Rilevazione e isolamento delle cellule del melanoma circolanti con flussimetria fotoacustico

Lo scopo del seguente esperimento è rilevare la presenza di cancro prima della formazione di tumori secondari. Questo viene ottenuto innanzitutto prelevando e separando campioni di sangue da pazienti affetti da melanoma allo stadio quattro. Come secondo passaggio, il sangue viene introdotto in una camera di flusso fotoacustica, che consente il rilevamento e l'isolamento delle cellule di melanoma.

Successivamente, le cellule catturate vengono sottoposte a imaging per confermare la presenza di melanoma rilevato. I risultati mostrano la capacità del sistema di rilevare e isolare in modo accurato e rapido le cellule del melanoma sulla base delle forme d'onda fotoacustiche e delle tecniche di imaging cellulare. Il vantaggio principale della nostra tecnica rispetto ai metodi esistenti per il rilevamento di cellule tumorali circolanti del melanoma, come la R-T-P-C-R, la selezione magnetica delle cellule (Magnetic Cell Sorting) e altri metodi, è che il nostro approccio è privo di marcatura (label free) e consente la cattura di cellule del melanoma circolanti senza alterarne la superficie né ancorarle a un substrato.

Per preparare un campione per il rilevamento del cancro metastatico, iniziare prelevando circa 10 millilitri di sangue intero da un paziente con cancro allo stadio quattro. In due provette vacutainer da cinque millilitri, centrifugare i campioni per 10 minuti a 3000 giri al minuto. Il campione di sangue si separerà in tre strati distinti. Lo strato inferiore è costituito dagli eritrociti.

Lo strato intermedio, chiamato anche strato di buffy coat, contiene leucociti e cellule di melanoma, mentre lo strato superiore contiene plasma e piastrine. Rimuovere la maggior quantità possibile di plasma senza disturbare il buffy coat. Aggiungere 250 microlitri di His Opaco 10 77 a provette da due millilitri.

Utilizzando una pipetta pasteur da nove pollici, prelevare il plasma rimanente, l'intero strato di buffy coat e lo strato superiore di eritrociti, assicurandosi di raccogliere meno di 500 microlitri. Trasferire la soluzione nei tubi wind Trobe preparati in precedenza.

Il sangue si separerà nuovamente, ma questa volta gli eritrociti saranno separati dall'hispa, consentendo un facile prelievo del buffy coat. Utilizzare una pipetta Pesa da nove pollici per isolare l'intero buffy coat e trasferirlo in una provetta eppendorf da due millilitri. Quindi sospenderlo in 1,5 millilitri di PBS con il 2% in volume/volume tra 20.

Per costruire una camera di flusso, iniziare con un cilindro in acrilico lungo otto millimetri, con un diametro esterno di 20 millimetri e un diametro interno di 17 millimetri. Successivamente, praticare tre fori del diametro di cinque millimetri attraverso il lato del cilindro, disposti a 90 gradi l'uno rispetto all'altro. Quindi, tagliare tre pezzi di tubo polimerico e inserirli nei fori praticati.

Stendere il para film sul fondo dell'anello in acrilico per creare una sigillatura impermeabile. Il para film formerà una sorta di ciotola poco profonda insieme all'anello in acrilico e conterrà la soluzione di acrilammide che darà origine alla camera di flusso. Sospendere un filo del diametro di 1,6 millimetri attraverso i pezzi di tubo posizionati direttamente uno di fronte all'altro, assicurandosi che soltanto il filo sia visibile al centro dell'anello e proiettato nel terzo pezzo di tubo.

Inserire un filo di diametro di 1,6 millimetri e posizionare il tubo a un millimetro di distanza dal filo sospeso. Questi fili impediscono all'acrilammide di entrare nel tubo. Preparare cinque millilitri di acrilammide.

Quindi versare rapidamente la miscela nell'anello di acrilico, riempiendolo fino all'orlo. Dopo alcuni secondi, la soluzione formerà un gel. Per realizzare uno stampo per camera di flusso, estrarre con cura i fili assicurandosi di non disturbare il gel di acrilammide, lasciando un percorso di flusso cilindrico e uno spazio per posizionare una fibra ottica focalizzata sul percorso di flusso.

La camera di flusso è ora pronta per l'uso con gel ad ultrasuoni. Accoppiare un trasduttore acustico piezoelettrico in fluoruro di polivinilidene alla camera di flusso direttamente sopra il percorso di flusso. Utilizzando un cavo bayonet neo cons o BNC, collegare il trasduttore all'ingresso di un ricevitore a banda larga.

