VisioTracker, un approccio innovativo automatizzato di analisi oculomotoria

Il VisioTracker è un sistema automatizzato per l'analisi quantitativa di prestazioni visive dei pesci adulti e larve piccole basa sulla registrazione dei movimenti oculari. È dotato di un controllo completo sulle proprietà stimolo visivo e analisi in tempo reale, consentendo di alto-rendimento di ricerca in settori quali lo sviluppo del sistema visivo e la funzione, farmacologia, studi di circuiti neurali e l'integrazione senso-motoria.

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di valutare comportamentalmente la funzione del sistema visivo in larve e pesci zebra adulti al fine di identificare rapidamente larve mutanti con difetti del sistema visivo o di confrontare le proprietà del sistema visivo di animali wild type e mutanti o trattati con morph. Ciò si ottiene limitando prima i movimenti del corpo dell'animale da esperimento. Le larve sono incorporate nella metilcellulosa e i pesci adulti vengono anestetizzati e inseriti in un dispositivo di immobilizzazione.

Al prossimo posto, il corpo dell'animale trattenuto nel tracker Vizio al centro di uno schermo a forma di tamburo. Strisce verticali in bianco e nero vengono proiettate all'interno di questo schermo utilizzando un proiettore di luce digitale. Le posizioni degli occhi vengono quindi registrate e analizzate automaticamente dal pacchetto software Vizio Tracker, che calcola anche le velocità degli occhi in tempo reale.

Il passaggio finale consiste nell'elaborare i dati ottenuti, mettere in relazione la velocità oculare con le proprietà dello stimolo visivo e calcolare la velocità media dell'occhio e l'errore standard per ciascuna condizione sperimentale. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulle proprietà del sistema visivo delle larve e dei pesci zebra adulti, può essere applicato anche ad altri organismi modello come medica, kpi e praticamente qualsiasi altra specie di piccole T. Ho avuto l'idea di questo metodo per la prima volta quando abbiamo usato la risposta cinetica ottica per lo screening delle larve delle piante e mi sono subito interessato ai dati delle larve, non completamente cieche, ma piuttosto ipovedenti.

Tali larve di Newton influenzano potenzialmente gli aspetti dell'elaborazione visiva. Il sistema include un dispositivo di immobilizzazione per piccoli pesci posizionato sotto una videocamera di alta qualità, dotata di obiettivo zoom. Il contenitore del pesce è circondato da uno schermo a tamburo su cui vengono proiettati modelli di stimolo generati al computer.

I movimenti oculari vengono registrati utilizzando la fotocamera e analizzati automaticamente dal pacchetto software Vizio Tracker in tempo reale. Al fine di prevenire il movimento del corpo durante la registrazione, incorporare le larve di pesce cinque giorni dopo la fecondazione in metilcellulosa al 3% che è stata riscaldata a 28 gradi Celsius. Versare la metilcellulosa calda in una piastra di coltura cellulare da 35 millimetri e poi trasferire le larve utilizzando una pipetta di siero con un grande gancio.

Mescola le larve nella metilcellulosa, quindi usa un piccolo ago per rimuovere le bolle d'aria e per posizionare la larva fino a otto larve possono essere preparate per esperimenti contemporaneamente. Una volta che le larve sono immobilizzate, posizionare il piatto di coltura cellulare in una griglia per otto piatti. Quindi inizia a proiettare le strisce di stimolo sul tamburo circostante per immobilizzare i pesci adulti.

Innanzitutto, anestetizzarli brevemente con 300 milligrammi per litro MS 2 22 in un serbatoio separato. Una volta anestetizzato, inserire il pesce nel dispositivo di mobilizzazione bloccando delicatamente il corpo del pesce tra due pezzi di spugna correttamente. Limitare i movimenti del corpo dei pesci adulti è il passo più difficile di questa procedura.

Per facilitare l'inserimento nel dispositivo di immobilizzazione, stabilizzare la spugna con due tubi di plastica per polpacci. Una volta che il pesce è immobilizzato, posiziona il dispositivo nel tracker Vizio e lascia che il pesce si riprenda per uno o due minuti prima della registrazione. Per fornire uno stimolo per il progetto di movimento oculare, un modello di stimolo generato da un software consiste in gradazioni verticali di onde sinusoidali bianche e nere sullo schermo del tamburo.

Utilizzando il proiettore di luce digitale contenuto nel tracker Vizio, illuminare il pesce dal basso con la luce infrarossa, quindi utilizzare il pacchetto software per registrare i movimenti oculari in risposta al modello di stimolo. I mutanti del bumper larvale hanno dimensioni ridotte della lente e posizione ectopica del cristallino, e queste alterazioni morfologiche si riflettono in una significativa riduzione della sensibilità al contrasto rispetto al wild type. Come mostrato qui, i mutanti bumper non riescono sempre più a regolare la velocità degli occhi man mano che il contrasto dello stimolo diminuisce.

Inoltre, quando la frequenza spaziale dello stimolo aumenta diminuendo l'ampiezza dello stimolo, i mutanti bumper a strisce dimostrano anche una ridotta acuità visiva rispetto ai fratelli wild type. I pesci zebra adulti di tipo selvatico mostrano una marcata riduzione della sensibilità al contrasto se mantenuti in concentrazioni crescenti di alcol per 30 minuti prima della registrazione. Una simile riduzione dose-dipendente della velocità complessiva dell'occhio si osserva in un'ampia gamma di frequenze spaziali quando i pesci sono stati trattati con concentrazioni di alcol crescenti.

Il trattamento con alcol riduce anche la dose indipendente delle prestazioni oculo-motorie in compiti più impegnativi, come mostrato qui in risposta all'aumento della velocità dello stimolo dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della ricerca sulla visione per esplorare lo sviluppo e la funzione del sistema visivo nei pesci Sbra, nei pesci rossi medici e in altri organismi modello utilizzando modelli sia genetici che farmacologici.