Name: Rilevazione e isolamento delle cellule del melanoma circolanti con flussimetria fotoacustico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: Scopri il rilevamento e l'isolamento delle cellule del melanoma circolanti mediante flussimetria fotoacustica. Questo metodo senza marcatori consente di identificare rapidamente le cellule tumorali prima della formazione di metastasi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Noi riconosciamo il sostegno del Dipartimento di Ingegneria Biologica e la Christopher S. James Bond Life Sciences Center presso la University of Missouri. Riconosciamo sovvenzioni da Missouri Life Sciences Research Board 09-1034 e NIH R21CA139186-0. Ringraziamo anche la Vita di laurea Scienze programma Opportunità di ricerca presso l&#39;Università del Missouri, l&#39;Università di Core Missouri Citologia molecolare, e l&#39;Università del Missouri College of Engineering per il sostegno finanziario.

1. Preparazione del campione di sangue <ol><li> Prelevare circa 10 ml di sangue intero da un paziente Stadio Cancro IV in due vacutainer 5 ml. </li><li> Centrifugare le provette per dieci minuti a 3.000 giri al minuto (rpm). </li><li> Il campione di sangue viene separato in tre diversi strati: lo strato inferiore comprende il eritrociti, lo strato centrale, detto anche buffy coat, contiene leucociti e cellule di melanoma, e lo strato superiore contiene plasma e piastrine. Rimuovere il plasma più possibile senza disturbare il buffy coat. </li><li> Posto 250 microlitri di HISTOPAQUE 1077 in due tubi Wintrobe 1 ml. </li><li> Utilizzando un 9 &quot;pipetta Pasteur, estrarre il plasma residuo, il cappotto tutto buffy, e anche lo strato superiore degli eritrociti, avendo cura di raccogliere &lt;500 microlitri. </li><li> Posizionare la soluzione sopra lo strato HISTOPAQUE e centrifugare i tubi Wintrobe in provette da 15 ml conica per 10 minuti a 3000 rpm. </li><li> Il sangue sarà di nuovoseparati, ma questa volta il eritrociti saranno separati dal HISTOPAQUE, consentendo una facile estrazione del buffy coat. Utilizzare un 9 &quot;pipetta Pasteur per ottenere il cappotto intero buffy e metterla in una provetta 2 ml Eppendorf. </li><li> Sospendere il buffy coat in 1,5 ml di PBS con il 2% v / v Tween 20. </li></ol> 2. Camera di flusso Costruzione <ol><li> Ottenere un cilindro in acrilico, 20 mm di diametro esterno, 17 mm di diametro interno, e 8 mm di altezza. Praticare tre fori di 5 mm di diametro attraverso il lato del cilindro ad angoli di 90 gradi l&#39;uno dall&#39;altro. Tagliate tre pezzi di tubo di polimeri (1,6 mm di diametro interno, 5 mm di diametro esterno), e metterli nei fori. </li><li> Stretch Parafilm nella parte inferiore dell&#39;anello acrilico per fare una perfetta tenuta d&#39;acqua. Il parafilm forma una ciotola con l&#39;anello in acrilico e terrà la soluzione di acrilammide che si forma una camera di flusso. </li><li> Sospendere un filo di 1,6 mm di diametro attraverso i pezzi di tubo che sono di fronte al&#39;altro, facendo in modo che il filo da solo è visibile attraverso il centro del ring. Riempire il terzo pezzo di tubo con un filo di 1,6 millimetri di diametro e la posizione del tubo di 1 millimetro di distanza dal filo sospeso. Questi fili impedisce di acrilammide di entrare nel tubo. Dopo l&#39;acrilamide si solidifica, i cavi saranno estratti, lasciando un sentiero cilindrico flusso e un posto per posizionare una fibra ottica si concentra sul percorso del flusso. </li><li> Aggiungere 5 mL di acrilamide preparati [20 g di acrilammide (Sigma Aldrich), 0,7 g bisacrylamide (Sigma Aldrich), 100 ml di acqua distillata] in un recipiente di piccole dimensioni. Misurare 0,02 g di persolfato di ammonio (Sigma) e aggiungerlo al bicchiere. Mescolare con ancoretta per 3 minuti. Aggiungere 20 l tetramethylethylenediamene (Fisher Scientific) al bicchiere. Velocemente versare il composto sul ring acrilico, riempiendo verso l&#39;alto. Dopo pochi secondi, la soluzione in gel, facendo uno stampo camera di flusso. Estrarre delicatamente i fili fuori, facendo attenzione a non disturbare il gel di acrilammide. Il flusso di ChamBER è ora pronto per l&#39;uso. </li></ol> 3. Flussimetria fotoacustico set-up <ol><li> Acusticamente paio di fluoruro di polivinile trasduttore acustico piezoelettrico (Panametrics) per una camera di flusso usando gel per ultrasuoni direttamente sopra il percorso del flusso. </li><li> Utilizzando un Bayonet Neill-Concelman (BNC), cavo, collegare il trasduttore con l&#39;ingresso di un ricevitore a banda larga RITEC-640A (filtro passa-basso: fuori, filtro passa-alto: 1 MHz, Impedenza d&#39;ingresso: 50 Ohm, amplificazione: 35 dB). Collegare l&#39;uscita del filtro per l&#39;oscilloscopio (Tektronix TDS 2024B). Per attivare l&#39;oscilloscopio, un fotodiodo (Thorlabs) è istituito presso il trasduttore ed è collegato a dell&#39;oscilloscopio utilizzando un cavo