Collegare l'uscita del filtro all'oscilloscopio per attivare l'oscilloscopio. Posizionare un fotodiodo vicino al trasduttore e utilizzare un cavo B NNC per collegarlo all'oscilloscopio. Estrarre il tubicino della camera di flusso fino a formare una piccola bolla d'aria e accoppiarlo al trasduttore.

Inserire quindi la fibra ottica e riempire la cavità con acqua per ridurre i segnali d'interfaccia e aumentare la quantità di luce laser applicata al percorso di flusso. A causa dell'apertura numerica della fibra ottica e della breve distanza dal percorso di flusso, il laser irradierà un solo slug di campione alla volta, garantendo che il campione direttamente davanti al laser sia esattamente lo stesso che genera i segnali fotoacustici.

Successivamente, collegare un connettore a T a un braccio della camera di flusso e due pompe per siringhe ai rami del connettore. Una siringa contiene aria, mentre l'altra conterrà la sospensione cellulare precedentemente preparata. Quindi avviare entrambe le pompe per siringhe.

Quando i due fluidi ammissibili raggiungono il giunto a T, verranno suddivisi in slug omogenei e fluiranno oltre il trasduttore. Irradiare il campione in flusso con un laser a impulsi nanosecondi per generare onde fotoacustiche nelle cellule di melanoma. Poiché la melanina è un assorbitore ottico a banda larga, si può utilizzare qualsiasi lunghezza d'onda laser visibile.

Un segnale che appare sull'oscilloscopio quando un campione si trova sopra il trasduttore indica che il campione contiene melanoma. Seguirlo lungo il sistema prima di farlo cadere in una provetta di raccolta. Per preparare i campioni per l'immunocitochimica, posizionare i vetrini in apposite cannule e inserirli nel citospin per la centrifugazione, al fine di favorire l'adesione delle cellule catturate ai vetrini.

Aggiungere 100 microlitri di BSA al 1% in PBS in ciascun imbuto. Centrifugare quindi a 600 giri/min per tre minuti. Dopo la centrifugazione, aggiungere i campioni cellulari negli imbuto per CyTOF, quindi centrifugare a 600 giri/min per tre minuti.

Spruzzare i vetrini con un fissativo a base di etanolo. Quindi lavare i vetrini in PBS per 10 minuti, due volte, per bloccare il legame non specifico. Incubare ogni vetrino con una miscela di 10 microlitri di siero di capra e 90 microlitri di PBS per un'ora a temperatura ambiente.

Dopo l'incubazione, versare con cautela il liquido dai vetrini e aggiungere la soluzione di anticorpo primario. Ogni vetrino deve contenere 1% di siero di coniglio, 1% di anticorpo anti-CD45 di topo e 10% di siero di capra in PBS; incubare per un'ora in una camera umidificata a temperatura ambiente. Successivamente, lavare i vetrini in PBS per 10 minuti, per tre volte.

Quindi incubare i vetrini con gli opportuni anticorpi secondari fluorescenti al buio per un'ora a temperatura ambiente, quindi versare delicatamente il liquido dai vetrini. Successivamente lavarli in PBS per cinque minuti, per tre volte, per colorare i nuclei; incubare le cellule con 0,1 microgrammi per millilitro di DPI per un minuto. Poi versare delicatamente il liquido dai vetrini e lavare in PBS.

Infine, utilizzando un mezzo di montaggio a base di resina, applicare un coprioggetto sul campione cellulare, sigillare il coprioggetto con smalto trasparente e osservare con un microscopio a fluorescenza. Le forme d'onda fotoacustiche provenienti da globuli bianchi e cellule di melanoma sono mostrate qui a sinistra. I globuli bianchi, non avendo pigmentazione intrinseca, non producono onde fotoacustiche e si manifestano come una linea piatta di rumore elettronico a destra.

Tuttavia, le cellule di melanoma pigmentate producono un'onda fotoacustica intensa. Dopo l'immunocitochimica e la colorazione chimica, le cellule di melanoma coltivate mostrano segnali puntiformi in blu; una cellula marcata è evidenziata in verde sovrapponendo le immagini per DPI e una con CD45 come indicatore dei leucociti. Questa figura mostra cellule di melanoma tra diversi globuli bianchi dopo il loro sviluppo.

La nostra tecnica aprirà la strada ai ricercatori nel campo del rilevamento del cancro per esplorare il fenomeno della metastasi, al fine di migliorare la diagnosi del cancro e, in ultima analisi, curarne la diffusione letale.