sono in grado di sopravvivere e rispondere alle gonadotropine mouse. Come risultato, tessuto testicolare subisce uno sviluppo completo, compresa formazione di sperma fecondazione competente (B). Una volta xenotrapianti testicolo vengono raccolti (C)essi possono essere utilizzati per analisi o per ottenere spermatozoi (D) per ICSI (E) e produzione di embrioni (F). Bar pari a 50 micron (B, E e F) o 10 micron (D). (Modificato da Rodriguez-Sosa e Dobrinksi 2009 14).

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<li>Honaramooz, A., Li, M. W., Penedo, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+maturation+of+primate+testis+by+xenografting+into+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Accelerated maturation of primate testis by xenografting into mice.</a> Biology of Reproduction. 70 (5), 1500-1500 (2004).</li>
</ol>

Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

1. Trapianto di cellule germinali Cellule germinali trapianto fornisce l&#39;unico saggio funzionale per la conferma inequivocabile della presenza di cellule staminali spermatogoniali (SSCs) in una popolazione cellulare. Solo SSCs possono casa e colonizzare la nicchia SSC a livello della membrana basale e avviare donatore-derivato spermatogenesi. Trapianto di cellule germinali ha permesso di studiare e manipolare i CSS in un modo senza precedenti. La tecnica è stata utilizzata per la produzion...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> Collagenasi (tipo IV) </td><td> Sigma </td><td> C5138 </td></tr><tr><td> Tripsina-EDTA </td><td> Invitrogen </td><td> 25200-056 </td></tr><tr><td> DNaseI </td><td> Sigma </td><td> DN25 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 31053-028 </td></tr><tr><td> Trypan macchia blu </td><td> Invitrogen </td><td> 15250-061 </td></tr><tr><td> Nylon mesh cella </td><td> BD Biosciences </td><td> 352.340 (40 ≠ m) 352350 (70μm) </td></tr><tr><td> Busulfan </td><td> Sigma </td><td> B2635 </td></tr><tr><td> Thin-Wall capillari di vetro </td><td> Mondo Precision Instrument </td><td> TW 100-3 </td></tr><tr><td> BD intramedic tubo plyethylene (PE100) </td><td> BD </td><td> CA-63018-725 </td></tr><tr><td> Ethicon 6-0 Silk sutura </td><td> Ethicon </td><td> 706G </td></tr><tr><td> Ferita clip </td><td> BD </td><td> 427631 </td></tr><tr><td> Sigmacote </td><td> Sigma </td><td> SL2 </td></tr><tr><td> X-gal </td><td> Sigma </td><td> B4252 </td></tr><tr><td> Il ferrocianuro di potassio </td><td> Sigma </td><td> P9387 </td></tr><tr><td> Ferricianuro di potassio </td><td> Sigma </td><td> P3667 </td></tr><tr><td> cloruro di magnesio </td><td> Sigma </td><td> 208337 </td></tr><tr><td> sodio deossicolato </td><td> Sigma </td><td> D6750 </td></tr><tr><td> N, N-Dimetilformammide </td><td> Sigma </td><td> D4551 </td></tr><tr><td> Igepal CA-630 </td><td> Sigma </td><td> 18896 </td></tr></tbody></table>

