Name: Tutta la perfusione di fissaggio degli animali per i roditori (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-30T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Impara la tecnica di perfusione con paraformaldeide al 4% per preservare il tessuto cerebrale di ratto. Questo metodo a basso costo utilizza pressioni fisiologiche per garantire una fissazione ottimale per l'immunoistochimica.

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Questo lavoro è stato finanziato dal Center for Neural Communication Technology (CNCT), un P41 Resource Center finanziato dal National Institute of Biomedical Imaging e Bioingegneria (NIBIB, P41 EB002030) e sostenuto dal National Institutes of Health (NIH).

1. Preparare Fixative (Vedi tabella Fissativo e tamponi.) 2. Preparare buffer perfusione (Vedi tabella Fissativo e tamponi.) 3. Preparare Apparecchiatura e Anestesia <ol><li> Utilizzando il bagno d&#39;acqua, calda tampone perfusione a 37 ° C. Luogo valvola di scarico in un bicchiere pieno di buffer. Riempire una siringa da 50 ml con il tampone e fissarlo al tubo fissativo. Lavare ripetutamente espellendo tubo e della revoca dello buffer. </li><li> Deselezionare la linea con buffer fino a quando tutte le bolle d&#39;aria nelle tubazioni vengono eliminati. È fondamentale per il successo di una perfusione non avere bolle d&#39;aria in qualsiasi delle linee. </li><li> Rimuovere la siringa e collegare il fissativo paraformaldeide al 4% (temperatura ambiente) del contenitore. Per evitare bolle d&#39;aria alla fine tubo, spremere il tubo mentre posizionare il tubo nel contenitore in modo che una goccia di tampone sporge dalla t fineO contattare la superficie del liquido all&#39;interno del contenitore. </li><li> Chiudere la porta di uscita (fine ago). Ruotare valvola tampone (blu) nella stessa posizione della valvola fissativo (bianco). Ciò consentirà il flusso dalla linea solo tampone. </li><li> Aprire la porta di uscita e ripetere il passo da A1 a A3 per il riempimento della linea di buffer. Dopo che tutte le bolle d&#39;aria vengono eliminati chiudere la porta di uscita, rimuovere la siringa e collegare il contenitore buffer, facendo attenzione a non introdurre bolle d&#39;aria nel tubo. </li><li> Sistema di test per la capacità di mantenere la pressione pompando il blub manometro in gomma. Non vi è normalmente una certa resistenza dovuta alla compressione di aria nel sistema. </li><li> File di installazione di chirurgia per consentire facile accesso. Riempire l&#39;ago perfusione con tampone per eliminare la possibilità di bolle d&#39;aria. </li><li> Prima dell&#39;intervento, uno ketamina / xilazina miscela (fino a 80 mg / kg di peso corporeo ketamina e 10 mg / kg di peso corporeo xilazina) viene somministrato mediante iniezione intraperitoneale (27 gauge e 1 siringa cc). Somministrazione supplementare di anestetico viene eseguita come necessario nel corso di ogni operazione di mantenere un piano chirurgica di anestesia. </li></ol> 4. Perfusione Chirurgia <ol><li> Una volta che l&#39;animale ha raggiunto un piano di anestesia chirurgica, posizionarlo sul vassoio poco profondo riempito con ghiaccio tritato. (Usare una convergenza pinch-risposta metodo per determinare la profondità dell&#39;anestesia. Animale deve essere non risponde prima di continuare). </li><li> Eseguire un&#39;incisione 5-6 cm lateralmente attraverso l&#39;involucro e la parete addominale appena sotto la gabbia toracica. Accuratamente separare il fegato dal diaframma. </li><li> Fai una piccola incisione nella membrana utilizzando le curve, le forbici. La posizione e la pressione del dito può aiutare nella capacità di tagliare il diaframma. </li><li> Continuare la membrana incisione lungo l&#39;intera lunghezza della gabbia toracica per esporre la cavità pleurica. </li><li> Posizionare le forbici curve, lungo un lato delle costole, con attenzione spostando i polmoni, e fare un cut attraverso la gabbia toracica fino alla clavicola. Fare un taglio simile sul lato controlaterale. </li><li> Sollevamento dello sterno via, tagliare con cura qualsiasi tessuto di collegarlo al cuore. Bloccare la punta dello sterno con la pinza emostatica e posizionare la pinza emostatica sopra la testa. Se fatto correttamente, il timo solleva lontano dal cuore insieme con lo sterno, fornendo una visione chiara dei vasi sanguigni principali. </li><li> Fai una piccola incisione alla estremità posteriore del ventricolo sinistro con le forbici iris. </li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3564/3564step7.jpg" /> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3564/3564step7large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <ol start="8"><li> Passare a 15-gauge perfusione smussata o di olio di punta attraverso il ventricolo taglio in aorta ascendente. La punta deve essere visibile attraverso la parete dell&#39;aorta, e