Monitoraggio delle proteine ​​con a stato solido Nanopori

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di creare nanopori in membrane artificiali da utilizzare negli studi sull'assorbimento delle proteine. Ciò si ottiene perforando nanopori in una membrana di nitruro utilizzando uno stelo. Quindi il nanoporo viene caricato in una camera e viene bagnato con una soluzione ionica.

In modo che il fluido formi un ponte da un lato all'altro del nanoporo per rendere il nanoporo pronto per gli esperimenti. Viene applicata una tensione attraverso di esso e si può osservare una corrente di ioni che lo attraversa. Il passaggio finale consiste nell'aggiungere proteine alla camera dei nanopori.

In definitiva, l'osservazione di blocchi di lunga durata nella corrente ionica attraverso il nanoporo rivela l'assorbimento delle proteine ai lati del nanoporo. Ciao, sono Dave Wicki. Sono uno studente laureato presso il Dipartimento di Fisica della Syracuse University.

Tuttavia, questo metodo può fornire informazioni sull'assorbimento delle proteine su superfici inorganiche. Può essere applicato anche ad altri sistemi come proteine, interazioni tra acidi nucleici, singola molecola per spettroscopia e lo studio di molecole in spazi confinati. Inizia portando lo stelo a una tensione di accelerazione.

Caricamento successivo, una griglia a finestra in nitruro di silicio SPI nel portacampioni TEM. Pulire la griglia con plasma di ossigeno per 30 secondi per rimuovere i detriti. Prima di caricare il campione, caricare il supporto del campione nel TEM e attendere che il vuoto si abbassi.

Utilizzando la modalità TEM in campo chiaro, trova la finestra del nitruro, un quadrato luminoso sul rogramma grezzo. Assicurati che il TEM sia allineato correttamente. Quindi allineare e mettere a fuoco il campione.

Ora metti il sistema in modalità STEM e usa un rivelatore hot off per visualizzare il campione e verificarne l'allineamento. Impostare il monocromatore, se presente, su un valore basso, consentendo una maggiore corrente di elettroni disponibili per la perforazione. Selezionare la dimensione dello spot appropriata per forare il Nanopore in base al diametro della sonda elettronica.

Con lo stelo allineato. Usa il BROGRAM per mettere a fuoco perfettamente la membrana in nitruro all'ingrandimento richiesto. Se c'è qualche movimento del campione, vuoto, il fascio di elettroni e attendere che il campione si stabilizzi.

Questa operazione può richiedere fino a un'ora. Una volta stabilizzata, posizionare la sonda elettronica sul campione e iniziare a perforare il nanoporo. La perforazione di un nanoporo con una TM richiede l'infedeltà del paziente.

È un processo in cui il nitruro viene gradualmente dissipato sotto una sonda a fascio di elettroni. È importante tenere la sonda elettronica direttamente sopra il sito di perforazione e confermare che il nanoporo sia completamente perforato. Prima di rimuovere il campione dal TEM, controllare periodicamente il campione eseguendo la scansione con il rilevatore a caldo.

Se il campione si sposta leggermente, regolare la posizione della sonda elettronica in modo che sia sopra il nanoporo. Con il grammo del ROI a fuoco, il film di nitruro luccicante scomparirà. Quando il nanoporo si forma con il grammo roky fuori fuoco, la frangia dell'unghia sfilacciata è visibile.

Immagine del nanoporo con l'hot off e crea un profilo di intensità dell'immagine. Il diametro del nanoporo può essere stimato dalla regione più scura del profilo. La sonda elettronica può essere utilizzata per ingrandire il nanoporo, se necessario.

Quando ha il diametro richiesto. Passa alla modalità TEM con il monocromatore nell'impostazione standard. Utilizzare TEM in campo chiaro per confermare la dimensione dei pori.

Iniziate preparando le degas di saline. Mettere la soluzione sotto vuoto e in un bagno sonicato per 20 minuti Delicatamente, posizionare il fragile Nanopore contenente trutruro di silicio Chip in un becco di Pyrex da 10 millilitri. Quindi, in una cappa aspirante, posizionare il bicchiere su una piastra calda.

