Name: Monitoraggio delle proteine con a stato solido Nanopori (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Scopri come creare nanopori a stato solido in membrane di nitruro di silicio per studiare l'adsorbimento proteico a livello di singola molecola. Questo metodo sfrutta la tecnica del resistive-pulse per monitorare in tempo reale le interazioni proteina-superficie.

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Gli autori desiderano ringraziare Giovanni Grazul (Cornell University), Andre Marziali (The University of British Columbia a Vancouver) e Vincent Tabard-Cossa (Università di Ottawa) per i loro consigli. Questo lavoro è finanziato in parte da finanziamenti della US National Science Foundation (DMR-0706517 e DMR-1006332) e il National Institutes of Health (R01-GM088403). La foratura nanoporo è stata eseguita presso l&#39;impianto di Microscopia Elettronica del Centro Cornell per i materiali di ricerca (CCMR) con il sostegno della National Science Foundation - Materials Research Science and Engineering Center (MRSEC) programma (DMR 0520404). La preparazione di membrane di nitruro di silicio è stato eseguito presso l&#39;impianto di Cornell nanoscala, un membro della Rete Nazionale delle infrastrutture Nanotechnology, che è supportato dalla National Science Foundation (Grant ECS-0335765).

1. Produzione di stato solido nanopori nelle membrane di nitruro di silicio <ol><li> Portare la FEI Tecnai F20 S / TEM ad una tensione di accelerazione di 200 kV. Se si utilizza un diverso S / TEM, la tensione di accelerazione deve essere maggiore o uguale a 200 kV 9 </li><li> Carica un 20 nm di spessore SPI griglia di nitruro di silicio finestra nel porta-campione TEM e pulite, con plasma di ossigeno per 30 secondi per rimuovere eventuali contaminanti dal supporto. </li><li> Caricare il campione in S / TEM e consentire la pompa a vuoto verso il basso. Una volta che il S / TEM ha pompato fino a vuoto, la finestra di nitruro di trovare in campo chiaro modo TEM cercando un quadrato luminoso sul Ronchigram. Assicurarsi che il TEM è allineato correttamente, quindi allineare e mettere a fuoco il campione. </li><li> Accendere il S / TEM in modalità STEM. Utilizzare il (o equivalente) HAADF rivelatore per l&#39;immagine del campione e assicurarsi che sia correttamente allineata. </li><li> Impostare il Monocromatore ad un valore basso. Un valore inferiore del Monocromatore consente una maggiore valutet degli elettroni disponibili per la foratura. Se S / TEM non ha un monocromatore, ignorare questo passaggio. </li><li> Selezionare una dimensione appropriata posto per la foratura del nanoporo. Ciò corrisponde al diametro della sonda di elettroni. A 3 nm sonda funziona bene per la foratura 5 pori di diametro nm. Una sonda più grande (5 nm) si punta in modo più rapido e creare un poro più grande. Una sonda più piccola (1 nm) ci vorrà più tempo per perforare e creare un poro più piccolo. </li><li> Regolare gli allineamenti STEM, se necessario. </li><li> Attenzione la membrana di nitruro e portarlo a un ingrandimento di x1.3M. Messa a fuoco bene dovrebbe essere fatto attraverso il monitoraggio della Ronchigram. </li><li> Se c&#39;è qualche movimento del campione, quindi attendere che il campione si stabilizzi. Questo può richiedere fino a un&#39;ora. Vuoto il fascio di elettroni in attesa in modo da non danneggiare il nitruro. </li><li> Posizionare la sonda di elettroni sul campione e iniziare foratura. </li><li> Controllare periodicamente il campione attraverso la scansione con il rivelatore HAADF, sia per assicurarsi che il nanoporo viene drilled (sembrerà una macchia scura) e per controllare che non vi è alcun movimento del campione. Se il campione si sposta leggermente, regolare la posizione della sonda di elettroni ad essere il nanoporo. </li><li> Guarda il Ronchigram per identificare quando il poro è formato. Quando a fuoco, il film di nitruro ha un aspetto luccicante. Questo scompare quando le forme nanoporo. Mettere il Ronchigram leggermente fuori fuoco permette di vedere una frangia Fresnel associata alla nanoporo. </li><li> Prendete un&#39;immagine del nanoporo con il HAADF. </li><li> Fare un profilo di intensità dell&#39;immagine nanoporo. Il diametro del nanoporo può essere stimato dalla regione più scura del profilo. </li><li> L&#39;allargamento del nanoporo può essere eseguita spostando la sonda di elettroni lungo i bordi del