BNC. </li><li> Un connettore a T (minuteria) è collegato a un braccio della camera di flusso. Due pompe siringa (Braintree scientifico) sono collegati ad altri rami del connettore. Una siringa contiene aria, mentre l&#39;altro conterrà la sospensione cellulare preparata nella parte 1. Impostare la velocità di flusso di100 l / minuto. </li><li> Estrarre il tubo piccolo della camera di flusso fino a quando una piccola tasca di forme d&#39;aria, e inserire un diametro di 1 millimetro in fibra ottica core con un apertura numerica 0,37 in quello slot. Riempire la tasca con acqua per ridurre segnali di interfaccia e di aumentare la quantità di luce laser applicata al percorso del flusso. A causa della apertura numerica della fibra ottica e breve distanza dal percorso del flusso, il laser solo irradiare uno slug del campione in qualsiasi momento, assicurando che il campione direttamente di fronte al laser è lo stesso campione di creare segnali fotoacustico. L&#39;energia laser dovrebbe essere circa 28 mJ / cm 2 con uno spot di 7 mm 2. </li><li> Accendere entrambe le pompe siringa su. Quando i due fluidi immiscibili raggiungere la t-giunzione saranno suddivisi in omogenei lumache e il flusso di oltre il trasduttore. </li><li> Irradiare il campione scorre un nanosecondo a impulsi laser per generare onde fotoacustico nelle cellule di melanoma. Come melanina è un broadbe ottiche assorbitore, ogni lunghezza d&#39;onda laser visibile può essere utilizzato. </li><li> Se un segnale appare sul oscilloscopio quando una lumaca è in cima al trasduttore, la lumaca contiene melanoma, e dovrebbero essere monitorati attraverso il sistema fino a cadere in una fiala di raccolta. </li></ol> 4. Immunocitochimica <ol><li> Prendere le lumache acquisiti in un Centrifuga 4 Cytospin (Thermo Scientific), al fine di correggerli per vetrini. Collocare i vetrini in vetro Cytofunnels (Shandon Cytofunnel EZ singola con Brown filtro carta Thermo Scientific) e li carico in centrifuga 4 Cytospin. Mettere 100 ml di 1% di albumina di siero bovino (Sigma) in PBS in ciascun imbuto, quindi si centrifuga a 600 giri al minuto per 3 minuti per aiutare le cellule catturate bastone alle diapositive di vetro. </li><li> Dopo la centrifugazione, aggiungere i campioni delle cellule al Cytofunnels, quindi si centrifuga a 600 giri al minuto per 3 minuti. Quindi spruzzare le diapositive con un fissativo a base di etanolo. </li><li> Lavare i vetrini in PBS per 10 minuti due volte. </li><li&gt; Per bloccare legame aspecifico, incubare ogni diapositiva con una miscela di 10 ml di siero di capra (Sigma) e 90 ml di PBS per 1 ora a temperatura ambiente. </li><li> Dopo l&#39;incubazione, far decantare le diapositive e incubare con la soluzione di anticorpo primario per 1 ora in una camera umidificata a temperatura ambiente. Ogni diapositiva deve contenere l&#39;1% MART-1 anticorpi cresciuto a coniglio, 1% CD-45 anticorpi cresciuto nel topo, nel siero di capra 10%, 89% e PBS. </li><li> Dopo l&#39;incubazione, lavare i vetrini in PBS per 10 minuti tre volte. </li><li> I vetrini vengono poi incubate in una soluzione di anticorpo secondario, che ha fluoroforo legate agli anticorpi. La miscela contiene 0,05% di capra anti-coniglio di anticorpi, 0,05% di capra anti-topo, siero di capra 0,1%, e il 99% PBS. Le diapositive vengono incubate al buio per 1 ora a temperatura ambiente. </li><li> Dopo l&#39;incubazione, decantare le diapositive lavare in PBS per 5 minuti tre volte. </li><li> A macchia di un nucleo, incubare le cellule con 0,1 mg / ml di DAPI (Invitrogen) per1 minuto. Poi decantare le diapositive e lavare in PBS. </li><li> Montare un vetrino sul campione cellulare utilizzando 20 l di un supporto di montaggio a base di resina per vetrino. Sigillare il coprioggetto con smalto trasparente per preservare la diapositiva. Ora le diapositive sono pronti per essere ripreso con un microscopio a fluorescenza. </li></ol> 5. Rappresentante dei risultati: <img src="/files/ftp_upload/3559/3559fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Le forme d&#39;onda fotoacustico da globuli bianchi e cellule di melanoma sono mostrati qui. I globuli bianchi, non avendo pigmentazione intrinseca, non producono onde fotoacustico e si manifestano come una linea piatta di rumore elettronico (a sinistra). Le cellule di melanoma pigmentato produce un&#39;onda robusto fotoacustico (a destra). <img src="/files/ftp_upload/3559/3559fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Dopo la colorazione immunocitochimica, cellule di melanoma in coltura mostrano segnali DAPI in blue mentre MART1 è evidenziato in verde. <img src="/files/ftp_upload/3559/3559fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. Sovrapposizione delle immagini per DAPI e MART1, come in Figura 2, con CD45 come un indicatore di leucociti, questa figura mostra cellule di melanoma tra le diverse cellule bianche del sangue.

