Name: Indurre crescita dendritica in colture di neuroni simpatici (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: Scopri come indurre la crescita dendritica in colture di neuroni simpatici utilizzando BMP-7 o Matrigel. Questo metodo permette di studiare la morfogenesi neuronale in vitro con elevata efficienza.

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Questo lavoro è stato sostenuto da un finanziamento della National Institutes of Health (borse NS45037 R21 e R01 ES014901).

1. Preparazione del terreno di coltura (media C2) <ol><li> Aggiungere la seguente, nell&#39;ordine elencato, ad una sterile, monouso beuta da 500 ml Erlenmeyer: <table border="1"><tbody><tr><td> Quantità </td><td> Componente </td><td> Concentrazione finale </td></tr><tr><td> 190 ml </td><td> DMEM (glucosio basso) </td><td> N / A </td></tr><tr><td> 10 ml </td><td> acidi grassi liberi BSA (20mg/ml in DMEM) </td><td> 50 ug / ml </td></tr><tr><td> 2,8 ml </td><td> L-Glutammina </td><td> 1,4 mm </td></tr><tr><td> 4 ml </td><td> insulina / transferrina / selenio (100x) </td><td> 10 pg / ml di insulina 5,5 ug / ml di transferrina 38,7 nM selenio </td></tr><tr><td> 0,4 ml </td><td> NGF (125 ug / ml) </td><td> 100 ng / ml </td></tr><tr><td> 200 ml </td><td> Ham F-12 </td><td> N / A </td></tr></tbody></table></li><li> Agitare delicatamente to mix e aliquota 10 ml per tubo in 17 x 100 provette sterili tappo a scatto. </li><li> Conservare a -80 ° C </li><li> Note importanti: <ul type="disc"><li> Scongelare NGF immediatamente prima dell&#39;uso. </li><li> Prima aliquotando la soluzione NGF stock, prerivestimento le pareti interne della pipetta coltura dei tessuti in plastica sierologico con proteine ​​per ridurre l&#39;appiccicosità del NGF alla plastica. Approccio più semplice è Pipettare la miscela DMEM contenente i tempi di BSA diverse. Risciacquare il tubo NGF più volte con la miscela DMEM. </li><li> Aggiungi F-12 scorso a causa cisteina libera può destabilizzare i legami disolfuro nel insulina. </li><li> Non congelare in volumi superiore a 10 ml, perché Capo 4 possono formarsi dei cristalli </li><li> Non congelare e scongelare mezzo di C2 più di 2 volte. </li></ul></li></ol> 2. Preparazione di vetrini <ol><li> Abbiamo trovato che solo belle vetrini tedeschi funziona in modo coerente in questo protocollo (vedi Tabella 1 per l&#39;origine raccomandata e numero di catalogo). </li><li> Aggiungere 75-100 ml di acido nitrico 70% di bottiglie di vetro 300 ml campione con politetrafluoroetilene (PTFE o Teflon) rivestimenti coperchio (Catalogo Fisher # 09-911-765). </li><li> Indossare guanti, goccia coprioggetto uno ad uno nella soluzione di acido nitrico. Aggiungi coprioggetti abbastanza per fare uno strato non più di 2-3 coprioggetto di spessore sul fondo del vaso. </li><li> Scuotere i contenitori con i coprioggetti per 6-8 ore a temperatura ambiente su un set agitatore orbitale per non più di 185 rpm. </li><li> Lavorare in una cappa aspirante, con attenzione decantare l&#39;acido e smaltire secondo le normative locali. Sciacquare coprioggetti una volta con ultra-pura coltura di tessuti-grade acqua, poi aggiungere 75-100 ml di acqua nel contenitore. Vetrini coprioggetto può essere sciacquato più volte se l&#39;acqua diventa torbida. Scuotere a temperatura ambiente per una notte su un set agitatore orbitale per non più di 185 giri al minuto. </li><li> Ripetere la sequenza sopra di acido nitrico / coltura tissutale acqua di grado al giorno per un totale di 3 giorni. </li><li> Decantare la finaledi coltura di tessuti-grade acqua e aggiungere acetone sufficiente a coprire a malapena i coprioggetti. </li><li> Decantare questa acetone e smaltire correttamente. </li><li> Trasferimento coprioggetti ad un piatto di vetro 150 millimetri Petri. Aggiungi acetone sufficiente a coprire a malapena i coprioggetti. Assicurarsi che i coprioggetti sono in un unico strato nel piatto. </li><li> Lasciare evaporare l&#39;acetone durante la notte in una cappa aspirante. </li><li> Coprioggetti Cuocere in forno a 180 ° C per 1,5 ore per sterilizzare. </li></ol> 3. Preparazione di Coprivetrini per la Cultura <ol><li> Il giorno prima della dissezione, aggiungere 1 vetrino coprioggetto (preparato come descritto sopra) a ciascun pozzetto di una piastra a 24 pozzetti coltura tissutale utilizzando una tecnica sterile. Aggiungere 200 pl di sterile poli-D-lisina soluzione (100 mg / ml in 0,5 M tampone Tris, pH 8) a ciascun pozzetto e conservare la piastra a 4 ° C per una notte. </li><li> Il giorno della dissezione, e idealmente prima di iniziare la dissezione, aspirare il poli-D-lisina soluzione da ciascun pozzetto e lavare i pozzetti 5 voltecon tessuto sterile cultura dell&#39;acqua grado. </li><li> Aggiungere 200 ul low-glucosio DMEM ad ogni piatto e conservare nel 37 ° C incubatore. Circa 1 ora prima della placcatura cellule, rimuovere DMEM low-glucosio e aggiungere 250 microlitri medie C2 per bene. Conservare le piastre a 37 ° C inferiore al 5% di CO 2 fino a quando le cellule sono pronte per essere placcato. </li></ol> 4. Dissezione e isolamento del ganglio cervicale superiore <ol><li> Dissociate culture di neuroni simpatici sono di solito preparate dissociazione di gangli cervicali superiore (SCG) raccolti da prenatale (giorni embrionali 19-21) cuccioli di ratto perché ci sono meno cellule gliali. Tuttavia, questo stesso protocollo può essere utilizzato con successo con i primi post-natale (da 1 a 3 giorni) cuccioli di ratto o di cuccioli di topo perinatali. </li><li> Euthanize ratti femmina in gravidanza tramite CO 2 per inalazione. Shave l&#39;addome e lavare la pelle con il 70% di etanolo. Rimuovere le corna uterine in condizioni sterili e mettere le corna uterine in uno sterile 150 millimetri capsula Petri. Evitaredanneggiare l&#39;intestino o altri organi interni della diga durante la dissezione. </li><li> Porre la capsula Petri con i cuccioli su un pan di ghiaccio per anestetizzare i cuccioli embrionali. Staccare gli embrioni liberi della tromba uterina e delle membrane amniotiche. Tagliare il midollo spinale di ogni cucciolo lungo la linea mediana sotto la spalla per l&#39;eutanasia dei cuccioli. Questo taglia anche la vena cava, che riduce sanguinamento dalla carotide durante la dissezione del SCG. Una volta sezionato libera del corno uterino, embrioni posto in una sterile Leibovitz L-15 (o qualsiasi mezzo tamponato aria) addizionato con penicillina e streptomicina. </li><li> Mettere