poro. </li><li> Una volta che il nanoporo è del diametro desiderato, posizionare la S / TEM in modo TEM. </li><li> Portare il Monocromatore l&#39;impostazione standard e l&#39;immagine del nanoporo con campo chiaro TEM per confermare la dimensione <strong&gt; (Fig. 1). </li></ol> 2. Bagnatura a stato solido nanoporo <ol><li> De-gas acqua deionizzata contenente 1 M KCl, 10 mM di potassio fosfato, pH 7,4. Questo può essere fatto mettendo le soluzioni sotto vuoto e mettendoli in un bagno sonicatore per 20 minuti. </li><li> Posizionare il nanoporo contenenti chip di nitruro di silicio in un bicchiere da 10 ml Pyrex. Fare attenzione a non rompere la finestra di nitruro di quanto è molto delicato. Porre il becher su piastra in una cappa aspirante e impostare a 100 ° C. </li><li> Pulire il chip nanoporo con soluzione piranha con grande cura. In primo luogo aggiungere 3 ml di acido solforico al contenitore con una pipetta di vetro. Successivamente, con attenzione aggiungere 1 ml di perossido di idrogeno per l&#39;acido solforico per rendere la soluzione piranha 14. Si prega di prendere tutte le precauzioni. </li><li> Lasciare il chip nanoporo in ammollo in una soluzione piranha per 10 minuti. </li><li> Rimuovere la soluzione piranha dal bicchiere con una pipetta di vetro. Mettere in un recipiente corretta conservazione. </li><li> Fill il bicchiere con la de-gasati, acqua deionizzata usando una pipetta di vetro pulito. Bicchiere vuoto di acqua e ripetere almeno 5 volte. </li><li> Rimuovere il chip nanoporo con una pinzetta pulita e asciutta dalla luce di aspirazione </li><li> Immediatamente, sigillare il chip nanoporo nella camera (Fig. 2a, 2b). Il chip può essere fissato nella camera da O-ring o sigillante siliconico. </li><li> Riempire la camera con soluzione di KCl </li><li> Collegare l&#39;Ag / AgCl elettrodi alla camera (Fig. 2b). Elettrodi può essere effettuato mediante ammollo filo d&#39;argento in candeggina durante la notte. </li><li> Applicare un potenziale transmembrana attraverso gli elettrodi e monitorare la risposta corrente utilizzando un Axon 200B patch-clamp amplificatore in voltage-clamp mode. </li><li> Costruire un I / V (corrente-tensione) curva da misurazioni. L&#39;I / V curva deve essere altamente lineare quando si usa 1 M KCl (Fig. 3). Conduttanza del nanoporo deve corrispondere al suo diametro. Se il nanoporo non visualizzalineare I / V curva, la conduttanza è troppo bassa, o la corrente aperta del nanoporo non è stabile (Fig. 4a), significa che il nanoporo non è adeguatamente bagnato e lavaggio piranha deve essere ripetuto. </li></ol> 3. Monitoraggio delle proteine <ol><li> E &#39;di fondamentale importanza per effettuare esperimenti di controllo con un unico nanoporo membrana o array parallelo di nanopori (vedi sotto) per monitorare la corrente con le condizioni di buffer manca il campione. Vi consigliamo i seguenti due passi: (i) l&#39;utilizzo di un alto livello di purezza del buffer (purezza&gt; 99,9%; cromatografia-grade livello), e (ii) l&#39;uso di un buffer la cui interazione con il nanoporo a stato solido non produrre monocanale eventi. Inoltre, si consiglia di ottenere un elevato grado di purezza del campione di proteine ​​utilizzando le normali procedure di chimica delle proteine. La purezza del campione di proteine ​​deve essere controllato da sodio dodecil solfato-poliacrilammide (SDS-PAGE) e analisi di gel ad alta risoluzione maspettrometria di ss 15. </li><li> Aggiungere un campione purificato della proteina da studiare a terra nel bagno della camera. Lasciare il tempo per il campione di diffondersi in tutto il bagno. Concentrazioni tipiche di proteine ​​che può essere misurata in decine di nM alla gamma mM 7,15-21. </li><li> Applicare un potenziale bias di transmembrana tensione con polarità opposta a quella della carica totale della proteina oggetto di studio. Per esempio, BSA ha un efficace carica netta negativa a pH 7,4, e quindi una tensione di polarizzazione positiva deve essere applicato. La tensione applicata crea gradiente di potenziale all&#39;interno del nanoporo interni e le proteine ​​di cariche opposte sarà guidata da forze opposte. Solo polarità della tensione che guidano le proteine ​​nel nanoporo creerà segnali misurabili. </li><li> Un potenziale applicato di grandezza di 200 mV dovrebbe essere grande abbastanza per osservare analiti più proteine. Eventi apparirà come transitori attuali deviazioni dalla