germ trapianto di cellule e di tessuto testicolare xenotrapianto in topi

Germ Cell Transplantation and Testis Tissue Xenografting in Mice

Trapianto di cellule germinali è stato sviluppato dal Dr. Ralph Brinster e colleghi presso la University of Pennsylvania nel 1994 1,2. Queste rivoluzionarie studi hanno dimostrato che microiniezione di cellule germinali di topi donatori fertili nei tubuli seminiferi dei risultati infertili topi riceventi del donatore-derivato spermatogenesi e la produzione di spermatozoi da parte dell&#39;animale ricevente 2. L&#39;uso dei maschi donatori che trasportano il batterico β-galattosidasi identificazione del gene consentito di donatore-derivato spermatogenesi e trasmissione della aplotipo donatore alla prole dagli animali beneficiarie 1. Sorprendentemente, dopo il trapianto nel lume dei tubuli seminiferi, cellule germinali trapiantate riusciti a spostare dal vano luminale alla membrana interrato dove sono spermatogoni 3. E &#39;generalmente accettato che SSCs solo sono in grado di colonizzare la nicchia e ristabilire la spermatogenesi nel testicolo destinatario. Pertanto, cellule germinalitrapianto fornisce un approccio funzionale per studiare la nicchia delle cellule staminali nei testicoli e per caratterizzare le cellule staminali putativi spermatogoni. Per data, trapianto di cellule germinali viene utilizzato per delucidare di base biologia delle cellule staminali, per produrre animali transgenici attraverso manipolazione genetica di cellule germinali precedente al trapianto di 4,5, per studiare Sertoli cell-germinali interazione cellulare 6,7, SSC homing e colonizzazione 3, 8, così come SSC self-renewal e la differenziazione 9,10. Trapianto di cellule Germ è anche realizzabile in 11 specie di grandi dimensioni. In queste, le principali applicazioni sono la conservazione della fertilità, la diffusione della genetica nelle popolazioni animali d&#39;elite, e la generazione di animali transgenici come lo studio della spermatogenesi e la biologia SSC con questa tecnica è logisticamente più difficile e costoso rispetto ai roditori. Il trapianto di cellule germinali di specie di grandi dimensioni nei tubuli seminiferi dei risultati topi in colonizationi di cellule del donatore e l&#39;espansione spermatogoni, ma non nella loro piena differenziazione presumibilmente a causa di incompatibilità della cellula ricevente vano somatiche con le cellule germinali di specie filogeneticamente distanti 12. Un approccio alternativo è il trapianto di cellule germinali di specie di grandi dimensioni, insieme con il loro vano circostante somatica. Siamo la prima volta nel 2002, che piccoli frammenti di tessuto testicolare da maschi immaturi trapiantate sotto la pelle dorsale di topi immunodeficienti sono in grado di sopravvivere e sottoporsi a pieno sviluppo con la produzione di sperma fecondazione competente 13. Da allora tessuto testicolare xenotrapianto ha dimostrato di avere successo in molte specie ed è emerso come una valida alternativa per studiare lo sviluppo del testicolo e la spermatogenesi di grandi animali nei topi 14.

I protocolli per il trapianto di cellule germinali e xenotrapianto tessuto testicolare sono descritti. Trapianto di cellule germinali risultati in donatori-derived spermatogenesi nei testicoli dei destinatari e rappresenta un test funzionale ricostituzione per l&#39;identificazione delle cellule staminali spermatogoni (SSC). Tessuto testicolare xenotrapianto riproduce sviluppo dei testicoli e la spermatogenesi di specie diverse donatori in topi riceventi.

Germ trapianto di cellule e di tessuto testicolare xenotrapianto in topi

Il trapianto di cellule germinali è stato sviluppato dal Dr. Ralph Brinster e dai suoi colleghi presso l'Università della Pennsylvania nel 19941,2. Questi studi pionieristici ...