gli embrioni sulla schiena su un piatto da 150 millimetri Petri piena a metà di Sylgard. Utilizzando sterili aghi calibro 20, pin il torace e la testa, con delicatezza iperestensione del collo, che facilita la dissezione del SCG. </li><li> Effettuare una incisione mediana lungo il collo a livello delle clavicole per rivelare le ghiandole sottomandibolari. Rimuovere le ghiandole con pinza sottile (no. 4 o no. 5 Dumont) per esporre lo strato muscolare. </li><li> Utilizzare le pinze sottili per tagliare il muscolo sternocleidomastoideo vicino alla clavicola. Poi sollevare delicatamente e incidere il muscolo omo-ioideo accanto alla trachea. Questo muscolo è molto sottile, in modo da evitare di tagliare troppo in profondità per evitare di strappare l&#39;arteria carotide sottostante e SCG. Una volta che questi strati muscolari vengono rimossi, l&#39;arteria carotide e il nervo vago deve essere chiaramente visibile. </li><li> Il SCG si trova appena sotto la biforcazione della carotide. Uso pinza sottile (n. 4 o no. 5), smussare sezionare il tessuto lontano da entrambi i lati della carotide per esporre il ganglio. Utilizzo di 2 pinza sottile, afferrare la carotide appena sopra e sotto le estremità rostrale e caudale di SCG, rispettivamente, per rimuovere la sezione della carotide sovrastante il SCG così come la stessa SCG. È probabile che il ganglio nodoso, che si trova a fianco della SCG in questa fase di sviluppo, verrà rimosso anche in questa fase. I gangli nodoso può essere identified per la sua forma rotonda e il nervo vago grande sporgente da esso. Questo si trova lungo uno dei rami della carotide. Al contrario, il SCG è a mandorla e si trova direttamente sotto la biforcazione della carotide. Posizionare il tessuto sezionato in una piastra da 35 mm sterile coltura contenente L-15 e antibiotici. Rimuovere il SCG da tutti i cuccioli prima di passare alle fasi successive. </li><li> Utilizzando una pinza sottile per separare delicatamente il SCG dalla carotide e gli eventuali altri tessuti rimossi durante la dissezione (in particolare il nervo vago e ganglio nodoso). Utilizzare una pinza sottile per rimuovere la capsula dal gangli. Questo riduce notevolmente il numero di cellule non neuronali in coltura. Trasferire la gangli all&#39;altro sterile piastra da 35 mm contenente L-15. </li><li> Per dissociare il SCG, rimuovere il mezzo L-15 e sostituirlo con 2 Collagenasi ml (concentrazione finale 1 mg / ml) / dispasi (concentrazione finale 5 mg / ml) di calcio e magnesio privo di Hank soluzione salina bilanciata. IncubaTE a 37 ° C per 40 minuti. </li><li> Trasferire il SCG ad un tubo da centrifuga sterile 15 ml e portare il volume fino a 10 ml con L-15 integrato con BSA (concentrazione finale 1-2 mg / ml). Centrifugare a 200 X g a temperatura ambiente per 5 minuti. Eliminare il surnatante e lavare ancora una volta con L-15 integrato con BSA. </li><li> Dopo il secondo lavaggio, rimuovere tutti L-15 e risospendere il gangli in ~ 2 ml di terreno C2. Triturare le cellule utilizzando un incendio lucidato piegato punta della pipetta, assicurarsi che la pipetta è rivestita con BSA/L15 prima di triturazione per ridurre al minimo delle cellule attaccare al vetro. Triturare 3-4 volte delicatamente. Lasciate che i grandi ciuffi decantare per circa 1 minuto e trasferire la sospensione di cellule in una provetta da 15 ml. Aggiungere altri supporti C2 alla SCG rimanente e triturare. Dopo aver lasciato le macchie risolvere, trasferire la sospensione cellulare dalla triturazione secondo che ha raccolto dopo la prima triturazione. Ripetere questa operazione più volte fino a quando i gangli sono per lo più dissociati. Discard eventuali grumi rimasti dopo la triturazione quarto. </li><li> Per cellule dissociate da un disordine dei cuccioli di ratto (tipicamente 12-16 cuccioli), portare il volume totale del mezzo in sospensione cellulare di 8-10 ml aggiungendo ulteriore mezzo C2. Risospendere delicatamente le cellule usando una pipetta e rimuovere una piccola aliquota per determinare la densità cellulare. Regolare il volume della sospensione cellulare per ottenere 2X la densità cellulare desiderata nella coltura, e quindi, avendo cura di mantenere le cellule in sospensione, aliquota 250 ml di sospensione cellulare per pozzetto. Per gli studi morfometrici della crescita dendritica, di solito le cellule della piastra a bassa densità (~ 5 x 10 4 cellule per pozzetto) in piastre da 24 pozzetti. </li><li> Il nostro laboratorio incuba culture SCG in essiccatori di vetro piuttosto che direttamente in un incubatore CO 2. Lo facciamo perché neuroni simpatici coltivate in terreno privo di siero prestazioni migliori con un po &#39;più alta concentrazione di CO 2 (circa il 6,5%). Inoltre non usare gli antibiotici in omezzi ur quanto inibisce la crescita dei neuriti e le culture mantenendo nelle essiccatori sembra ridurre al minimo la diffusione della contaminazione se si sviluppa in un sottoinsieme di culture. Utilizzando questo sistema, si mantengono normalmente culture SCG per un massimo di 8 settimane. Una volta dorati, culture SCG sono immessi sul piatto di porcellana in essiccatore essiccatori di vetro contenenti acqua sterile sul fondo. Circa 120 ml di CO 2 viene iniettato nel essiccatore prima di sigillare la chiuse e ponendo l&#39;essiccatore intero in un incubatore di 35,5 ° C. </li></ol> 5. Alimentazione e manutenzione delle Culture <ol><li> Le culture sono generalmente alimentate 3 volte a settimana, con il primo cambio dei media si verificano 24 ore dopo la placcatura. Utilizzando una sterile piegato punta della pipetta, estrarre delicatamente circa la metà dei mezzi di comunicazione per pozzetto. Utilizzando un pulito sterile piegate punta della pipetta, sostituire il volume di terreno fresco rimosso con C2. </li><li> Per eliminare le cellule non neuronali dalla cultura, l&#39;anti-mitotico agente cytosine-D-arabinofuranoside (ARA-C, concentrazione finale di 1-2 pM) è tipicamente aggiunto al mezzo di coltura al primo supporto di scambio (ad esempio, 24 ore dopo placcatura) per 48 ore. Questa concentrazione di ARA-C è generalmente sufficiente per eliminare tutte le cellule non neuronali. Se, oltre ARA-C è necessario un trattamento, si raccomanda che questi essere fatto ogni poppata altra per minimizzare gli effetti tossici sui neuroni. </li></ol> 6. Induzione della crescita dendritica con Matrigel o BMP-7 <ol><li> Per indurre crescita dendritica, Matrigel o