<ol><li>Pantel, K., Brakenhoff, R., Brandt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+clinical+relevance+and+specific+biological+properties+of+disseminating+tumour+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Detection clinical relevance and specific biological properties of disseminating tumour cells.</a> Nature Reviews Cancer. 8, 329-340 (2008).</li>
<li>Pantel, K., Brakenhoff, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+the+metastatic+cascade%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Dissecting the metastatic cascade.</a> Nature Reviews Cancer. 4, 448-456 (2004).</li>
<li>Yu, M., Stott, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cells%3A+approaches+to+isolation+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cells: approaches to isolation and characterization.</a> The Journal of Cell Biology. 192, 373-373 (2011).</li>
<li>Detection of circulating melanoma cells in human blood using photoacoustic flowmetry. Weight, R. M., Dale, P. S., Viator, J. Annual International Conference of the IEEE, 2009, , IEEE. 106-109 (1985).</li>
<li>Weight, R. M., Dale, P. S., Lisle, A., Caldwell, C., Viator, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoacoustic+detection+of+metastatic+melanoma+cells+in+the+human+circulatory+system%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Photoacoustic detection of metastatic melanoma cells in the human circulatory system.</a> Opt. Lett. 31, 2998-3000 (2006).</li>
<li>Gupta, A., Kumar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+geometry+on+droplet+formation+in+the+squeezing+regime+in+a+microfluidic+T-junction%5BTitle%5D)+AND+%22Microfluidics+and+Nanofluidics%22%5BJournal%5D)">Effect of geometry on droplet formation in the squeezing regime in a microfluidic T-junction.</a> Microfluidics and Nanofluidics. 8, 799-812 (2010).</li>
<li>Mocellin, S., Hoon, D., Ambrosi, A., Nitti, D., Rossi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prognostic+value+of+circulating+tumor+cells+in+patients+with+melanoma%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">The prognostic value of circulating tumor cells in patients with melanoma: a systematic review and meta-analysis.</a> Clinical Cancer Research. 12, 4605-4605 (2006).</li>
<li>Cristofanilli, M., Budd, G., Ellis, M., Stopeck, A., Matera, J., Miller, M., Reuben, J., Doyle, G., Allard, W., Terstappen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cells%2C+disease+progression%2C+and+survival+in+metastatic+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cells, disease progression, and survival in metastatic breast cancer.</a> New England Journal of Medicine. 351, 781-781 (2004).</li>
<li>Cristofanilli, M., Hayes, D., Budd, G., Ellis, M., Stopeck, A., Reuben, J., Doyle, G., Matera, J., Allard, W., Miller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cells%3A+a+novel+prognostic+factor+for+newly+diagnosed+metastatic+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cells: a novel prognostic factor for newly diagnosed metastatic breast cancer.</a> Journal of Clinical Oncology. 23, 1420-1420 (2005).</li>
<li>Ghossein, R., Scher, H., Gerald, W., Kelly, W., Curley, T., Amsterdam, A., Zhang, Z., Rosai, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+circulating+tumor+cells+in+patients+with+localized+and+metastatic+prostatic+carcinoma%3A+clinical+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Detection of circulating tumor cells in patients with localized and metastatic prostatic carcinoma: clinical implications.</a> Journal of Clinical Oncology. 13, 1195-1195 (1995).</li>
<li>Loberg, R., Fridman, Y., Pienta, B., Keller, E., McCauley, L., Taichman, R., Pienta, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+isolation+of+circulating+tumor+cells+in+urologic+cancers%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Detection and isolation of circulating tumor cells in urologic cancers: a review.</a> Neoplasia. 6, 302-302 (2004).</li>
<li>Viator, J. A., Gupta, S. K., Goldschmidt, B. S., Bhattacharyya, K., Raghuraman, R., Shukla, R., Dale, P. S., Boote, E., Katti, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+gold+nanoparticle+enhanced+prostate+cancer+cells+using+photoacoustic+flowmetry+with+optical+reflectance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Nanotech%22%5BJournal%5D)">Detection of gold nanoparticle enhanced prostate cancer cells using photoacoustic flowmetry with optical reflectance.</a> J. Biomed. Nanotech. 6, 187-191 (2010).</li>
</ol>