linea di fondo (Fig. 4b).Se nessun segnale è osservato, aumentare la concentrazione della proteina nella camera. Tensioni superiori migliorare il rapporto segnale-rumore. Nanopori nitruro in grado di sopportare parecchi volt. </li><li> Adsorptions proteina apparirà come longeva cambiamenti nella linea di base corrente del nanoporo (Fig. 4c). </li></ol> 4. Possibilità di funzionalizzazione dei nanopori Esistono diversi metodi per l&#39;applicazione di gruppi funzionali di nitruro di silicio 22,23. La maggior parte dei film di nitruro di un sottile strato di ossido sulla parte esterna e l&#39;esposizione all&#39;ozono può creare un ulteriore strato di ossido, se necessario. Organosilani possono essere usati diversi e di auto-assemblati sui livelli del genere. Di particolare interesse è aminosilane, che auto-assembla e può essere ulteriormente modificato (per esempio acido carbossilico e aldeidi), consentendo l&#39;ispezione di una vasta gamma di superfici organiche. Dopo un nanoporo è stato lavato con piranha e fissato nel Chamber, amine possono essere aggiunti direttamente al bagno camera con un elettrolita di supporto di 0,5 M TBACl (tetrabutilammonio) e MeOH anidro (metanolo) usato come solvente. Formazione di monostrato può essere monitorato attraverso l&#39;applicazione di un bias tensione 400 mV e la misura della caduta di corrente 23. 5. Determinazione del primo ordine apparente velocità di reazione costante e la Langmuir adsorbimento costante utilizzo di matrici nanoporo parallelo 5.1 Il primo ordine apparente costanti di velocità di reazione per l&#39;assorbimento e desorbimento Sottolineiamo che l&#39;aspetto positivo di questa metodologia è la sua capacità di osservare adsorptions individuali a livello di singola molecola. La singola molecola misure di proteine ​​adsorbimento su una superficie inorganica può essere scalata fino impiegando matrici parallele a stato solido nanopori. L&#39;array parallelo di nanopori è necessaria a causa della necessità di pori molti test per ottenere statistiche affidabilis. A tal fine, l&#39;uso di un array nanoporo permetterebbe il monitoraggio delle adsorptions individuali così come la misurazione di più eventi per ulteriori analisi. Un array di nanopori in nitruro di silicio può essere costituita dal protocollo sopra semplicemente fori multipli nel campione. Ogni nanoporo dovrebbe essere di dimensioni simili. Array di nanopori di 6x6 o 7x7 dovrebbe essere adeguato. Dopo l&#39;aggiunta di analita proteico nella camera, la corrente decade in modo esponenziale con la seguente espressione: I t = I ∞ - (I ∞ - I 0) exp (-k &#39;t) Ecco, io t, indica la corrente in un tempo t sperimentale. I 0 è il passaggio originale corrente attraverso l&#39;array nanoporo. I ∞ indica la corrente a livello di saturazione (cioè infinito). K &#39;è l&#39;apparente primo ordine velocità di reazione costante, che può essere determinato da the in forma della curva sperimentale. Una maggiore k &#39;può essere interpretato come un tasso più veloce assorbimento. Il rapporto I ∞ / I 0, detta anche la saturazione normalizzato corrente, è un numero adimensionale compreso tra 0 e 1. Questo parametro è una misura della occupazione da parte degli analiti proteine ​​adsorbite. Pertanto, ogni condizione diversa sperimentale dovrebbe essere associata a due parametri di output specifici I ∞ / I 0 e k &#39;. Va notato che l&#39;apparente primo ordine costanti di velocità di assorbimento e le correnti normalizzate sono influenzati dal tempo effettivo di permanenza delle proteine ​​all&#39;interno del nanopori. Questa volta dipende dalla concentrazione di analiti di proteine ​​alla rinfusa fase acquosa 24. Pertanto, la correzione aggiuntiva di questi numeri deve essere attuato in base al tempo effettivo di permanenza delle proteine ​​all&#39;interno del nanoporo interni. Si consiglia la misurazione della frequenza dei fast (traslocazione) manifestazioni e moltiplicandolo per il tempo di permanenza media di tali eventi. Questo darà il tempo medio trascorso all&#39;interno delle proteine ​​all&#39;interno nanoporo per unità di tempo. Il tasso costante di desorbimento può essere determinata utilizzando una matrice parallelo di nanopori pure. Non appena il livello corrente raggiunge la saturazione (I ∞), la tensione deve essere invertito, quindi non più proteine ​​sono intrappolati nel nanopori. Desorbimento delle singole proteine ​​saranno accompagnati da alterazione della corrente ha registrato una maggiore valori. La costante di velocità sarà poi estratto dalle aumento del livello attuale. 