BMP-7 è aggiunta a colture dopo cellule non neuronali sono stati eliminati e ARA-C livelli le colture sono significativamente ridotte. Tipicamente, si aggiunge Matrigel o BMP-7 al mezzo giorno 5 in vitro, ma crescita dendritica può essere indotta da Matrigel o BMP-7 aggiunto in qualsiasi punto temporale in vitro. Matrigel o BMP-7 è aggiunto al mezzo C2 e colture sono alimentati come descritto sopra. </li><li> La crescita Matrigel e BMP-indotta dendritica è il tempoe concentrazione-dipendente. Per effetti massimi, Matrigel è aggiunto a C2 ad una concentrazione finale di 50-75 pg / ml; BMP-7 è aggiunto al mezzo C2 ad una concentrazione finale di 50 ng / ml. Matrigel concentrazioni superiori a 100 pg / ml o BMP-7 concentrazioni superiori a 100 ng / ml sono stati notati per causare tossicità neuronale. Processi dendritiche (come determinato da criteri morfologici) risulteranno approssimativamente 48 ore dopo l&#39;esposizione iniziale di Matrigel o BMP-7 a concentrazioni di massima efficacia. Per indurre una robusta crescita dendritica, le culture sono alimentati con BMP-7 contenente il mezzo ad ogni poppata. Risultati equivalenti sono stati ottenuti utilizzando BMP 2, 4, 5 e 6 a concentrazioni paragonabili 20,21. </li></ol> 7. Analisi immunocitochimica di BMP-7-indotta Growth Dendritic <ol><li> Quando il grado desiderato di arborizzazione dendritica è stato raggiunto, colture vengono fissati con paraformaldeide al 4% in tampone fosfato 0,1 M. La migliore fissaggio è unchieved mezzo sostituendo il mezzo in pozzo con 4% paraformaldeide e ripetere questo passo 3-5 volte 10-15 minuti. </li><li> Risciacquare culture sostituendo il mezzo paraformaldeide al 4% con tampone fosfato isotonico (PBS) e ripetere questo passo tre volte più di 10 - 15 minuti. </li><li> Rimuovere il PBS e aggiungere 200 pl 0,1% Triton X-100 in PBS ad ogni pozzetto per 5 minuti a temperatura ambiente per permeabile alle cellule. </li><li> Rimuovere soluzione Triton tramite aspirazione e aggiungere 200 pl per pozzetto di soluzione tampone di bloccaggio (PBS supplementato con 3-5% BSA e siero di capra 1%). Incubare per 20-30 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Rimuovere il tampone bloccante e aggiungere l&#39;anticorpo primario, proteina associata ai microtubuli-2 (MAP2) diluito 1:2000 - 1:5000 in tampone di bloccaggio. Incubare colture per 1 ora a temperatura ambiente o per una notte a 4 ° C. </li><li> Rimuovere la soluzione primaria di anticorpi, lavare le culture con PBS per tre volte nell&#39;arco di 15 minuti a temperatura ambiente. </li><li>Incubare le colture con l&#39;anticorpo secondario diluito in PBS integrato con 1% BSA per 1-2 ore a temperatura ambiente al buio. </li><li> Rimuovere la soluzione di anticorpo secondario e lavare le culture con PBS tre volte più di 10-15 minuti a temperatura ambiente al buio. </li><li> Coprioggetti Mount su vetro scivola lato della cella verso il basso in una goccia di mezzo di montaggio acquoso a pH appropriato per il fluorocromo tag per l&#39;anticorpo secondario. Mantenere i vetrini a temperatura ambiente per una notte per permettere al mezzo di montaggio secco. Conservare i vetrini a 4 ° C fino imaging. </li><li> Lasciare i vetrini raggiungano la temperatura ambiente prima di imaging. Acquisire immagini fluorescenti utilizzando un microscopio a contrasto di fase dotato di epifluorescenza. In genere, il pergolato dendritica completo di un singolo neurone può essere catturata usando un obiettivo 20X e di appositi filtri. </li></ol> 8. Risultati rappresentativi Neuroni simpatici dissociati dal SCG di perinatale rats e coltivate in assenza di cellule gliali e siero gangliare non estendere MAP2 processi immunopositive (figura 1), ma piuttosto, in genere si estendono solo un singolo processo assonale 14,15. L&#39;esposizione a BMP-7 (Figura 1) o Matrigel induce la formazione di numerosi processi che soddisfano i criteri morfologici, biochimici e funzionali di dendriti 17,18. Il dendrite-promuovere l&#39;attività di una Matrigel o BMP-7 è la concentrazione e tempo-dipendente 17,18,20. Crescita dendritica massima è osservata usando concentrazioni di Matrigel tra 50 e 75 pg / ml o BMP-7 tra 30 e 100 ng / ml, e metà massimali effetti sono tipicamente osservati a BMP-7 concentrazioni di circa 2 ng / ml. Tuttavia, cambiamenti significativi nella crescita dendritica possono essere rilevate con BMP-7 concentrazioni basse come 300 pg / ml. La risposta a uno dendritico Matrigel o BMP-7 è relativamente lento, con &lt;50% dei neuroni formare un secondo processo entro 24 ore dopo l&#39;esposizione ai dendriti-p<html> ROMUOVERE agente. Tuttavia, entro 3 giorni dopo l&#39;iniziale BMP-7 di esposizione, quasi tutti i neuroni rispondono ad un massimo di efficacia Matrigel o BMP-7 concentrazioni. Il numero di dendriti per neuroni continua ad aumentare con l&#39;esposizione continua a BMP-7, con la maggior parte dei cambiamenti che si verificano durante i primi 10 giorni di trattamento. Dopo 4 settimane, BMP-7-neuroni hanno tipicamente trattati con 6-8 dendriti primari che presentano rami secondari, terziari e anche quaternaria dendritiche 17. Questo aumento arbor dendritica avviene in assenza di qualsiasi variazione significativa crescita assonale, e risposte dendritiche analoghe possono essere provocato usando concentrazioni simili di BMP 2, 4, 5 o 6 20,21. Crescita dendritica può anche essere indotta da co-coltura con neuroni simpatici endogene cellule gliali gangliari 15,22, tuttavia, la risposta dendritica è significativamente più lento in queste condizioni. . Jpg &quot;/&gt; Figura 1. BMP-7 promuove la crescita dendritica in colture di neuroni simpatici. Cellule non neuronali sono stati eliminati dal SCG colture mediante trattamento con anti-mitotico per 48 ore dall&#39;inizio il giorno 2 in vitro. A partire dal giorno 5 in vitro, colture sono stati trattati con mezzo di controllo (A) o medio integrato con BMP-7 a 50 ng / ml (B). Il giorno 11 in vitro (dopo 5 giorni di trattamento BMP), le colture sono state immunomacchiate con mAb contro MAP2, una proteina che si trova principalmente nei dendriti e somata neuronale. Come mostrato in rappresentativi microfotografie fluorescenza, neuroni coltivati ​​in condizioni di controllo mancano dendriti come evidenziato dalla mancanza di MAP-2 dendriti immunopositive processi (A), al contrario, neuroni esposti a BMP-7 (B) hanno tipicamente diverse rastremato MAP-2 immunopositive dendriti.