non dovrebbe raggiungere l&#39;arco aortico dove le arterie carotidee brachiale e divergono. </li><li> Utilizzare una pinza emostatica per bloccare il cuore, questo assicura l&#39;ago e impedisce la fuoriuscita. Se desiderato, all&#39;emostato modificato può essere utilizzato per bloccare l&#39;aorta intorno alla punta dell&#39;ago (questi hemostats mantenuto fino a quando inizia dissezione, ma sono omessi dalle illustrazioni futuri per chiarezza). </li><li> Infine, per effettuare un&#39;incisione all&#39;atrio destro dell&#39;animale usando forbici iris per creare una presa più grande possibile, senza danneggiare l&#39;aorta discendente. A questo punto l&#39;animale è pronto per essere perfuso. </li></ol> 5. Perfusione <ol><li> Aprire la porta di uscita e collegare all&#39;ago di base facendo attenzione a non introdurre eventuali bolle d&#39;aria. </li><li> Gonfiare il bulbo manometro ad una pressione di 80 mmHg rapidamente e uniformemente. Mantenere questa pressione per tutto il periodo di infusione buffer. Avviare il timer. </li><li> Regolare l&#39;angolo ago. L&#39;angolo dell&#39;ago è critica per il raggiungimento di una portata massima (notare la variazione di flusso con regolazione dell&#39;angolo). </li><li> Accendere il buffer valvola (blu), una volta tampone è quasi finito (200 ml). Il fluido deve essere in esecuzione chiaro. La compensazione del fegato è un indicatore di un buon perfusione. Il fegato dovrebbe essere chiaro a questo punto. Indicare il tempo per i vostri record. </li><li> Tremori di fissaggio devono essere osservate in pochi secondi, questo dovrebbe essere considerato il vero tempo di fissazione. Indicare il tempo per i vostri record. </li><li> La pressione può essere gradualmente aumentare fino ad un massimo di 130 mm Hg 2 per mantenere un tasso costante di flusso. </li><li> Chiudere la valvola di scarico una volta che il fissativo è quasi finito. Indicare ora di fine per i vostri record. </li><li> Il topo deve essere rigido in questa fase. </li><li> La paraformaldeide utilizzato deve essere raccolto e conservato per lo smaltimento secondo le norme della vostra istituzione. </li></ol> 6. Dissezione 4,11 <ol><li> Togliere la testa con un paio di forbici. </li><li> Fai una incisione lungo la linea mediana tegumento dal collo al naso ed esporre ilcranio. </li><li> Tagliare il muscolo restante collo in modo che la base del cranio è esposto; rimuovere ogni residuo di muscolo utilizzando forbici o Rongeurs. </li><li> Posizionare la punta di un paio di forbici iride in forame da un lato, le forbici accuratamente scorrere lungo la superficie interna del cranio. </li><li> Successivamente, un taglio che si estende al bordo distale della superficie posteriore cranio. Fare un taglio identico sul lato controlaterale. Utilizzare i Rongeurs di sgombrare il cranio intorno al cervelletto. </li><li> Scorrere delicatamente le forbici lungo la superficie interna del cranio come la punta viaggia dal dorsale angolo distale posteriore al bordo distale frontale del cranio, sollevando la lama, come si sta tagliando per evitare danni al cervello. Ripetere sul lato opposto. </li><li> Utilizzando Rongeurs sbucciare la superficie dorsale del cranio fuori dal cervello. Rifilare i lati del cranio utilizzando Rongeurs pure. </li><li> Utilizzando una spatola, tagliare i bulbi olfattivi e le connessioni nervosezioni lungo la superficie ventrale del cervello. </li><li> Delicatamente stuzzicare il cervello fuori dalla testa, ogni taglio dura che collega ancora il cervello al cranio con le forbici iris. </li><li> Rimuovere il cervello e collocarlo in una fiala di liquido fissativo contenente almeno 10 volte il volume del cervello. Agitare il flacone di tanto in tanto. </li></ol> 7. Post-fissazione &amp; Storage <ol><li> Tenere il cervello in fissativo per 24 ore a 4 ° C, agitando di tanto in tanto. </li><li> Dopo 24 ore, lavare il cervello tampone fosfato scambiando i mezzi 3 volte e agitando ogni volta. </li><li> I cervelli possono essere memorizzati in salina tamponata con fosfato o HBHS con sodio azide e mantenuto a 4 ° C. </li></ol> 8. Risultati rappresentativi Un indicatore iniziale del successo della perfusione è la compensazione delle estremità come il naso, le orecchie e le zampe e gli organi interni come il timo e il fegato (IHC World).Ispezione lordo del cervello rivela il vuoto vaso sanguigno di sangue (bianco a giallo pallido aspetto giallo). Questo sarà anche vero all&#39;interno di sezioni di tessuto destinare per la colorazione ed immunoistochimica. L&#39;indicatore finale del risultato della perfusione è la condizione della ultrastruttura nel tessuto. 