5.2 La costante di adsorbimento Langmuir L&#39;assorbimento di analiti proteici sulle superfici inorganiche del nanopori dipende dalla concentrazione di proteine ​​in fase acquosa. Questo fenomeno è già stato osservato nel singola molecola livello 13. Se θ rappresentano<html> s la corrente di saturazione normalizzato (∞ I / I 0), poi una tipica equazione isoterma di Langmuir è data dalla seguente espressione: <img alt="Figura 5.2" src="/files/ftp_upload/3560/3560fig5_2.jpg" /> dove C è la concentrazione di proteine ​​in fase acquosa. α è la costante di adsorbimento Langmuir. Questo aumenta costante con un aumento della energia di legame di adsorbimento e con una diminuzione della temperatura. La raccolta dei punti dati θ darà lavoro a misure con array paralleli effettuati in varie concentrazioni di proteine ​​in fase acquosa. I dati dovrebbero essere analizzati in combinazione con altre tecniche per verificare la grandezza della costante di Langmuir dotato di adsorbimento. Inoltre, le simulazioni molecolari full-atomistica dinamica 25,26 potrebbe anche essere utilizzato per aiutare le interpretazioni dei dati sperimentali ottenuti. titolo &quot;&gt; 6. Risultati Rappresentante I risultati tipici per solid-state nanopori sarà la seguente. La corrente a poro aperto dovrebbe essere altamente stabile, come si vede nella fig. 4 bis. I / V caratteristiche del nanoporo dovrebbe essere altamente lineare in 1 M KCl, 10 potassio fosfato, pH 7,4, come si vede nella fig. 2. La pendenza di una misura lineare di I / V curva fornirà la conduttanza unitaria del nanoporo. La conduttanza è una relazione diretta al diametro nanoporo e deve corrispondere l&#39;equazione: <img alt="Figura equazione" src="/files/ftp_upload/3560/3560figeqn.jpg" /> , Dove G è la conduttanza del nanoporo, d è il diametro, l è la sua lunghezza, e σ è la conducibilità della soluzione nella camera 14. Questo valore deve corrispondere entro il 30%. Se è troppo piccolo, il poro non è probabilmente bagnata. Con l&#39;aggiunta di proteine, eventi rapidi dovrebbe derivarne, come si vede nella fig. 4b. Protein adsorbimento è un longevo caduta di corrente come mostrato in fig. 4c. Alcune proteine ​​sono molto labili e subiscono trasformazioni strutturali all&#39;interno del poro interno. In questo caso, il longevo caduta di tensione sarà accompagnato da rapide fluttuazioni. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3560/3560fig1.jpg" /> Figura 1. Nanoporo a stato solido realizzati con un F20 Tecnai S / TEM. Il poro è stato perforato in modalità STEM ad un diametro di 20 nm. L&#39;immagine è stata scattata in campo chiaro modo TEM. Nitruro è stata di 30 nm di spessore. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3560/3560fig2.jpg" /> Figura 2. Camera utilizzati per ospitare un singolo stato solido nanoporo in resistivo impulsi misurazioni. A) Camera e un chip di silicio con free-standing finestra di nitruro (griglia TEM). Il nanoporo è esercitato nel nitruro prima di caricarla. Rosso o-ring vengono utilizzati per formare un buon seal circa il chip, che separa due bagni di soluzione ionica. B) Schema della camera che mostra il posizionamento dei bagni di soluzione ed elettrodi rispetto alla nanoporo. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3560/3560fig3.jpg" /> Figura 3. Tipiche di I / V per tracce a stato solido nanopori di diverso diametro. Tracce monocanale elettrici sono stati presi in 1 M KCl, 20 mM Tris, pH 8,5. Nanopori sono stati perforati nitruro di silicio a 30 nm di spessore. Nitruro di spessore nota influenzerà la conduttanza unitaria del nanoporo. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3560/3560fig4.jpg" /> Figura 4. Misurata monocanale tracce di corrente e il rilevamento di proteine ​​di adsorbimento. A) Un solo canale traccia elettrica che mostra la corrente aperta di un nanoporo 10 nm di diametro. B) deviazioni correnti rappresentano il partizionamento di albumina bovina (BSA) nella interior del nanoporo. C) Adsorbimento di BSA sulla superficie del nitruro. Tutte le tracce sono della stessa nanoporo in 1 M KCl, 10 mM di potassio fosfato, pH 7,4. Il potenziale transmembrana è stata applicata 40 mV e BSA è stato aggiunto al bagno camera di messa a terra ad una concentrazione di 120 nM.