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<li>Beck, H. N., Drahushuk, K., Jacoby, D. B., Higgins, D., Lein, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+morphogenetic+protein-5+%28BMP-5%29+promotes+dendritic+growth+in+cultured+sympathetic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Bone morphogenetic protein-5 (BMP-5) promotes dendritic growth in cultured sympathetic neurons.</a> BMC Neurosci. 2, 12-12 (2001).</li>
<li>Guo, X., Rueger, D., Higgins, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteogenic+protein-1+and+related+bone+morphogenetic+proteins+regulate+dendritic+growth+and+the+expression+of+microtubule-associated+protein-2+in+rat+sympathetic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">Osteogenic protein-1 and related bone morphogenetic proteins regulate dendritic growth and the expression of microtubule-associated protein-2 in rat sympathetic neurons.</a> Neurosci. Lett. 245, 131-134 (1998).</li>
<li>Lein, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glia+induce+dendritic+growth+in+cultured+sympathetic+neurons+by+modulating+the+balance+between+bone+morphogenetic+proteins+%28BMPs%29+and+BMP+antagonists%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glia induce dendritic growth in cultured sympathetic neurons by modulating the balance between bone morphogenetic proteins (BMPs) and BMP antagonists.</a> J. Neurosci. 22, 10377-10387 (2002).</li>
<li>Higgins, D., Lein, P., Osterhout, D., Johnson, M. I. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHiggins%2C+D+%22Culturing+Nerve+Cells%22">Culturing Nerve Cells</a>. Banker, G., Goslin, K. , MIT Press. 177-205 (1991).</li>
<li>Bruckenstein, D. A., Higgins, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+differentiation+of+embryonic+rat+sympathetic+neurons+in+tissue+culture.+II.+Serum+promotes+dendritic+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Morphological differentiation of embryonic rat sympathetic neurons in tissue culture. II. Serum promotes dendritic growth.</a> Dev. Biol. 128, 337-348 (1988).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