1,6,7,8 <table border="1"><tbody><tr><td> Preparare Fissativo: </td></tr><tr><td> Preparare magazzino paraformaldeide all&#39;8% </td></tr><tr><td><ol><li> Aggiungere 40 g di paraformaldeide a 500 ml dH 2 O. Riscaldare la soluzione a 60 - 65 ° C sotto agitazione (non superare i 65 ° C, così facendo può influenzare negativamente il successo della procedura immunoistochimica). </li><li> Per cancellare la soluzione, abbassare la fiamma e aggiungere 2-3 ml di NaOH 1,0 M con un contagocce. </li><li> Filtrare e conservare a 4 ° C per un massimo di 1 mese. </li></ol></td></tr><tr><td> Preparare 0,2 M tampone fosfato di sodio, pH 7,4 </td></tr><tr><td><ol start="4"><li> Per il magazzino sodio fosfato monobasico, aggiungere 27,8 g di NaH 2 PO 4 * H 2 O a 1 L dH 2 O. </li><li> Per lo stock di fosfato di sodio bibasico, aggiungere 28,4 g Na 2 HPO 4 a 1 L dH 2 O. </li><li> Aggiungere 810 ml dello stock monobasico a 190 ml dello stock bibasico. </li></ol></td></tr><tr><td> Preparare Fixative paraformaldeide 4% </td></tr><tr><td><ol start="7"><li> Aggiungi parti uguali magazzino paraformaldeide 8% a 0,2 M tampone fosfato di sodio </li><li> Nota: questa correzione è meglio preparato fresco, non più di 72 ore di anticipo. </li></ol></td></tr><tr><td> Preparare perfusione e buffer di memoria: </td></tr><tr><td> Preparare Soluzione tampone fosfato, pH 7.4 </td></tr><tr><td><ol start="9"><li> 1 L dH 2 O </li><li> 9 g NaCl </li><li> 144 mg KH 2 PO &lt;sub&gt; 4 </li><li> 795 mg Na 2 HPO 4 </li><li> Controllare il pH </li></ol></td></tr><tr><td> HEPES tamponata Hanks Solution (HBHS) con pH 7,4 Sodio Azide </td></tr><tr><td><ol start="14"><li> 990 ml di dH 2 O </li><li> 7,5 g di NaCl, </li><li> 0,3 g di KCl </li><li> 0,06 g di KH 2 PO 4 </li><li> 0,13 g di Na 2 HPO 4 </li><li> 2 g Destrosio / glucosio </li><li> 2.4 g 10 mm Hepes </li><li> 0,1 g MgCl 2 6 parti dH 2 O </li><li> 0,05 g MgSO 4 7 parti dH 2 O </li><li> 0,165 g CaCl 2 2 parti dH 2 O </li><li> 90 mg NaN 3 </li><li> Controllare il pH </li></ol></td></tr></tbody></table> Tabella 1. Preparazione di fissativo e tamponi. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig1.jpg" /> Figura 1. </strong&gt; Apparecchiatura di perfusione con componenti etichettati. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig2.jpg" /> Figura 2. Preparazione della perfusione Apparatus I. Inizia con la linea di fissativo. Lavare il tubo di bolle d&#39;aria e riempire con il tampone, mediante una rapida espulsione e la revoca del buffer nella siringa e attraverso la linea. Chiudere la valvola sulla fine dell&#39;ago off. Posizionare la linea fissativo nella bottiglia fissativo senza introdurre bolle d&#39;aria. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig3.jpg" /> Figura 3. Preparazione della perfusione Apparecchiatura II. 1. Aprire la valvola sul lato dell&#39;ago. 2. Girare la valvola buffer (blu) in posizione per il flusso. 3. Lavare il tubo di bolle d&#39;aria e riempire con il tampone, mediante una rapida espulsione e la revoca del buffer con la siringa. 4. Chiudere la valvola alla fine dell&#39;ago. Posizionare tubo nella bottiglia buffer. Pressione di prova per assicurarsi che il sistema è sigillato correttaly pompando il bulbo manometro e guardare il manometro. L&#39;apparecchio è pronto per la procedura di perfusione. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig4.jpg" /> Figura 4. Apparecchiatura di perfusione in posizione per la consegna del buffer. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig5.jpg" /> Figura 5. Perfusione Chirurgia I. a) Fare una incisione laterale attraverso l&#39;involucro e la parete addominale. b) Praticare un&#39;incisione nel diaframma e tagli attraverso il diaframma esponendo il cuore. Effettuare tagli paralleli ai lati delle nervature fino alla clavicola. c) bloccare la punta dello sterno con all&#39;emostato e posizionare il emostato sopra la testa. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig6.jpg" /> Figura 6. Perfusione Chirurgia II. a) passare l&#39;ago perfusione attraverso il ventricolo taglio in aorta ascendente. b) Fissare ilperfusione ago uso una serie di hemostats per reprimere il cuore. Una seconda serie di una pinza emostatica modificato può anche essere utilizzato per bloccare l&#39;aorta intorno alla punta dell&#39;ago impedisce la fuoriuscita. Utilizzando forbici iride fare una piccola incisione a estremità posteriore del ventricolo sinistro. <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig7.jpg" /> Figura 7. Perfusione con la pompa del tampone lampadina manometro per creare pressione nella linea. Aprire la valvola (1) e allegare al mozzo dell&#39;ago. E &#39;fondamentale per assicurarsi che non bolle d&#39;aria vengono introdotti. Gonfiare il bulbo manometro ad una pressione di 80 mm Hg e mantenere questa pressione durante il periodo di infusione di buffer. <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig8.jpg" /> Figura 8. Perfusione con fissante volta tampone è quasi finito (200 ml) commutare la valvola tampone (1) per consentire il fissativo di flusso. La pressione può essere