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<li>Siwy, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+biosensors+based+on+biofunctionalized+conical+gold+nanotubes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Protein biosensors based on biofunctionalized conical gold nanotubes.</a> J. Am. Chem. Soc. 127, 5000-5001 (2005).</li>
<li>Ding, S., Gao, C., Gu, L. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+Single+Molecules+of+Immunoglobulin+and+Ricin+with+an+Aptamer-Encoded+Glass+Nanopore%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Capturing Single Molecules of Immunoglobulin and Ricin with an Aptamer-Encoded Glass Nanopore.</a> Anal. Chem. , (2009).</li>
<li>Kim, M. -J., Wanunu, M., Bell, C. D., Meller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Fabrication+of+Uniform+Size+Nanopores+and+Nanopore+Arrays+for+Parallel+DNA+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">Rapid Fabrication of Uniform Size Nanopores and Nanopore Arrays for Parallel DNA Analysis.</a> Adv. Mater. 18, 3149-3153 (2006).</li>
<li>Bezrukov, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+channels+as+molecular+Coulter+counters+to+probe+metabolite+transport%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Membr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Ion channels as molecular Coulter counters to probe metabolite transport.</a> J. Membr. Biol. 174, 1-13 (2000).</li>
</ol>

Non abbiamo nulla da rivelare.