John A. Viator è fondatore e presidente di Viator Technologies Inc, una società costituita per commercializzare le tecnologie fotoacustico per il miglioramento della salute umana.

Rilevare CTC è ancora un campo di intensa ricerca con applicazioni cliniche pochissime a causa del difficile problema di isolare le cellule tumorali rare. Molte altre tecniche sono in corso di valutazione per la rilevazione CTC, tra RT-PCR, la cattura delle cellule microfluidica, la cattura immunomagnetica, e altri metodi 8-12. Tuttavia, l&#39;individuazione fotoacustico di spettacoli CMC promessa in quanto è l&#39;etichetta gratuita e fornisce un mezzo rapido e preciso per catturare piccole particelle che assorbono la luce. Il protocollo descritto per isolare le cellule bianche del sangue è altamente efficiente, ma un numero basso di globuli rossi presenti nel campione. Queste cellule rouge contaminando anche assorbire la luce laser, ma ad un livello notevolmente diminuito. Per garantire i globuli rossi non interferiscono con il nostro sistema di rilevazione melanoma, cinque campioni di pazienti sani sono stati introdotti attraverso il sistema e nessuno ha dato un segnale, indicando che i globuli rossi sono presenti a basse concentrazioni abbastanzaessere ignorato. Una serie di studi di concentramento sono stati condotti utilizzando cellule di melanoma in coltura e del sistema a flusso fotoacustico si è dimostrato sensibile a 1 cellula / mL (dati non pubblicati). Questi studi sono in corso e presto includere prove usando campioni di pazienti di cancro. Questa tecnica fotoacustico è anche in corso di valutazione per l&#39;uso in non pigmentate CTC, come al seno e alla prostata allegando cromofori esogeni. Abbiamo effettuato un lavoro preliminare utilizzando nanoparticelle d&#39;oro sul cancro cells13. Questi test hanno dimostrato che le nanoparticelle in grado di fornire il necessario assorbimento ottico per generare onde fotoacustico. La sfida restante tecnico è quella di allegare tali particelle selettivamente alle cellule tumorali.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> ABCD1234 </td><td></td></tr></tbody></table>

rilevazione e isolamento delle cellule del melanoma circolanti con flussimetria fotoacustico