aumentata gradualmente fino ad unmassimo di 130 mm Hg. <img alt="Figura 9" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig9.jpg" /> Dissection Figura 9. I. a) rimuovere la testa con un paio di forbici. b) fare un&#39;incisione nella pelle lungo la linea mediana dal collo al naso ed esporre il cranio. c) tagliare il muscolo restante collo in modo che la base del cranio è esposto. Tenere la testa in modo che la grande apertura nella superficie cranio (forame magno) è accessibile. Inserire con cautela la punta di un paio di forbici iris nel forame magno e fare un taglio. Ripetere la stessa manovra per il lato controlaterale. Utilizzare i Rongeurs di sgombrare il cranio intorno al cervelletto. <img alt="Figura 10" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig10.jpg" /> Figura 10. Dissection II. a) far scorrere le forbici lungo la superficie interna del cranio. Sollevare la punta come si sta tagliando per evitare danni al cervello. Ripetere la stessalato opposto. Utilizzare Rongeurs buccia del cranio fuori dal cervello. b) illustrazione con il cranio rimosso e il cervello esposto. c) utilizzare una spatola di spezzare i bulbi olfattivi e le connessioni nervose nella posizione più anteriore del cervello. Con attenzione guidare la punta di spatola lungo la parte inferiore del cervello di recidere le connessioni per la facilità di rimozione. Togliere il cervello e metterlo in un flaconcino di fissativo.

<ol><li>Cinar, O., Semiz, O., Can, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microscopic+survey+on+the+efficiency+of+well-known+routine+chemical+fixatives+on+cryosections%5BTitle%5D)+AND+%22Acta.+Histochem%22%5BJournal%5D)">A microscopic survey on the efficiency of well-known routine chemical fixatives on cryosections.</a> Acta. Histochem. 108, 487-496 (2006).</li>
<li>Fritz, M., Rinaldi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+pressure+measurement+with+the+tail-cuff+method+in+Wistar+and+spontaneously+hypertensive+rats%3A+Influence+of+adrenergic-+and+nitric+oxide-mediated+vasomotion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Toxicol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Blood pressure measurement with the tail-cuff method in Wistar and spontaneously hypertensive rats: Influence of adrenergic- and nitric oxide-mediated vasomotion.</a> J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 58, 215-221 (2008).</li>
<li>Ikeda, K., Nara, Y., Yamorii, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Indirect+systolic+and+mean+blood+pressure+determination+by+anew+tail+cuff+method+in+spontaneously+hypertensive+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Animals%22%5BJournal%5D)">Indirect systolic and mean blood pressure determination by anew tail cuff method in spontaneously hypertensive rats.</a> Laboratory Animals. 25, 26-29 (1991).</li>
<li>Jacobowitz, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removal+of+discrete+fresh+regions+of+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Removal of discrete fresh regions of rat brain.</a> Brain Res. 80, 111-115 (1974).</li>
<li>Jonkers, B. W., Sterk, J. C., Wouterlood, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcardial+perfusion+fixation+of+the+CNS+by+means+of+a+compressed-air-driven+device%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurosci.+Meth%22%5BJournal%5D)">Transcardial perfusion fixation of the CNS by means of a compressed-air-driven device.</a> Journal of Neurosci. Meth. 12, 141-149 (1984).</li>
<li>Jung-Hwa, T. ao-C. heng, Gallant, J., Brightman, P. E., Dosemeci, M. W., A,, Reese, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+changes+at+the+synapse+after+delayed+perfusion+fixation+in+different+regions+of+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Structural changes at the synapse after delayed perfusion fixation in different regions of the mouse brain.</a> J. Comp. Neurol. 501, 731-740 (2007).</li>
<li>Kasukurthi, R., Brenner, M. J., Morre, A. M., Moradzadeh, A., Wilson, Z. R., Santosa, K. B., Mackinnon, S. E., Hunter, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcardial+perfusion+versus+immersion+fixation+for+assessment+of+peripheral+nerve+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Meth%22%5BJournal%5D)">Transcardial perfusion versus immersion fixation for assessment of peripheral nerve regeneration.</a> J. Neurosci. Meth. 184, 303-309 (2009).</li>
<li>Lamberts, R., Goldsmith, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fixation%2C+fine+structure%2C+and+immunostaining+for+neuropeptides%3A+perfusion+versus+immersion+of+the+neuroendocrine+hypothalamus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Fixation, fine structure, and immunostaining for neuropeptides: perfusion versus immersion of the neuroendocrine hypothalamus.</a> J. Histochem. Cytochem. 34, 389-398 (1986).</li>