Adsorbimento spontanea di proteine ​​su superfici a stato solido 27-29 è di fondamentale importanza in numerosi settori, quali le applicazioni biochip e la progettazione di una nuova classe di biomateriali funzionali ibride. Studi precedenti hanno dimostrato che le proteine ​​adsorbite a stato solido superfici non mostrano la mobilità laterale o tassi di desorbimento significative, e quindi delle proteine ​​è generalmente considerato un processo irreversibile e non specifico 30-32. Delle proteine ​...

<table border="1"><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> Tecnai F20 S / TEM </td><td> FEI </td><td></td><td> S / TEM richiede una tensione di accelerazione ≥ fonte 200kV e campo di emissione. </td></tr><tr><td> 20 nm di spessore della membrana finestra di nitruro di silicio per TEM </td><td> SPI </td><td> 4163SN-BA </td><td></td></tr><tr><td> Axon Axopatch 200B patch-clamp amplificatore </td><td> Molecular Devices </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Axon Digidata 1440A </td><td> Molecular Devices </td><td></td><td></td></tr><tr><td> pCLAMP 10 software </td><td> Molecular Devices </td><td></td><td> Elettrofisiologia di acquisizione dati e analisi del software </td></tr><tr><td> Acido solforico </td><td> Fisher scientifico </td><td> A300 </td><td></td></tr><tr><td> perossido di idrogeno </td><td> Fisher Scientific </td><td> H325 </td><td></td></tr><tr><td> silicone O-ring </td><td> McMaster-Carr </td><td> 003 S70 </td><td> In alternativa utilizzare PDMS </td></tr><tr><td> Filo d&#39;argento </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 348759 </td><td> Per elettrodi </td></tr><tr><td> SPC Technology, D-sub contatto, pin </td><td> Newark </td><td> 9K4978 </td><td> Per elettrodi </td></tr><tr><td> cloruro di potassio </td><td> Sigma </td><td> P9541 </td><td></td></tr><tr><td> potassio fosfato bibasico </td><td> Sigma </td><td> P2222 </td><td></td></tr><tr><td> potassio fosfato monobasico </td><td> Sigma </td><td> P5379 </td><td></td></tr><tr><td> PDMS </td><td> Dow Corning </td><td></td><td> Sylgar 184 Eelastomero set. Per fare da camera. </td></tr><tr><td> Kwik-Cast Sigillante </td><td> Mondo Strumenti di precisione </td><td> KWIK-CAST </td><td> Veloce sigillante siliconico recitazione </td></tr><tr><td> piastra calda </td><td> Fisher Scientific </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Gabbia di Faraday </td><td></td><td></td><td></td></tr></table>