I vantaggi di questo modello includono: (a) le colture sono costituiti da una popolazione omogenea di neuroni simpatici privi di altri tipi di cellule 17,23, (b) i requisiti per il fattore di crescita di neuroni simpatici sono ben stabiliti, che consente di utilizzare mezzo definito, e una varietà di supporti definiti, e substrati funzionano bene per la crescita e mantenimento neuroni simpatici 23, (c) neuroni in queste colture rispondono uniformemente alla dendrite-attività di promozione di Matrig...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Comments </td></tr><tr><td> Vetrini coprioggetto </td><td> Bellco </td><td> 1943-10012 </td><td> 12 Turno Coverslip mm # 1 Spessore, vetro tedesco </td></tr><tr><td> Bent punta di pipette </td><td> Bellco </td><td> 1273-50003 </td><td></td></tr><tr><td> Poly-D-lisina </td><td> Sigma </td><td> P0899-100mg </td><td> Soluzione stock 1 mg / ml </td></tr><tr><td> Acqua distillata </td><td> Gibco </td><td> 15230 </td><td></td></tr><tr><td> Belle pinza Dumont no. 4 e 5 </td><td> Strumenti Scienza Belle (FST) </td><td> 11252-30 11241-30 </td><td></td></tr><tr><td> 20-gauge aghi </td><td> Becton Dickinson </td><td> 305176 </td><td></td></tr><tr><td> Leibovitz L-15 </td><td> Invitrogen </td&gt; <td> 11415 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenasi </td><td> Worthington </td><td> 4176 </td><td> 1 mg / ml </td></tr><tr><td> Dispasi </td><td> Roche </td><td> 04942078001 </td><td> 5 mg / ml </td></tr><tr><td> Sale di Hank soluzione equilibrata (-Ca, Mg-) </td><td> Invitrogen </td><td> 14185-052 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM glucosio basso </td><td> Invitrogen </td><td> 11885 </td><td></td></tr><tr><td> L-Glutammina </td><td> Invitrogen </td><td> 25030 </td><td> 20 mM </td></tr><tr><td> Insulina / transferrina / Selenium </td><td> Invitrogen </td><td> 51500-056 </td><td> 100X </td></tr><tr><td> Di acidi grassi liberi BSA </td><td> Calbiochem </td><td> 126609 </td><td></td></tr><tr><td> NGF </td><td> Harlan Bioproducts </td><td> 5017 </td><td></td></tr><tr><td> Ham F-12 medio nutrienti (F-12) </td><td> Invitrogen </td><td> 11765 </td><td&gt; </td></tr><tr><td> Citosina arabinoside </td><td> Sigma </td><td> C1768 </td><td></td></tr><tr><td> Matrigel </td><td> BD Biosciences </td><td> 356234 </td><td> Evitare ripetuti cicli gelo-disgelo </td></tr><tr><td> BMP-7 </td><td> R &amp; D Systems Curis, Inc. </td><td> 345-BP BMP7-07H </td><td> BMP 4, 5 e 6 funzionare altrettanto bene come BMP-7 e sono talvolta più facile da ottenere commercialmente </td></tr><tr><td> Paraformaldeide </td><td> Sigma </td><td> P6148 </td><td></td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Pescatore </td><td> BP151-500 </td><td></td></tr><tr><td> Topo anti-ratto MAP2 anticorpo </td><td> Sternberg monoclonali Inc. </td><td> SMI52 </td><td> 1/5000 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 546 di capra anti-topo </td><td> Invitrogen </td><td> A11003 </td><td> 1/10000 </td></tr><tr><td> Mezzi di montaggio </td><td> Prolungare Probes kit molecolare Antifade </td> &lt;td&gt; P7481 </td><td></td></tr></tbody></table>