<li>Ramos-Vara, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technical+Aspects+of+Immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Vet.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Technical Aspects of Immunohistochemistry.</a> Vet. Pathol. 42, 405-426 (2005).</li>
<li>Shi, Z. R., Itzkowitz, S. H., Kim, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+three+immunoperoxidase+techniques+for+antigen+detection+in+colorectal+carcinoma+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">A comparison of three immunoperoxidase techniques for antigen detection in colorectal carcinoma tissues.</a> J. Histochem. Cytochem. 36, 317-322 (1988).</li>
<li>Walker, W. F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWalker%2C+WF+%22Vertebrate+dissection%22">Vertebrate dissection</a>. , Sixth Ed, W.B. Saunders Comp. Philadelphia. (1980).</li>
<li>Zwienenberg, M., Gong, Q., Lee, L. L., Berman, R. F., Lyeth, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((J.+Neurotrauma%5BTitle%5D)+AND+%22Monitoring+in+the+Rat%3A+Comparison+of+Monitoring+in+the+Ventricle%2C+Brain+Parenchyma%2C+and+Cisterna+Magna%22%5BJournal%5D)">J. Neurotrauma.</a> Monitoring in the Rat: Comparison of Monitoring in the Ventricle, Brain Parenchyma, and Cisterna Magna. 16, 1095-1102 (1999).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Note aggiuntive per un intervento chirurgico di successo: <ol><li> Una volta che il diaframma è violato, precedere rapidamente ipossia e ipercapnia avvierà irreversibili cambiamenti fisiologici che possono confondere la successiva analisi. </li><li> Quando l&#39;ago viene inserito e bloccato in posizione, la pressione residua spingerà sangue alla base dell&#39;ago (flashback). In realtà, gli animali più grandi possono vigorosamente espellere il sangue. È fondamentale che il sangue almeno raggiungere la base dell&#39;ago per evitare l&#39;introduzione di bolle d&#39;aria che presenterà un ostacolo per completare perfusione. Se il sangue non si osserva alla base dell&#39;ago, estrarre l&#39;ago e riempire con il tampone collegandolo alla porta di uscita della piattaforma perfusione. Una volta buffer è stato eseguito attraverso la punta, l&#39;ago può essere reinserito nel cuore. </li><li> Corretto posizionamento dell&#39;ago all&#39;interno della aorta è critica, non deve arrivare fino aortico. </li><li> Se perfusioni più avvengono non è necessario tinstallazione o dall&#39;inizio ogni volta. L&#39;utente deve avere il volume corretto sia per il buffer e fissativo in ogni bottiglia (200mls animali / soluzione). Le bottiglie possono essere ricaricate, se necessario. L&#39;aspetto più importante da considerare è stanare la linea di perfusione che va dal programma di installazione per l&#39;animale (valvola di uscita). Dopo il completamento di una perfusione, questa linea avrà 4% paraformaldeide in esso. Togliere il tubo dal flacone di soluzione tampone e utilizzare una siringa da 50 ml riempita con acqua per irrigare il fissativo. Assicurarsi che la valvola di scarico viene posto in un beaker di raccolta dei rifiuti per lo smaltimento della paraformaldeide. Ripetere questa operazione tre volte. Riempire con buffer utilizzando lo stesso metodo indicato in 2.3. </li><li> Questo metodo di fissaggio è altamente adattabile con la possibilità di modificare sia tampone e fissativo altri fissativi, ad esempio quelli utilizzati per EM) secondo le esigenze dell&#39;esperimento. </li><li> Il sistema viene spesso utilizzato anche per l&#39;estrazione di tessuto vivo. Per questoun processo utilizza semplicemente la consegna di solo tampone (buffer mentre il flacone ancora collegato al sistema viene posto in un contenitore e il flacone fissativo è impostato come vuoto ma sigillato). Ciò assicura una perfusione tampone freddo alla pressione ottimale. Da qui il sistema può essere adattato per l&#39;infusione di coloranti fissabili aggiungendo il colorante direttamente al buffer (se la quantità non è un problema) o utilizzare una siringa con una quantità minima di tampone / soluzione di colorante tra il tampone - passo fissativo. </li><li> Nel caso di colata vascolare, la fase di monitoraggio della pressione tampone è fondamentale tuttavia a causa della viscosità e solidificazione natura della soluzione di colata o una siringa da 50 ml deve essere utilizzato per la somministrazione diretta o un allegato monouso secondario all&#39;apparato (tubi, valvole e tenendo Contenitore) realizzato per interfacciarsi con il sistema essere utilizzato. Fusione vascolare I nostri laboratori »seguita la progettazione e la fabbricazione del dispositivo di perfusione. Pertanto non possiamo STmangiato che le misurazioni di pressione sarà una misurazione precisa al sito di consegna. I numeri possono essere regolata per ottenere la consegna di successo di fluidi viscosi. </li></ol>

