Rilevazione e isolamento delle cellule del melanoma circolanti con flussimetria fotoacustico

L'obiettivo del seguente esperimento è rilevare la presenza di cancro prima della formazione di tumori secondari. Ciò si ottiene prelevando e separando prima campioni di sangue da pazienti con melanoma al quarto stadio. In una seconda fase, il sangue viene introdotto in una camera a flusso fotoacustico, che consente il rilevamento e l'isolamento delle cellule di melanoma.

Successivamente, le cellule catturate vengono sottoposte a imaging per confermare la presenza di melanoma rilevato. I risultati mostrano la capacità del sistema di rilevare e isolare in modo accurato e rapido le cellule di melanoma in base alle forme d'onda fotoacustiche e alle tecniche di imaging cellulare. Il vantaggio principale della nostra tecnica rispetto ai metodi esistenti che rilevano le cellule di melanoma circolanti, come R-T-P-C-R, biomes Magnetic Cell Sorting e altri metodi, è che il nostro metodo è privo di etichette e consente di catturare le cellule di melanoma circolanti senza alterarne la superficie o fissarle a un substrato.

Per preparare un campione per il rilevamento del cancro metastatico, iniziare prelevando circa 10 millilitri di sangue intero da un paziente con cancro al quarto stadio in due centrifughe vacutainer da cinque millilitri, le provette per 10 minuti. A 3000 giri/min, il campione di sangue si separerà in tre diversi strati. Lo strato inferiore comprende gli eritrociti.

Lo strato intermedio, chiamato anche buffy coat, contiene leucociti e cellule di melanoma, mentre lo strato superiore contiene plasma e piastrine. Rimuovi quanto più plasma possibile senza disturbare il mantello di Buffy. Aggiungi 250 microlitri del suo opaco 10 77 a due millilitri di tubi da truppa.

Usando una pipetta pastello da nove pollici, estrai il plasma rimanente, l'intero strato di Buffy e lo strato superiore di eritrociti. Assicurati di raccogliere meno di 500 microlitri. Trasferire la soluzione nei tubi Trobe del vento precedentemente preparati.

Il sangue si separerà di nuovo, ma questa volta gli eritrociti saranno separati dall'hispa, consentendo una facile estrazione del mantello di Buffy. Usa una pipetta Pesa da nove pollici per isolare l'intero rivestimento di Buffy e mettilo in una provetta da due millilitri. Quindi sospenderlo in 1,5 millilitri di PBS con il 2% di volume per volume tra 20.

Per costruire una camera di flusso, inizia con un cilindro acrilico lungo otto millimetri con un diametro esterno di 20 millimetri e un diametro di 17 millimetri. Quindi forare, tre fori di cinque millimetri di diametro attraverso il lato del cilindro ad angoli di 90 gradi l'uno dall'altro. Quindi tagliare tre pezzi di tubo polimerico e posizionarli nei fori praticati.

Stendere la pellicola para sul fondo dell'anello acrilico per ottenere una tenuta stagna. Il film para formerà una ciotola poco profonda con l'anello acrilico e conterrà la soluzione di acrilammide che formerà una camera di flusso. Sospendi un filo di 1,6 millimetri di diametro attraverso i pezzi di tubo direttamente uno di fronte all'altro, assicurandoti che il filo da solo sia visibile attraverso il centro dell'anello nel terzo pezzo di tubo.

Inserire un filo di 1,6 millimetri di diametro e posizionare il tubo a un millimetro di distanza dal filo sospeso. Questi fili impediscono all'acrilammide di entrare nel tubo. Preparare cinque millilitri di acrilammide.

Quindi versare rapidamente il composto nell'anello acrilico, riempiendolo fino in cima. Dopo alcuni secondi, la soluzione gelifica. Realizzando uno stampo per camera di flusso, estrarre con cautela i fili assicurandosi di non disturbare il gel di acrilammide, lasciando un percorso di flusso cilindrico e un posto dove posizionare una fibra ottica focalizzata sul percorso del flusso.

La camera di flusso è ora pronta per l'uso con il gel per ultrasuoni acusticamente. Accoppiare un trasduttore acustico elettrico piso in fluoruro di polivinilledina a una camera di flusso direttamente sopra il percorso del flusso. Utilizzando un cavo a baionetta neo cons o BNC, collegare il trasduttore all'ingresso di un ricevitore a banda larga.