In questo video vengono illustrate due tecniche correlate. La prima è il trapianto di cellule staminali spermatogoniali, o trapianto di SSC; la seconda è lo xenotrapianto di tessuti testicolari. Il trapianto di SSC viene utilizzato per indurre la spermatogenesi a partire dalle SSC del donatore nei testicoli di un ricevente.Questo viene effettuato preparando una sospensione cellulare da testicoli di donatore o da cellule coltivate contenenti cellule staminali spermatogoniali (SSC) provenienti da un donatore con un marcatore transgenico identificabile, come GFP o LAC Z. Successivamente, i testicoli del maschio ricevente vengono esteriorizzati. Il ricevente è stato trattato in modo che i suoi testicoli siano privi di cellule germinali. I dotti deferenti del maschio ricevente vengono quindi isolati e iniettati con le cellule del donatore che sono state mescolate con taan.Colorante blu. Infine, la colonizzazione dell'epitelio seminifero del ricevente. I tubuli seminiferi colonizzati da cellule germinali di donatore risultano evidenti due o tre mesi dopo il trapianto, come osservato in questo esempio mediante colorazione xal dei testicoli del ricevente, che dimostra la colonizzazione da parte di cellule del donatore esprimenti lacZ.La seconda tecnica illustrata in questo video riguarda il trapianto eterologo di tessuto testicolare. Il trapianto di frammenti testicolari viene utilizzato per indurre lo sviluppo testicolare e la spermatogenesi di una specie donatrice, trapiantando frammenti di tessuto testicolare provenienti da donatori immaturi in ospiti murini carenti. Questo viene ottenuto preparando innanzitutto frammenti di tessuto adeguati per il trapianto, prelevati dai testicoli di una specie donatrice di grandi dimensioni, come ad esempio il maiale, come mostrato nell'esempio qui riportato.Il passo successivo consiste nell'orchiectomizzare un topo adulto ricevente immunodeficiente e quindi trapiantare i frammenti di testicolo donatore sotto la cute dorsale del topo ricevente. I topi riceventi svolgono la funzione di incubatori in vivo, consentendo lo sviluppo completo degli xenotrapianti di testicolo entro sei o sette mesi, a seconda della specie donatrice. Il trapianto di cellule staminali spermatogoniali fu sviluppato per la prima volta da Ralph Brinster e dai suoi colleghi presso l'Università della Pennsylvania e fu riportato per la prima volta nel 1994.Da allora ha trovato un'ampia applicazione ed attualmente rappresenta il saggio biologico di riferimento nel campo della biologia delle cellule staminali della linea germinale, utile per rispondere a domande fondamentali in questo settore, come l'identificazione dei percorsi di segnalazione che regolano l'auto-rinnovamento delle cellule staminali. Abbiamo avuto per la prima volta l'idea della xenotrapianto quando abbiamo osservato che il trapianto di cellule staminali di spermatogoni isolate da donatori non roditori, ad esempio suini, primati o esseri umani, in un testicolo di topo, non portava a una spermatogenesi completamente derivata dal donatore. Abbiamo dimostrato che preservare il microambiente del testicolo tramite il trapianto di piccoli frammenti di tessuto testicolare, anziché di cellule germinali isolate, può superare questa limitazione e consentire una completa spermatogenesi derivata dal donatore, proveniente da una specie filogeneticamente distante, in un ospite topo.Questo è stato inizialmente riportato da noi nel 2002. Il protocollo di trapianto di cellule germinali richiede la preparazione della sospensione cellulare da iniettare. Consultare il manoscritto scritto per i dettagli della preparazione.Iniziare la procedura di trapianto anestetizzando il topo ricevente e assicurandosi di una profondità anestetica sufficiente verificando l'assenza di riflesso al dolore. Successivamente, posizionare l'animale in decubito dorsale e preparare chirurgicamente l'area addominale. Praticare un'incisione mediana lunga circa un centimetro per esporre la parete addominale.Sollevare la parete utilizzando pinzette nel punto della linea bianca per evitare lesioni accidentali agli organi addominali. Quindi effettuare un'incisione di mezzo centimetro per esporre la cavità peritoneale con l'aiuto di pinzette fini. Esternare il testicolo tirando la tasca adiposa collegata al testicolo e all'epididimo, e posizionare queste strutture su una scheda indice sterile.Ora aggiungere il colorante trian blue alla sospensione cellulare. Quindi caricare la sospensione cellulare in un tubo di polietilene collegato a una siringa da un millilitro e inserire la pipetta tirata nel tubo. Spingere delicatamente la sospensione cellulare nella pipetta applicando pressione alla siringa.Ora procederemo con il passaggio più critico per il trapianto di SCC, ovvero l'identificazione e la cannulazione dei dotti ENT. Utilizzando un microscopio stereoscopico, identificare i dotti efferenti tra i testicoli e gli EPI e rimuovere delicatamente il tessuto adiposo circostante i dotti. Procedere con attenzione poiché i dotti e la membrana che li circonda sono traslucidi.Stabilizzare i dotti modellandoli con un pezzo triangolare sterile di plastica. Quindi inserire con attenzione la pipetta di iniezione in un dotto all'interno del fascio di dotti di Ferrin. Far avanzare delicatamente la pipetta di alcuni millimetri verso il testicolo.Mantenendo ferma la pipetta di iniezione, iniettare lentamente le cellule mentre il testicolo e i tubuli seminiferi iniziano a riempirsi; mantenere un flusso costante fino a quando quasi tutti i tubuli visibili sulla superficie non saranno riempiti. Non sovraffollare, altrimenti il testicolo diventerà ischemico. A questo punto, reinserire il testicolo nella cavità addominale e ripetere la procedura sull'altro testicolo controlaterale.Al termine, chiudere la parete addominale con punti di sutura in seta 6-0 e chiudere la cute con clip metalliche per ferite. Dopo l'intervento, monitorare il topo su un tappetino riscaldante