<table border="1"><tbody><tr><td> Attrezzatura </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Comments </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Anestetici: </td></tr><tr><td> La ketamina / xilazina miscela (anestetici può variare in base alla laboratorio / istituzione) </td><td> Ketaset </td><td> NDC 0856-2013-01 </td><td> Flaconcino da 10 ml </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Chirurgia: </td></tr><tr><td> Punta dell&#39;ago, 27 x 1,25 GA &quot; </td><td> Materiale Servizi </td><td> 25251 </td><td></td></tr><tr><td> Grandi forbici curve smussate / blunt (circa 14,5 cm) </td><td> Strumenti di Scienze Belle </td><td> 14519-14 </td><td></td></tr><tr><td> Etero iris forbici </td><td> Strumenti di Scienze Belle </td><td> 14058-11 </td><td></td></tr><tr><td&gt; Standard pinzette </td><td> Strumenti di Scienze Belle </td><td> 11027-12 </td><td></td></tr><tr><td> Coppia di fine (Graefe) pinzette </td><td> Strumenti di Scienze Belle </td><td> 11050-10 </td><td></td></tr><tr><td> 1 Pinza grandi hemostat - curvi o rettilinei (circa 19 cm) </td><td> surgicaltools.com </td><td> 17.21.51 </td><td></td></tr><tr><td> 2 pinze standard di hemostat - diritto seghettati (14 cm) </td><td> Strumenti di Scienze Belle </td><td> 13013-14 </td><td></td></tr><tr><td> 1 pinza emostatica modificato (con 15-gauge foro presentata tramite la punta) </td><td> Strumenti di Scienze Belle </td><td> 13013-14 </td><td></td></tr><tr><td> 15-gauge smussata o di olio di punta (ago perfusione) </td><td> Fisnar </td><td> 5601137 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Perfusione: </td></tr><tr><td> HyPerfusion o sistema equivalente &lt;/ Td&gt; <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tampone fosfato salino, pH 7.4 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldeide al 4% in tampone fosfato 0,1 M, pH 7,4 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Shallow vetro o il vassoio di plastica, circa 10 &quot;x 10&quot; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Ghiaccio tritato </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Bagnomaria (37 ° C) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Timer </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 50 ml siringa </td><td> Medline Industries </td><td> NPMJD50LZ </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Dissection: </td></tr><tr><td> Pair di standard di forbici affilate / blunt rette (~ 12 cm) </td><td> Strumenti di Scienze Belle </td><td> 14054-13 </td><td></td></tr><tr><td> Medio Rongeurs curvi o rettilinei (14-16 cm) o di rimozione delle ossa del cranio pinze </td><td> Strumenti di Scienze Belle </td><td> 16020-14 </td><td></td></tr><tr><td> Diritto forbici iris (circa 9 cm) </td><td> Strumenti di Scienze Belle </td><td> 14058-11 </td><td></td></tr><tr><td> Micro-spatola (2 doppi &quot;estremità piatte, uno arrotondato, uno conico a 1/8&quot;) </td><td> Strumenti di Scienze Belle </td><td> 10091-12 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Post-fissazione e conservazione: </td></tr><tr><td> 50 ml fiala di vetro </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 40 ml HEPES-Buffered Hanks Solution (HBHS) con azide di sodio (90 mg / l) </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody&gt; </table>

tutta la perfusione di fissaggio degli animali per i roditori

Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents

L&#39;obiettivo di fissaggio è di preservare rapidamente ed uniformemente tessuto in uno stato simile vita. Durante il posizionamento dei tessuti direttamente nelle opere di fissativo bene per piccoli pezzi di tessuto, grandi campioni come il cervello intatto pongono un problema per il fissaggio a immersione, perché il fissativo non raggiunge tutte le regioni del tessuto alla stessa velocità 5,7. Spesso, cambiamenti nella risposta all&#39;ipossia iniziare prima che il tessuto può essere conservato 12. Il vantaggio di perfusione fissativo direttamente attraverso il sistema circolatorio è che la sostanza chimica in grado di raggiungere rapidamente ogni angolo dell&#39;organismo naturale, utilizzando la rete vascolare. Al fine di utilizzare il sistema circolatorio più efficace, occorre prestare attenzione a corrispondere pressioni fisiologiche 3. È importante notare che pressioni fisiologiche dipendono dalle specie utilizzate. Tecniche per il fissaggio perfusione variano a seconda del tessuto da fissare e come il tessuto saranno elaborati fissazione seguente. In questo video, Noi descriviamo un basso costo, rapido, procedura di sintesi uniforme e controllata impiegando 4% paraformaldeide perfusi attraverso il sistema vascolare: attraverso il cuore di ratto per ottenere la migliore conservazione del cervello per immunoistochimica. Il vantaggio principale di questa tecnica (vs alimentata per gravità sistemi) è che il sistema circolatorio viene utilizzato più efficacemente.