Collegare l'uscita del filtro all'oscilloscopio per attivare l'oscilloscopio. Installare un fotodiodo vicino al trasduttore e utilizzare un cavo B NNC per collegarlo all'oscilloscopio. Estrarre il piccolo tubo della camera di flusso fino a formare una piccola sacca d'aria e accoppiarlo con il trasduttore.

Quindi inserire la fibra ottica e riempire la tasca con acqua per ridurre i segnali di interfaccia e aumentare la quantità di luce laser applicata al percorso del flusso. A causa dell'apertura numerica della fibra ottica e della breve distanza dal percorso del flusso. Il laser irradierà solo una lumaca di campione alla volta, assicurando che il campione direttamente di fronte al laser sia lo stesso campione che crea segnali fotoacustici.

Quindi, collegare un connettore a T a un braccio della camera di flusso e due pompe a siringa agli altri rami del connettore. Una siringa contiene aria mentre l'altra conterrà la sospensione cellulare precedentemente preparata. Quindi avviare entrambe le pompe a siringa.

Quando i due fluidi ammissibili raggiungono la giunzione a T, vengono suddivisi in slug omogenei e scorrono oltre il trasduttore. Irradiare il campione che scorre con un laser a impulsi a nanosecondi per generare onde fotoacustiche nelle cellule del melanoma. Poiché la melanina è un assorbitore ottico a banda larga, è possibile utilizzare qualsiasi lunghezza d'onda laser visibile.

Un segnale che appare sull'oscilloscopio quando una lumaca si trova sopra il trasduttore indica che la lumaca contiene un melanoma. Traccialo attraverso il sistema prima di inserirlo in una fiala di raccolta. Per preparare i campioni per l'immunocitochimica, posizionare i vetrini negli imbuti citogenici e caricarli nella centrifuga citogenica per aiutare le cellule catturate ad aderire ai vetrini.

Metti 100 microlitri di 1% BSA in PBS in ogni imbuto. Quindi centrifugare a 600 giri/min per tre minuti. Dopo la centrifugazione, aggiungere i campioni di cellule per gli imbuti CyTOF, quindi centrifugare a 600 giri/min per tre minuti.

Spruzzare i vetrini con un fissativo a base di etanolo. Quindi lavare i vetrini in PBS per 10 minuti due volte per bloccare la legatura non specifica. Incubare ogni vetrino con una miscela di 10 microlitri di siero di capra e 90 microlitri di PBS per un'ora a temperatura ambiente.

Dopo l'incubazione, decantare i vetrini e aggiungere la soluzione di anticorpi primari. Ogni vetrino deve contenere l'1% di segno di coniglio, l'1% di siero di topo CD 45 e il 10% di siero di capra in PBS incubare per un'ora in una camera umidificata a temperatura ambiente. Quindi, lavare i vetrini in PBS per 10 minuti tre volte.

Quindi incubare i vetrini negli anticorpi secondari fluorescenti appropriati al buio per un'ora a temperatura ambiente, quindi decantare i vetrini. Quindi lavarli in PBS per cinque minuti, tre volte per colorare i nuclei, incubare le cellule con 0,1 microgrammi per millilitro di DPI per un minuto. Quindi decantare i vetrini e lavarli in PBS.

Infine, utilizzando un mezzo di montaggio a base di resina, montare un vetrino coprioggetti sul campione cellulare, sigillare il vetrino coprioggetto con smalto trasparente e creare un'immagine con un microscopio a fluorescenza. Le forme d'onda fotoacustica dai globuli bianchi e dalle cellule del melanoma sono mostrate qui a sinistra. I globuli bianchi che non hanno pigmentazione intrinseca non producono onde fotoacustiche e si manifestano come una linea piatta di rumore elettronico sulla destra.

Tuttavia, le cellule di melanoma pigmentate producono una robusta onda fotoacustica. Dopo immunocito, colorazione chimica, le cellule di melanoma in coltura mostrano segnali dappy in blu, uno contrassegnato viene evidenziato in verde sovrapponendo immagini per DPI e mart uno con CD 45 come indicatore di leucociti. Questa figura mostra le cellule del melanoma tra diversi globuli bianchi dopo il suo sviluppo.

La nostra tecnica aprirà la strada ai ricercatori nel campo della rilevazione del cancro per esplorare il fenomeno delle metastasi sia per migliorare la diagnosi del cancro che, in ultima analisi, per curarne la diffusione fatale.