monitoraggio delle proteine ​​con a stato solido nanopori

Monitoring Protein Adsorption with Solid-state Nanopores

A stato solido nanopori sono stati utilizzati per eseguire misure a livello di singola molecola per esaminare la struttura locale e la flessibilità degli acidi nucleici 1-6, lo svolgimento delle proteine ​​7 e affinità di legame di ligandi diversi 8. Accoppiando questi nanopori alla tecnica resistivo impulsi 9-12, tali misure può essere effettuata sotto una grande varietà di condizioni e senza la necessità di etichettatura 3. Nel resistivo impulsi tecnica, una soluzione di sale ionico viene introdotto su entrambi i lati del nanoporo. Pertanto, gli ioni sono guidate da un lato all&#39;altro della camera all&#39;altra da un potenziale transmembrana applicata, determinando una corrente costante. Il partizionamento di un analita nel nanoporo provoca una deflessione ben definito in questa corrente, che possono essere analizzati per estrarre singola molecola informazioni. Utilizzando questa tecnica, l&#39;adsorbimento di singole proteine ​​alle pareti nanoporo può essere monitorato con una vasta gamma dicondizioni 13. Delle proteine ​​è sempre più importante, perché come dispositivi microfluidici ridursi in dimensione, l&#39;interazione di questi sistemi con le proteine ​​singolo diventa un problema. Questo protocollo descrive un test rapido per la proteina legante ai film nitrati, che possono facilmente essere estesa ad altri film sottili suscettibili di foratura nanoporo, o di nitruro di superfici funzionalizzate. Una varietà di proteine ​​può essere esplorato in un&#39;ampia gamma di soluzioni e condizioni di denaturazione. Inoltre, questo protocollo può essere utilizzato per esplorare più problemi di base utilizzando la spettroscopia nanoporo.

Un metodo di utilizzo allo stato solido nanopori per monitorare la non-specifico di assorbimento delle proteine ​​su una superficie inorganica viene descritta. Il metodo impiega il resistivo impulsi principio, consentendo l&#39;assorbimento di essere sondato in tempo reale e al livello di singola molecola. Poiché il processo di assorbimento delle proteine ​​singolo è lontano dall&#39;equilibrio, proponiamo l&#39;impiego di matrici parallele di nanopori sintetici, permettendo per la determinazione quantitativa del primo ordine apparente velocità di reazione costante assorbimento di proteine, nonché e il Langmuir adsorbimento costante.

Monitoraggio delle proteine ​​con a stato solido Nanopori

I nanopori allo stato solido sono stati utilizzati per eseguire misurazioni a livello di singola molecola al fine di esaminare la struttura locale e la flessibilità degli acidi nucleici...

L'obiettivo generale di questa procedura è creare nanopori in membrane artificiali per l'utilizzo in studi sull'assorbimento delle proteine. Questo viene ottenuto praticando nanopori in una membrana di nitruro mediante un microscopio elettronico a scansione (STEM). Successivamente, il nanoporo viene inserito in una camera e bagnato con una soluzione ionica.In modo che il liquido formi un ponte da un lato del nanoporo all'altro per rendere il nanoporo pronto per gli esperimenti. Viene applicata una tensione ai suoi capi e si può osservare un passaggio di corrente ionica attraverso di esso. L'ultimo passaggio consiste nell'aggiungere la proteina alla camera del nanoporo.L'osservazione finale di blocchi a lunga durata nella corrente ionica attraverso il nanoporo rivela l'assorbimento di proteine sui lati del nanoporo. Ciao, sono Dave Wicki. Sono uno studente laureato del Dipartimento di Fisica della Syracuse University.Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sull'assorbimento di proteine su superfici inorganiche, può essere applicato anche ad altri sistemi, come le interazioni tra proteine e acidi nucleici, la spettroscopia di singole molecole e lo studio di molecole in spazi

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I seguenti dettagli approccio di impostazione di cattura a bassa potenza ottica di dielettrico nanoparticelle con un doppio nanohole in film metallico.

Trapping ottica di nanoparticelle

Questo video descrive la tecnica di risonanza plasmonica di superficie, o SPR, per studiare l'interazione tra due molecole utilizzando un chip sensore. La variazione dell'angolo di risonanza e l'intensità della luce riflessa vengono rilevate in funzione dell'associazione e della dissociazione di due molecole, e questo fornisce informazioni sulle interazioni tra le due molecole.

Risonanza plasmonica di superficie per studiare le interazioni biomolecolari utilizzando un chip sensore

Una metodologia per la preparazione di nanopori a stato solido in soluzione per esperimenti di traslocazione biomolecolari è presentato. Applicando brevi impulsi di campi elettrici elevati, il diametro nanoporo può essere ampliata in modo controllabile con precisione subnanometer e le sue caratteristiche di rumore elettrico significativamente migliorata. Questa procedura viene eseguita in situ utilizzando apparecchiature di laboratorio standard in condizioni sperimentali.