Qui noi descriviamo un basso costo, rapido, procedura di sintesi uniforme e controllata impiegando 4% paraformaldeide perfusi attraverso il sistema vascolare: attraverso il cuore di ratto per ottenere la migliore conservazione del cervello.

Tutta la perfusione di fissaggio degli animali per i roditori

L'obiettivo della fissazione è quello di preservare il tessuto in modo rapido e uniforme, mantenendolo in uno stato simile a quello vitale. Sebbene l'immersione diretta del tessuto nel fissativo funzioni bene per piccoli...

L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare la nostra tecnica di fissazione mediante perfusione, che sottolinea l'uso di pressioni fisiologiche per preservare adeguatamente il tessuto cerebrale di ratto per procedure di immunohistochimica. Innanzitutto, viene illustrato l'uso e il montaggio dell'apparato di perfusione. Successivamente, vengono assemblati gli strumenti necessari per eseguire sia l'intervento chirurgico di perfusione sia l'asportazione del cervello, e l'animale profondamente anestetizzato viene posizionato su un vassoio poco profondo riempito di ghiaccio tritato.Viene praticata un'incisione laterale di cinque-sei centimetri attraverso l'integumento e la parete addominale appena al di sotto della gabbia toracica. Si espone il cuore e si effettua la perfusione dell'animale. L'ultimo passaggio consiste nel rimuovere il cervello e collocarlo in una provetta contenente un liquido fissativo con un volume pari ad almeno dieci volte quello del cervello stesso.L'obiettivo generale di questa procedura è illustrare la nostra tecnica di fissazione mediante perfusione, che sottolinea l'uso di pressioni fisiologiche per preservare correttamente il tessuto cerebrale di ratto ai fini dell'immunohistochimica. Inizieremo preparando l'apparato di perfusione, operazione che richiederà circa 10 minuti. Utilizzando una siringa da 50 millilitri, ripetutamente sciacquare e svuotare la linea del fissativo con tampone fino a quando tutte le bolle d'aria saranno rimosse.È fondamentale per il successo di una perfusione non avere bolle d'aria in nessuno dei tubi. Questo si ottiene posizionando la valvola di uscita in un becher riempito con tampone. Ora, chiudere la valvola di uscita.Quindi rimuovere il tubo dalla siringa comprimendolo in modo che una goccia di tampone penda dall'estremit&agrave;. Posizionare il tubo riempito, con l'ingresso del fissativo, in una bottiglia contenente 200 millilitri di fissativo a base di paraldeide per animale, avendo cura di non introdurre bolle d'aria.Serrare il tappo, assicurandosi che la guarnizione sia correttamente alloggiata. Se non è posizionata correttamente, la pressione all'interno del sistema chiuso non si manterrà. Posizionare la bottiglia nell'apparato di perfusione.Impostare il flusso solo dalla linea del tampone chiudendo il porto di uscita e ruotando la valvola del tampone nella stessa posizione della valvola del fissativo. Aprire il porto di uscita e svuotare la linea del tampone come fatto in precedenza per la linea del fissativo. Una volta svuotata la linea, posizionare il tubo nella bottiglia del tampone.Successivamente, verificare la capacità del sistema di mantenere la pressione. Pompano la bolla di gomma del manometro, si incontrerà una resistenza. Come ultima preparazione.Riempire l'ago di perfusione con tampone per evitare l'introduzione di aria. Il sistema è ora pronto per la perfusione. Dopo aver somministrato una miscela di chetamina e xilazina, non verificata per determinare il livello chirurgico di anestesia mediante il metodo della pressione sul dito del piede, posizionare il ratto completamente anestetizzato su un vassoio poco profondo riempito di ghiaccio tritato.Non procedere a meno che l'animale non sia completamente anestetizzato. Iniziare l'intervento chirurgico con un'incisione laterale di cinque-sei centimetri attraverso l'integumento e la parete addominale appena al di sotto della gabbia toracica. Separare con cura il fegato dal diaframma.Eseguire una piccola incisione nel diaframma utilizzando forbici