indurre crescita dendritica in colture di neuroni simpatici

Inducing Dendritic Growth in Cultured Sympathetic Neurons

La forma del dendritico pergolato determina l&#39;ingresso totale sinaptica un neurone può ricevere 1-3, e influenza i tipi e la distribuzione di questi ingressi 4-6. Modelli alterati di crescita dendritica e plasticità sono associate con una compromissione della funzione neuro-comportamentale in modelli sperimentali 7, e si pensa di contribuire a sintomi clinici osservati in entrambi i 8-10 disturbi dello sviluppo neurologico e malattie neurodegenerative 11-13. Queste osservazioni sottolineano l&#39;importanza funzionale di regolare con precisione la morfologia dendritica, e suggeriscono che l&#39;individuazione di meccanismi che controllano la crescita dendritica non solo promuovere la comprensione di come è regolata la connettività neuronale durante lo sviluppo normale, ma possono anche fornire indicazioni sulle nuove strategie terapeutiche per diverse patologie neurologiche. Studi meccanicistici di crescita dendritica sarebbe molto facilitato dalla disponibilità ofa modello di sistema che permette ai neuroni di essere sperimentalmente passa da uno stato in cui non si estendono ai dendriti quello in cui elaborare un pergolato dendritico paragonabile a quella del loro controparti in vivo. Colture primarie di neuroni simpatici dissociate dai gangli cervicale superiore (SCG) di roditori perinatali fornire tale modello. Quando coltivate in mezzo definito in assenza di cellule gliali e siero gangliare, neuroni simpatici estendere un unico processo che è assonale, e questo stato unipolare persiste per settimane a mesi in coltura 14,15. Tuttavia, l&#39;aggiunta di una proteina morfogenetica ossea-7 (BMP-7) 16,17 o Matrigel 18 al mezzo di coltura innesca questi neuroni di estendere i processi multipli che soddisfano i criteri morfologici, biochimici e funzionali di dendriti. Neuroni simpatici dissociati dal SCG di roditori perinatali e coltivate in condizioni definite sono una popolazione omogenea di 19 neuroniche rispondono in modo uniforme al dendrite-promuovere l&#39;attività di Matrigel, BMP-7 e BMP altri decapentaplegic (DPP) e 60A sottofamiglie 17,18,20,21. È importante, Matrigel e BMP-indotta la formazione di dendrite si verifica in assenza di variazioni nella sopravvivenza cellulare o crescita assonale 17,18. Qui, descriviamo come impostare dissociate culture di neuroni simpatici derivati ​​dalla SCG di ratti perinatali in modo che siano rispondenti alle selettivo dendrite-promuovere attività di Matrigel o BMP.

Noi descriviamo un protocollo per l&#39;utilizzo di proteine ​​morfogenetiche dell&#39;osso-7 (BMP-7) o Matrigel per indurre selettivamente la crescita dendritica in primarie neuroni simpatici dissociate dai gangli cervicale superiore (SCG) di ratti perinatali.

Indurre crescita dendritica in colture di neuroni simpatici

La forma dell'arborizzazione dendritica determina l'input sinaptico totale che un neurone può ricevere 1-3 e influenza i tipi e la distribuzione di tali input...