Detection and Isolation of Circulating Melanoma Cells using Photoacoustic Flowmetry

Cellule tumorali circolanti (CTC) sono quelle cellule che hanno separato da un tumore macroscopico e diffuso attraverso i sistemi di sangue e la linfa ai tumori secondari seme 1,2,3. CTC sono indicatori della malattia metastatica e la loro rilevazione in campioni di sangue possono essere utilizzati per diagnosticare il cancro e monitorare la risposta del paziente alla terapia. Dal momento che CTC sono rare, composto da circa una cellula tumorale tra miliardi di cellule del sangue normali in pazienti con cancro avanzato, la loro individuazione e l&#39;enumerazione è un compito difficile. Sfruttiamo la presenza del pigmento nella maggior parte delle cellule di melanoma per generare fotoacustica, o laser indotta onde ultrasoniche in un citofluorimetro personalizzati per la rilevazione di cellule di melanoma circolanti (CMC) 4,5. Questo processo comporta la separazione di un campione di sangue intero mediante centrifugazione e di ottenere il bianco strato di cellule del sangue. Se presente nel sangue intero, CMC sarà separato con i globuli bianchi a causa della densità simile. Queste cellule sono risospese intampone fosfato (PBS) ed introdotti nel misuratore di portata. Piuttosto che un flusso continuo della sospensione delle cellule del sangue, ci ha indotto due fasi del flusso al fine di catturare queste cellule per ulteriori studi. In due fasi del flusso, due liquidi immiscibili in un sistema di microfluidica si incontrano ad un bivio e la forma si alternano spezzoni di liquido 6,7. PBS sospesi i globuli bianchi e l&#39;aria lumache microlitro forma che sono in sequenza irradiati con luce laser. L&#39;aggiunta di un tensioattivo alla fase liquida permette di formazione uniforme lumaca e l&#39;utente può creare diversi proiettili di dimensioni modificando le portate delle due fasi. Lumache di aria e lumache di PBS con i globuli bianchi non contengono assorbitori di luce e, di conseguenza, non producono onde fotoacustico. Tuttavia, lumache di globuli bianchi che contengono anche CMC solo assorbono la luce laser e di produrre onde acustiche ad alta frequenza. Queste lumache che generano onde fotoacustico vengono sequestrati e raccolti per la colorazione citochimica per verificzione di CMC.

Abbiamo sviluppato un citofluorimetro mediante ultrasuoni laser indotto a rilevare in circolo cellule di melanoma come un indicatore precoce della malattia metastatica.

Rilevazione e isolamento delle cellule del melanoma circolanti con flussimetria fotoacustico

Le cellule tumorali circolanti (CTC) sono cellule che si sono distaccate da un tumore macroscopico e si diffondono attraverso i sistemi ematico e linfatico per seminare...