Pulisci molto accuratamente il chip Nanopore con la soluzione piranha. Per prima cosa, aggiungi tre millilitri di acido solforico al contenitore usando una pipetta di vetro. In secondo luogo, aggiungere con cura un millilitro di perossido di idrogeno all'acido solforico.

Si prega di prendere tutte le precauzioni. Lasciare in ammollo il chip nanopore per 10 minuti. Quindi, utilizzando una pipetta di vetro, rimuovere la soluzione di piranha dal becher e smaltirla correttamente.

Quindi, riempi il bicchiere con l'acqua deionizzata Degas. Utilizzando una pipetta di vetro pulita, svuotare il becher dall'acqua e ripetere questo lavaggio almeno cinque volte. Con una pinzetta pulita, rimuovere il chip nanopore e asciugarlo con una leggera aspirazione.

Una volta asciutto, sigillare immediatamente il chip nanopore nella camera. Il chip può essere fissato nella camera con O-ring o sigillante siliconico. Riempire la camera con una soluzione di cloruro di potassio.

Collegare gli elettrodi d'argento e cloruro d'argento alla camera. Gli elettrodi possono essere realizzati immergendo il filo d'argento nella candeggina per una notte. Applicare un potenziale transmembrana attraverso gli elettrodi e monitorare la risposta della corrente utilizzando un amplificatore patch clamp.

Nella modalità di blocco della tensione, costruire una curva di tensione di corrente dalle misurazioni. La curva deve essere molto lineare. Quando si utilizza un molare di cloruro di potassio, la conduttanza del nanoporo dovrebbe corrispondere al suo diametro.

Se il nanoporo non mostra una curva IV lineare, la conduttanza è troppo bassa o la corrente aperta del nanoporo non è stabile. Ciò indica che il nanoporo non è sposato correttamente e il lavaggio del piha deve essere ripetuto. Assicurarsi che il fluido sia all'interno del nanoporo è essenziale.

Se questo passaggio non viene eseguito correttamente, la corrente ionica attraverso il nanoporo mostrerà un rumore molto grande e la partizione delle proteine nel nanoporo sarà drasticamente ridotta. Iniziare aggiungendo un campione purificato della proteina di interesse nel bagno di messa a terra della camera. Attendere che il campione si diffonda completamente.

Applicare una polarizzazione di tensione del potenziale transmembrana con polarità opposta a quella della carica totale della proteina in studio. Un potenziale applicato di 200 millivolt dovrebbe essere abbastanza grande da poter essere osservato. La maggior parte degli eventi degli analiti proteici apparirà come deflessioni transitorie di corrente rispetto al basale.

Se non si osserva alcun segnale, aumentare la concentrazione della proteina nella camera. Tensioni più elevate migliorano il rapporto segnale/rumore e nitruro. I nanopori possono resistere a diversi volt.

Gli assorbimenti proteici appariranno come cambiamenti di lunga durata nella corrente di base del Nanopore. I risultati tipici per i nanopori allo stato solido saranno i seguenti. La corrente a pori aperti dovrebbe essere altamente stabile.

Le caratteristiche IV del nanoporo dovrebbero essere altamente lineari. In un molare di cloruro di potassio, 10 molari di fosfato di potassio pH 7,4, la pendenza di un adattamento lineare alla curva IV fornirà la conduttanza unitaria del nanoporo. La conduttanza ha una relazione diretta con il diametro del nanoporo e dovrebbe corrispondere all'equazione.

Questo valore dovrebbe corrispondere entro il 30%Se il valore è troppo piccolo, è probabile che il poro non sia sposato con l'aggiunta di proteine. L'assorbimento delle proteine è un calo di corrente di lunga durata. Alcune proteine sono altamente labili e subiscono una trasformazione strutturale all'interno dei pori.

In questo caso, la caduta di tensione di lunga durata sarà accompagnata da rapide fluttuazioni. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come produrre nanopori a stato solido utilizzando un microscopio elettronico a trasmissione a scansione e utilizzando l'assorbimento delle proteine SA in bilico. Non dimenticare che lavorare con la soluzione di piranha può essere estremamente pericoloso e precauzioni come lavorare in una cappa aspirante con guanti, un camice da laboratorio e un grembiule chimico dovrebbero sempre essere presi quando si esegue questa procedura.

Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.