Lo scopo di questa procedura è coltivare neuroni simpatici in modo da poter manipolare la loro crescita dendritica. Questo risultato si ottiene isolando innanzitutto i gangli cervicali superiori da cuccioli di roditore perinatali in condizioni sterili. Il secondo passaggio consiste nel dissociare i gangli per ottenere una sospensione monocellulare, che viene poi seminata su substrati preparati.Mezzo definito privo di siero. Successivamente, dopo aver trattato le colture con agenti anti-mitotici per eliminare le cellule non neuronali, trattare le colture con BMP o matrigel per indurre la crescita dendritica. Infine, si utilizza una mappatura mediante immunoreattività doppia per evidenziare i dendriti estesi dei neuroni simpatici in coltura.Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la coltura primaria di neuroni ippocampali, è che è possibile manipolare lo stato morfologico dei neuroni DYS in modo tale che meno del 5% dei neuroni in coltura abbia dendriti, oppure più del 95% dei neuroni in coltura mostri una marcata crescita assonale. Per preparare le colture associate del ganglio cervicale superiore (SCG) da cuccioli di ratto prenatali all'età di 19-21 giorni embrionali, rasare innanzitutto l'addome di un ratto gravido sacrificato, detergere la cute con etanolo al 70%, quindi rimuovere le corna uterine in condizioni sterili evitando di danneggiare l'intestino o altri organi interni. Posizionare le corna uterine in una piastra di Petri sterile da 150 millimetri. Successivamente, trasferire la piastra di Petri in un contenitore contenente ghiaccio.Per anestetizzare i cuccioli embrionali prima dell'eutanasia, recidere il midollo spinale lungo la linea mediana sotto la spalla. Questo interrompe anche la vena cava, riducendo il sanguinamento dall'arteria carotidea. Durante la dissezione del ganglio cervicale superiore (SCG), mantenere gli embrioni in un mezzo Leibovitz L-15 sterile integrato con penicillina e streptomicina. Successivamente, trasferire gli embrioni in una piastra di Petri da 150 millimetri, riempita per metà con Sylgard, posizionandoli in posizione supina.Utilizzare aghi sterili da 20 gauge per fissare il torace e la testa, iperestendendo delicatamente il collo per facilitare la dissezione del ganglio cervicale superiore (SCG) al microscopio. Praticare un'incisione mediana lungo il collo a livello delle clavicole per esporre le ghiandole sottomandibolari. Rimuovere le ghiandole utilizzando pinzette fini per esporre lo strato muscolare.Quindi recidere il muscolo sternocleidomastoideo in prossimità della clavicola, sollevando delicatamente il muscolo omoioideo accanto alla trachea. Questo muscolo è molto sottile, quindi evitare di tagliare troppo in profondità, il che potrebbe lacerare l'arteria carotidea sottostante e il ganglio carotideo superiore (SCG). Una volta rimossi questi strati muscolari, l'arteria carotidea e il nervo vago dovrebbero essere chiaramente visibili.Il ganglio cervicale superiore si trova appena al di sotto della biforcazione dell'arteria carotide. Dissezionare il tessuto da entrambi i lati dell'arteria carotide utilizzando pinzette fini per esporre il ganglio. Successivamente, utilizzare due pinzette fini per afferrare l'arteria carotide appena sopra e sotto rispettivamente il polo rostrale e caudale del ganglio cervicale superiore.Per rimuovere il tratto dell'arteria carotidea situato al di sopra del ganglio stellato cervicale (SCG) e lo stesso SCG, è probabile che in questo passaggio venga asportato anche il ganglio nodoso, che in questa fase dello sviluppo si trova adiacente allo SCG. Posizionare il tessuto dissezionato in una piastra sterile da 35 millimetri contenente mezzo L 15 e antibiotici. Successivamente, rimuovere lo SCG da tutti i cuccioli prima di procedere ai passaggi successivi.Successivamente, separare delicatamente il ganglio cervicale superiore dall'arteria carotide e da qualsiasi altro tessuto. Rimuovere durante la dissezione. Rimuovere la capsula dai gangli.Quindi trasferire i gangli in un'altra piastra sterile da 35 millimetri contenente mezzo L-15. Per dissociare il ganglio cervicale superiore, rimuovere il mezzo L-15 e sostituirlo con soluzione di Hank priva di calcio e magnesio contenente collagenasi.Quindi incubare a 37 gradi Celsius per 40 minuti. Successivamente, trasferire il SCG in un tubo conico sterile da 15 millilitri per centrifuga. Portare il volume a 10 millilitri con L 15 integrato con BSA ad una concentrazione finale di uno-due milligrammi per millilitro.Centrifugare a 200 × g a temperatura ambiente per cinque minuti. Dopo cinque minuti, eliminare il soprannatante e lavare nuovamente una volta con L 15 integrato con BSA dopo il secondo lavaggio. Rimuovere il mezzo L 15 e sospendere i gangli in due millilitri di coltura.Passare le cellule da tre a quattro volte attraverso una pipetta con punta piegata e levigata a fiamma. Assicurarsi che la pipetta sia stata rivestita con BSAL 15 prima della TRI per ridurre al minimo l'adesione delle cellule al vetro. Lasciare sedimentare gli aggregati più grandi per circa un minuto, quindi trasferire la sospensione cellulare in un tubo conico da 15 millilitri.Aggiungere successivamente ulteriore mezzo di coltura al SCG rimanente e al tri rate. Dopo che i grumi si sono depositati, trasferire la sospensione cellulare dal secondo tri a quella raccolta dopo il primo tri. Ripetere questo processo più volte fino a quando i gangli sono per la maggior parte dissociati.Scartare eventuali grumi rimanenti dopo la quarta centrifugazione. Per le cellule dissociate da un litro di ratto nati da poco, il volume totale del mezzo nella sospensione cellulare deve essere portato a otto-dieci millilitri. Aggiungendo ulteriore mezzo di coltura, risospendere delicatamente le cellule utilizzando una pipetta. Successivamente, prelevare un piccolo aliquota per la determinazione della densità cellulare.Regolare il volume della sospensione cellulare in modo da ottenere una densità cellulare doppia rispetto a quella desiderata nella coltura. Successivamente, aliquotare 250 microlitri di sospensione cellulare per pozzetto. Per gli studi morfometrici della crescita dendritica, di solito si seminano le cellule in piastre da 24 pozzetti a bassa densità, circa cinque per 10 alla quattro cellule per pozzetto.Quindi posizionare le colture di SCG sul piatto di porcellana per essiccatore all'interno dell'essiccatore di vetro contenente acqua sterile. Iniettare circa 120 millilitri di anidride carbonica nell'essiccatore prima di sigillarlo. Successivamente, inserire l'intero essiccatore in un incubatore e impostarlo a 35,5 gradi Celsius.In questa procedura, alimentare la coltura sostituendo metà del mezzo 24 ore dopo il seeding e ripetere tre volte alla settimana per eliminare le cellule non neuronali dalla coltura. L'agente anti-mitotico, RRC, a una concentrazione di uno-due micromolari, viene solitamente aggiunto al mezzo di coltura in questo momento.Quindi aggiungere il mezzo di coltura fresco con RSC in ogni pozzetto e coltivare per 48 ore per indurre la crescita dendritica dopo che le cellule non neuronali sono state eliminate e il livello di RSC è stato significativamente ridotto. Aggiungere matrigel o BMP sette al mezzo di coltura al quinto giorno. In vitro, alimentare la coltura come descritto in precedenza, mostrato qui come un neurone cresciuto in condizioni di controllo con assenza di dendriti, evidenziata dall'assenza di prolungamenti immuno-positivi per MAP due.Al contrario, questo neurone, esposto al BMP7, presenta diversi dendriti immuno-positivi per MAP2 a forma conica, mostrati qui. I neuroni simpatici in coltura vengono mantenuti per cinque-sette giorni prima del trattamento con BMP7 e successivamente trattati con BMP7 a una concentrazione di 30-50 nanogrammi per millilitro per due giorni. Si noti l'inizio della crescita dendritica.Le colture crescono per sette a 14 giorni in assenza di bmp.Seven. Continuano a mostrare esclusivamente crescita assonale, mentre le colture trattate con BMP.Seven a 30-50 nanogrammi per millilitro per sette a 14 giorni.Mostrano una crescita dendritica robusta. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare il ganglio cervicale superiore (SCG). Preparare una coltura dissociata di neuroni simpatici per lo studio della morfogenesi neuronale e manipolare sperimentalmente la crescita dendritica.