Lo scopo del seguente esperimento è rilevare la presenza di cancro prima della formazione di tumori secondari. Questo obiettivo viene raggiunto innanzitutto ottenendo e separando campioni di sangue da pazienti con melanoma allo stadio quattro. Come secondo passaggio, il sangue viene introdotto in una camera di flusso fotoacustica, che consente il rilevamento e l'isolamento delle cellule di melanoma.Successivamente, le cellule catturate vengono analizzate mediante imaging per confermare la presenza di melanoma rilevato. I risultati dimostrano la capacità del sistema di rilevare e isolare in modo preciso e rapido le cellule di melanoma sulla base delle forme d'onda fotoacustiche e delle tecniche di imaging cellulare. Il principale vantaggio del nostro metodo rispetto alle tecniche esistenti per il rilevamento di cellule di melanoma circolanti, come la R-T-P-C-R, la selezione magnetica delle cellule e altri metodi, è che il nostro approccio è privo di marcatori e consente la cattura delle cellule di melanoma circolanti senza alterarne la superficie né vincolarle a un substrato.Per preparare un campione per il rilevamento del cancro metastatico, iniziare prelevando circa 10 millilitri di sangue intero da un paziente con cancro allo stadio quattro. In due provette vacutainer da cinque millilitri, centrifugare i campioni per 10 minuti a 3000 giri al minuto. Il campione di sangue si separerà in tre strati diversi. Lo strato inferiore è costituito dagli eritrociti.Lo strato intermedio, chiamato anche strato di buffy coat, contiene leucociti e cellule di melanoma, mentre lo strato superiore contiene plasma e piastrine. Rimuovere la maggior quantità possibile di plasma senza disturbare il buffy coat. Aggiungere 250 microlitri di His opaque 10 77 a provette da due millilitri.Utilizzando una pipetta pastello da nove pollici, estrarre il plasma rimanente, l'intero strato di buffy coat e lo strato superiore di eritrociti, assicurandosi di raccogliere meno di 500 microlitri. Trasferire la soluzione nei tubi wind Trobe preparati in precedenza.Il sangue si separerà nuovamente, ma questa volta gli eritrociti saranno separati dall'hispa, consentendo un facile prelievo del buffy coat. Utilizzare una pipetta Pesa da nove pollici per isolare l'intero buffy coat e posizionarlo in una provetta eend orph da due millilitri. Successivamente, sospendere in 1,5 millilitri di PBS al 2% volume/volume tra 20.Per costruire una camera di flusso, iniziare con un cilindro in acrilico lungo otto millimetri, con un diametro esterno di 20 millimetri e un diametro interno di 17 millimetri. Successivamente, praticare tre fori del diametro di cinque millimetri attraverso il lato del cilindro, disposti a 90 gradi l'uno rispetto all'altro. Quindi tagliare tre pezzi di tubo polimerico e inserirli nei fori praticati.Stendere il para film sul fondo dell'anello in acrilico per creare una sigillatura impermeabile. Il para film formerà una sorta di ciotola poco profonda insieme all'anello in acrilico e conterrà la soluzione di acrilammide che darà origine alla camera di flusso. Far passare un filo del diametro di 1,6 millimetri attraverso i pezzi di tubo posizionati direttamente uno di fronte all'altro, assicurandosi che soltanto il filo sia visibile al centro dell'anello e proiettato nel terzo pezzo di tubo.Inserire un filo con diametro di 1,6 millimetri e posizionare il tubo a un millimetro di distanza dal filo sospeso. Questi fili impediscono all'acrilamide di entrare nel tubo. Preparare cinque millilitri di acrilamide.Quindi versare rapidamente la miscela nell'anello di acrilico, riempiendolo fino all'orlo. Dopo alcuni secondi, la soluzione formerà un gel. Per realizzare uno stampo per camera di flusso, estrarre con cura i fili assicurandosi di non disturbare il gel di acrilammide, lasciando un percorso di flusso cilindrico e uno spazio per posizionare una fibra ottica focalizzata sul percorso di flusso.La camera di flusso è ora pronta per l'uso con gel ecografico dal punto di vista acustico. Accoppiare un trasduttore acustico piezoelettrico in fluoruro di polivinilidene alla camera di flusso direttamente sopra il percorso di flusso. Utilizzando un cavo bayonet neo cons o BNC, collegare il trasduttore all'ingresso di un ricevitore a