Ottimizzazione delle dimensioni e minimizzando il rumore di stato solido Nanopori

Surface Plasmon Resonance (SPR) è un metodo privo di etichetta per la rilevazione delle interazioni biomolecolari in tempo reale. Qui, un protocollo per una proteina di membrana: esperimento recettore è descritto, discutendo i pro ei contro della tecnica.

Le misurazioni in tempo reale delle Membrane Protein: recettore interazioni Uso risonanza plasmonica di superficie (SPR)

Il protocollo presentato descrive l'analisi del trasporto mediato da proteine di membrana a livello di singolo trasportatore utilizzando doppi strati lipidici privi di solventi che attraversano i pori. Ciò si ottiene grazie alla creazione di chip array di nanopori prodotti in serie, combinati con l'acquisizione e l'analisi dei dati altamente parallele, consentendo la futura creazione di screening degli effettori delle proteine di membrana.

Trasporto di membrana processi analizzati da un altamente parallelo sistema Nanopore Chip a risoluzione della proteina singolo

Qui usiamo un nanoporo sintonizzabile poliuretano integrato in una tecnica di rilevamento di impulsi resistivo caratterizzare nanoparticelle chimica di superficie tramite la misura della velocità di traslocazione delle particelle, che può essere utilizzato per determinare il potenziale zeta delle singole nanoparticelle.

Determinazione della Zeta Potenziale tramite nanoparticelle Traslocazione Le velocità attraverso una Tunable Nanopore: usando le particelle di DNA modificato come esempio

Un processo di fabbricazione di microchip che incorpora pinzette plasmoniche è presentato qui. Il microchip permette l'imaging di una particella intrappolata per misurare forze di cattura massime.

Plasmonico cattura e rilascio di nanoparticelle in un ambiente di monitoraggio

Qui, presentiamo un protocollo per rilevare cluster di ossigeno metallico discreti, poliossimetalati (POM), al limite di singole molecole utilizzando una piattaforma elettronica biologica basata su nanopori. Il metodo fornisce un approccio complementare agli strumenti chimici analitici tradizionali utilizzati nello studio di queste molecole.

Caratterizzazione fisica ad alta risoluzione di nanoparticelle metalliche singole

Qui, presentiamo un protocollo per la fabbricazione di un elettrodo di tipo chiuso senza fili nanopore e successiva misura elettrochimica delle nanoparticelle singole collisioni.

Un elettrodo di tipo chiuso senza fili Nanopore per analizzare le singole nanoparticelle

Il primo passo nella comprensione dell'interazione tra biomolecola e fase solida inorganica sta rivelando costanti fisico che possono essere valutate stabilendo isotermim di adsorbidimento. L'assorbemento dalla fase liquida è limitato da cinetica, capacità superficiale, pH e adsorbimento competitivo, che tutti dovrebbero essere considerati con cautela prima di impostare un esperimento di adsorbimento.

Studio della breve pubblicità peptide sulla soluzione Dispersi Nanoparticelle inorganiche

Le nanopinzette plasmoniche utilizzano la risonanza plasmonica di superficie localizzata nelle nanostrutture d'oro per intrappolare singole nanoparticelle, comprese le proteine, all'interno di un campo ottico su scala nanometrica. I cambiamenti nel segnale diffuso rivelano la presenza di proteine e la dinamica conformazionale, consentendo il monitoraggio senza modifiche dei fluorofori o tethering di superficie.

Monitoraggio della dinamica conformazionale di singole proteine non modificate mediante Nanotweezers plasmonici

Scopri come creare nanopori a stato solido in membrane di nitruro di silicio per studiare l'adsorbimento proteico a livello di singola molecola. Questo metodo sfrutta la tecnica del resistive-pulse per monitorare in tempo reale le interazioni proteina-superficie.

Monitoraggio delle proteine ​​con a stato solido Nanopori

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