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Questo è un protocollo che descrive come isolare e colture primarie di neuroni simpatici gangli cervicale superiore (SCG) di cuccioli di ratto appena nati.

Protocollo per la coltura neuroni simpatico da Rat gangli cervicale superiore (SCG)

Numerosi studi recenti hanno identificato mutazioni di proteine ​​sinaptiche associate a patologie cerebrali. Colture di neuroni corticali primarie offrono una grande flessibilità in sede di esame gli effetti di queste malattie proteine ​​associate spine dendritiche sulla morfologia e la motilità.

Analisi di Morfologia spine dendritiche in colture di neuroni del SNC

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Generazione di neuroni simpatici postgangliari da cellule staminali pluripotenti umane

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Co-coltura di cellule di Schwann con neuroni DRG su una membrana pre-stirata

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Stimolazione dei neuroni sensoriali del ganglio della radice dorsale utilizzando un agonista del recettore dei neuropeptidi

Il protocollo attuale presenta procedure sperimentali per stimolare macrofagi coltivati a essere dotati di capacità di rilasciare fattori molecolari che promuovono la conseguenza del neurite. Trattamento dell'accampamento per la co-colture di neuroni-macrofago induce i macrofagi a produrre medium condizionato che possiede l'attività la conseguenza del neurite forte.

Neurone-macrofago co-colture per attivare i macrofagi che secernono fattori molecolari con attività di neuriti

Descriviamo l'isolamento, la dispersione e la placcatura delle cellule primarie della polpa dentale (DP) con neuroni trigeminali (TG) coltivati in cima ai filtri transwell sovrastanti. Le risposte cellulari delle cellule DP possono essere analizzate con l'immunofluorescenza o l'analisi RNA/proteina. L'immunofluorescenza dei marcatori neuronali con microscopia confocale consente l'analisi delle risposte di escrescenza neurite.

Un metodo di co-cultura per studiare l'escrescenza neurite in risposta ai segnali paracrini dentali

In questo protocollo, descriviamo una strategia di differenziazione stabile e altamente efficiente per la generazione di neuroni simpatici postganglionici dalle cellule staminali pluripotenti umane. Questo modello renderà i neuroni disponibili per l'uso di studi di disturbi autonomici multipli.

Differenziazione efficiente dei neuroni simpatici postganglionici utilizzando cellule staminali pluripotenti umane in condizioni di coltura senza alimentatore e definite chimicamente

Questo articolo descrive l'isolamento e la tatura dei neuroni simpatici del ratto embrionale dai gangli cervicali superiori. Fornisce anche protocolli dettagliati per la colorazione immunocitomica e per la preparazione di estratti neuronali per l'analisi spettrometrica di massa.

Ticare i neuroni simpatici dei ratti da Ganglia cervicale superiore embrionale per l'analisi morfologica e proteomica

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Indurre crescita dendritica in colture di neuroni simpatici

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