banda larga.Collegare l'uscita del filtro all'oscilloscopio per attivare l'oscilloscopio. Posizionare un fotodiodo vicino al trasduttore e utilizzare un cavo B NNC per collegarlo all'oscilloscopio. Estrarre il tubicino della camera di flusso fino a formare una piccola bolla d'aria e accoppiarlo al trasduttore.Inserire quindi la fibra ottica e riempire la tasca con acqua per ridurre i segnali di interfaccia e aumentare la quantità di luce laser applicata al percorso di flusso. A causa dell'apertura numerica della fibra ottica e della breve distanza dal percorso di flusso, il laser irradierà un solo slug di campione alla volta, garantendo che il campione direttamente davanti al laser sia esattamente lo stesso che genera i segnali fotoacustici.Successivamente, collegare un connettore a T a un braccio della camera a flusso e due pompe a siringa agli altri rami del connettore. Una siringa contiene aria, mentre l'altra conterrà la sospensione cellulare precedentemente preparata. Quindi avviare entrambe le pompe a siringa.Quando i due fluidi ammissibili raggiungono il giunto a T, verranno suddivisi in slug omogenei e fluiranno oltre il trasduttore. Irradiare il campione in flusso con un laser a impulsi nanosecondici per generare onde fotoacustiche nelle cellule di melanoma. Poiché la melanina è un assorbitore ottico a banda larga, si può utilizzare qualsiasi lunghezza d'onda laser visibile.Un segnale che appare sull'oscilloscopio quando una gocciolina si trova sulla sommità del trasduttore indica che la gocciolina contiene melanoma. Seguirla attraverso il sistema prima di farla cadere in un'apposita provetta di raccolta. Per preparare i campioni per l'immunocitochimica, posizionare i vetrini in vetro nei beccucci citofunel e inserirli nel citospin per la centrifugazione, al fine di favorire l'adesione delle cellule catturate ai vetrini.Aggiungere 100 microlitri di BSA al 1% in PBS in ogni imbuto. Centrifugare quindi a 600 giri al minuto per tre minuti. Dopo la centrifugazione, aggiungere i campioni cellulari negli imbuto per CyTOF, quindi centrifugare a 600 giri al minuto per tre minuti.Spruzzare i vetrini con un fissativo a base di etanolo. Quindi lavare i vetrini in PBS per 10 minuti, due volte, per bloccare il legame non specifico. Incubare ogni vetrino con una miscela di 10 microlitri di siero di capra e 90 microlitri di PBS per un'ora a temperatura ambiente.Dopo l'incubazione, versare con cautela il liquido dai vetrini e aggiungere la soluzione di anticorpo primario. Ogni vetrino deve contenere 1% di siero di coniglio, 1% di anticorpo anti-CD45 di topo e 10% di siero di capra in PBS; incubare per un'ora in una camera umidificata a temperatura ambiente. Successivamente, lavare i vetrini in PBS per 10 minuti, per tre volte.Quindi incubare i vetrini con gli opportuni anticorpi secondari fluorescenti al buio per un'ora a temperatura ambiente, quindi rimuovere i liquidi dai vetrini. Lavare quindi i vetrini in PBS per cinque minuti, per tre volte, per colorare i nuclei; incubare le cellule con 0,1 microgrammi per millilitro di DPI per un minuto. Quindi rimuovere i liquidi dai vetrini e lavare in PBS.Infine, utilizzando un mezzo di montaggio a base di resina, posizionare una lamella sul campione cellulare, sigillare la lamella con smalto trasparente e acquisire le immagini mediante microscopio fluorescente. Le onde fotoacustiche generate da globuli bianchi e cellule di melanoma sono mostrate qui a sinistra. I globuli bianchi, non essendo dotati di pigmentazione intrinseca, non producono onde fotoacustiche e si presentano come una linea piatta di rumore elettronico a destra.Tuttavia, le cellule di melanoma pigmentate producono un'onda fotoacustica intensa. Dopo l'immunocitochimica, la colorazione chimica mostra segnali puntiformi in blu, una singola cellula marcata è evidenziata in verde sovrapponendo le immagini per DPI e una con CD45 come indicatore dei leucociti. Questa figura mostra cellule di melanoma tra diverse cellule del sangue bianco dopo il loro sviluppo.La nostra tecnica aprirà la strada ai ricercatori nel campo della rilevazione del cancro per esplorare il fenomeno della metastasi, al fine di migliorare la diagnosi del cancro e, in ultima analisi, contrastare la sua diffusione letale.