fino a quando non si sarà ripreso sufficientemente dall'anestesia per essere reintrodotto nel suo contenitore d'origine. La seconda procedura da dimostrare, il trapianto eterologo di tessuto testicolare, prevede l'utilizzo di biopsie testicolari o testicoli integri provenienti da donatori.Nel caso di biopsie, lavare i frammenti di testicolo due o tre volte in mezzo di coltura freddo contenente antibiotici. Dopo ogni lavaggio, centrifugare la sospensione e ricostituire il pellet. In soluzione fresca, trasferire il tessuto lavato in una piastra pulita e tagliare le biopsie in frammenti più piccoli per il trapianto.Utilizzando pinze curve e una lama di bisturi, i testicoli integri richiedono una preparazione più complessa. Iniziare lavando ciascun testicolo con PBS freddo contenente antibiotici, due o tre volte. Successivamente, trasferire i testicoli puliti in una piastra pulita contenente PBS.Successivamente, rimuovere la tunica vaginale praticando un'incisione lungo la superficie ed estrarre i testicoli. Rimuovere tutte le strutture annesse come dotto deferente, dotto dell'epididimo e tessuto connettivo. Lavare una volta i testicoli estratti in PBS freddo e trasferirli in una piastra di coltura contenente PBS.Successivamente, rimuovere con attenzione la tunica albuginea utilizzando una lama di bisturi a forbice. Se il testicolo è molto piccolo, la tunica può essere rimossa spremendo il tessuto testicolare fuori dalla tunica attraverso una piccola incisione in una piccola piastra di coltura riempita di ghiaccio. In mezzo freddo, tritare gradualmente i testicoli in piccoli pezzi come descritto in precedenza.Infine, selezionare i frammenti di tessuto da sottoporre a xenotrapianto e isolarli in piatti di coltura con mezzo freddo di coltura ghiacciato fino al momento del loro utilizzo. Anestetizzare un topo come descritto in precedenza. Successivamente, posizionare il topo su un tappetino riscaldante.Preparare il campo chirurgico sterile rasando i peli sull'addome e sulla schiena. Pulire l'addome con soluzione di etanolo al 70% e Betadine. Per eseguire la castrazione, praticare un'incisione cutanea ventrale mediana lunga da mezzo a un centimetro per esporre la parete addominale.Quindi praticare un'incisione nella parete addominale per esporre la cavità addominale. Esporre con attenzione il testicolo, l'arteria testicolare e l'epididimo come descritto in precedenza. Successivamente, staccare la coda delle EPI dal legamento gubernacolo mediante dissezione ottusa.Successivamente, legare l'arteria testicolare nel dotto deferente insieme al vaso sanguigno utilizzando suture di seta. Quindi sezionare le strutture legate tagliando tra i testicoli e il legamento. Dopo aver ripetuto la procedura per il secondo testicolo, suturare la parete addominale con uno o due punti chirurgici e chiudere l'incisione cutanea con uno o due fermi metallici micc per impiantare gli xenotrapianti ectopici.Posizionare un topo castrato e anestetizzato in posizione prona e preparare un campo chirurgico sterile sulla schiena. Per ogni innesto da inserire, praticare un'incisione cutanea lunga mezzo centimetro su ciascun lato della linea mediana, utilizzando pinze per trattenere un bordo dell'incisione cutanea. Usare forbici per creare una cavità sottocutanea profonda da cinque a dieci millimetri.Separare delicatamente il tessuto connettivo per creare uno spazio sufficientemente profondo per l'innesto, in modo che non venga trattenuto dalla clip di chiusura. Utilizzando pinzette fini, posizionare un frammento di tessuto testicolare nella cavità sottocutanea, tenendo il bordo dell'incisione cutanea con una pinzetta a iris.Chiudere ogni incisione cutanea con una graffetta mic. Successivamente, permettere al topo di riprendersi dall'anestesia su un tappetino riscaldante. Una volta ripreso, trasferire il topo nella sua gabbia di provenienza e continuare a monitorarlo fino a quando non si sarà completamente ripreso.È stato osservato che le cellule staminali di spermatogoni del donatore, trapiantate ed esprimenti un transgene lae, colonizzano i testicoli del ricevente due o tre mesi dopo il trapianto iCal. La colorazione ha rivelato segmenti distintivi di colore blu nei tubuli seminiferi del ricevente. Una colonia ben stabilita presenta un'estesa porzione di colore blu scuro, costituita da segmenti completamente occupati, con due o più strati di cellule blu più vicini al centro alle estremità della colonia.È evidente anche una rete di singole cellule isolate o piccoli gruppi di cellule. Una sezione trasversale della regione dei tubuli seminiferi di colore blu scuro ha rivelato una pervietà ben stabilita e ben organizzata con cellule germinali blu in vari stadi di differenziazione. Nel caso dei tessuti testicolari, frammenti di tessuto testicolare donatore immaturo sono stati trapiantati come xenotrapianti sotto la cute dorsale di topi immunodeficienti ed hanno mostrato capacità di sopravvivere e rispondere alle gonadotropine murine.E di conseguenza, il tessuto testicolare ha subito uno sviluppo completo, inclusa la formazione di spermatozoi in grado di fecondare. Una volta raccolti gli innesti eterologhi di testicolo, sono stati utilizzati per ottenere spermatozoi per la fecondazione in vitro e la produzione di embrioni. Il trapianto di cellule staminali spermatiche promuove il progresso nel campo della biologia delle cellule staminali attraverso lo studio delle interazioni tra cellule staminali e nicchia nel testicolo e lo sviluppo di condizioni di coltura per espandere in vitro le cellule staminali spermatiche dopo lo sviluppo dell'innesto eterologo di tessuto testicolare.La tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia riproduttiva maschile per studiare aspetti della spermatogenesi, della tossicologia riproduttiva e della conservazione del materiale genetico da maschi immaturi in una varietà di specie donatrici che vanno dai topi all'uomo.

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