detection-isolation-circulating-melanoma-cells-using-photoacoustic

Research

Ricerca

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingegneria

Questo video descrive la tecnica di isolamento delle cellule staminali CD133 negative e positive del melanoma da una linea cellulare primaria di melanoma utilizzando la selezione cellulare attivata magneticamente. Le CSC del melanoma CD133 positive sono state ulteriormente studiate per comprendere i meccanismi della tumorigenesi del melanoma.

Isolamento delle cellule staminali del melanoma: un metodo per ottenere cellule di melanoma CD133 positive e negative utilizzando la selezione cellulare attivata magneticamente

In questo video, presentiamo una rilevazione citometrica a flusso fotoacustica di cellule tumorali ovariche contenenti nanoparticelle in una camera a flusso circolante in vitro. Questa tecnica non invasiva identifica con successo le cellule tumorali circolanti in un sistema di flusso utilizzando un agente di contrasto.

Citometria a flusso fotoacustica in vitro: una tecnica fotoacustica a flusso non invasiva per rilevare le cellule di cancro ovarico circolanti contenenti nanoparticelle

Fonte: Kalva, S. K., et al., Tomografia fotoacustica da tavolo basata su diodi laser pulsati per il monitoraggio del wash-in e del wash-out del colorante nella vascolarizzazione corticale di ratto. J. Vis. Exp. (2019)Questo video dimostra la procedura per l'utilizzo dell'imaging fotoacustico per osservare i cambiamenti nei vasi corticali di un ratto anestetizzato. Il processo include l'imaging di base, l'iniezione del colorante e l'analisi dell'assorbimento e della clearance del colorante...

Monitoraggio fotoacustico del movimento del colorante nei vasi sanguigni corticali

In questo articolo si descrive la preparazione di tessuti melanoma appena ottenuto in colture cellulari primarie, e come rimuovere le contaminazioni di eritrociti e fibroblasti dalle cellule tumorali. Infine, si descrive come...

Paziente coltura cellulare derivato e isolamento di CD133<sup&gt; +</sup&gt; Putativi staminali alle cellule tumorali di melanoma

Descriviamo due metodi complementari utilizzando l'indicatore del ciclo cellulare di ubiquitinazione a fluorescenza (FUCCI) e l'analisi delle immagini o la citometria a flusso per identificare e isolare le cellule nelle regioni interne G1 arrestate e proliferanti esterne degli sferoidi 3D.

Analisi basata su Citometria Imaging- e di flusso della posizione cellulare e ciclo cellulare in 3D Melanoma Spheroids

Qui vi presentiamo un protocollo per stimare il materiale e la superficie proprietà ottiche utilizzando l'Effetto Fotoacustico combinato con riflessione interna totale. Questa tecnica evanescenti fotoacustica sul campo basati possono essere usati per creare un sistema di metrologia fotoacustico di stimare indici di spessori, di massa e sottile rifrazione pellicola di materiali ', e di esplorare le loro proprietà ottiche.

Evanescente campo fotoacustica based: ottico valutazione delle proprietà a Surfaces

Qui presentiamo un protocollo per rilevare le mutazioni somatiche tumorali nel DNA circolante presente nei fluidi biologici dei pazienti (biofluidi). Il nostro metodo basato sulla reazione a catena della polimerasi digitale delle goccioline (dPCR) consente la quantificazione della frequenza allelica della mutazione tumorale (MAF), facilitando un complemento minimamente invasivo alla diagnosi e al monitoraggio temporale della risposta tumorale.

Rilevamento e monitoraggio del DNA circolante associato al tumore nei biofluidi dei pazienti

Viene presentato un protocollo per rilevare le cellule tumorali ovariche circolanti utilizzando un sistema di flusso fotoacustico su misura e nanoparticelle di solfuro di rame con cofano con clofatura di acido folico mirati.

Rilevamento del cancro ovarico utilizzando la citometria a flusso fotoacustico

Questo articolo descrive un flusso di lavoro di tecniche impiegate per testare nuovi potenziali mediatori di metastasi del melanoma e i loro meccanismi d'azione.

Una solida piattaforma di scoperta per l'identificazione di nuovi mediatori delle metastasi del melanoma

Questo protocollo fornisce una guida passo passo per la progettazione di un pannello di anticorpi in immunofluorescenza multiplex per l'imaging basato su codici a barre del DNA di tessuti murini di melanoma FFPE. Descriviamo anche una pipeline di analisi delle immagini utilizzando strumenti open-source per generare approfondimenti di proteomica spaziale nel microambiente immunitario del tumore del melanoma murino.

Imaging multiplex a immunofluorescenza basato su codice a barre del DNA per analizzare campioni FFPE da melanoma murino geneticamente riprogrammato

Scopri il rilevamento e l'isolamento delle cellule del melanoma circolanti mediante flussimetria fotoacustica. Questo metodo senza marcatori consente di identificare rapidamente le cellule tumorali prima della formazione di metastasi.

Rilevazione e isolamento delle cellule del melanoma circolanti con flussimetria fotoacustico

Esplora altri video