curve e smussate. La posizione e la pressione del dito possono facilitare il taglio del diaframma. Continuare l'incisione lungo tutta la lunghezza della gabbia toracica per esporre la cavità pleurica.Posizionare le forbici curve e smussate lungo un lato delle costole, spostando con attenzione i polmoni, e praticare un taglio attraverso la gabbia toracica fino alla clavicola. Successivamente, eseguire un taglio simile sul lato controlaterale. Ora sollevare lo sterno e rimuovere con cura qualsiasi tessuto che lo connetta al cuore.Stringere con una pinza emostatica la punta dello sterno e posizionare la pinza sopra la testa. Il torace dovrebbe sollevarsi, offrendo una visione chiara dei vasi principali. Utilizzando forbici a iris, praticare una piccola incisione all'estremit&agrave; posteriore del ventricolo sinistro.Fare passare un ago da perfusione ottuso o con punta oliva del calibro di 15 attraverso il ventricolo tagliato fino all'aorta ascendente. La punta deve essere visibile attraverso la parete dell'aorta e non deve raggiungere l'arco aortico, dove si diramano le arterie brachiali e carotidee. Per fissare l'ago ed evitare perdite, clampare il cuore con una pinza emostatica.Infine, utilizzare le forbici a iris per creare un'ampia apertura nell'atrio destro. Prestare attenzione a non danneggiare l'aorta discendente. A questo punto, l'animale è pronto per essere perfuso.Collegare l'ago di perfusione all'atrio destro al porto di uscita senza introdurre bolle d'aria e aprire il porto di uscita. Quindi pompare rapidamente e uniformemente la bolla del manometro fino a una pressione di 80 millimetri di mercurio. Mantenere questa pressione per tutta la durata dell'infusione del tampone.Ora avviare un cronometro. Regolare l'angolo dell'ago in modo da ottenere il flusso più intenso e, quando il tampone è quasi terminato, commutare la valvola del tampone. Il liquido inizierà a scorrere limpido quando il fegato sarà perfuso.Questo è un indicatore di una buona perfusione e il momento in cui il fegato si schiarisce deve essere annotato molto rapidamente. Dopo questo evento, si osserveranno tremori di fissazione. Indicare questo come il momento della fissazione vera e propria. Per mantenere una portata costante, la pressione può essere aumentata gradualmente fino a un massimo di 130 millimetri di mercurio.Una volta quasi terminato il fissativo, chiudere la valvola di uscita e prendere nota dell'ora. Il ratto ora dovrebbe essere rigido. Gli organi del ratto possono ora essere prelevati. Per rimuovere il cervello, iniziare la dissezione del ratto fissato rimuovendo la testa mediante una ghigliottina.Successivamente, effettuare un'incisione mediana lungo l'integumento dal collo al naso ed esporre il cranio con forbici, orals. Rimuovere i muscoli residui del collo in modo da esporre la base del cranio. Inserire l'estremità affilata di un paio di forbici ad iris nel foro e nel magnum su un lato, facendo scivolare con attenzione le forbici lungo la superficie interna del cranio.Successivamente, effettuare un taglio che si estenda fino al margine distale della superficie posteriore del cranio. Eseguire un taglio identico sul lato controlaterale. Quindi utilizzare il theros per rimuovere le ossa craniche intorno al cervelletto.Fare scivolare con attenzione la punta delle forbici lungo la superficie interna del cranio, dall'angolo dorsale distale posteriore al margine frontale distale. Evitare di danneggiare il cervello sollevando la punta della lama. Durante questa operazione, ripetere il taglio sul lato opposto.Quindi, utilizzando le pinzette, staccare la superficie dorsale del cranio dal cervello. Rimuovere anche i lati del cranio sempre con le pinzette. Ora, usando una spatola, recidere i bulbi olfattivi e le connessioni nervose lungo la superficie ventrale del cervello e staccare delicatamente il cervello dalla testa.Utilizzando forbici per iridectomia, recidere qualsiasi dura madre che connette il cervello al cranio. Una volta rimosso il cervello, collocarlo in una provetta contenente un fissativo almeno 10 volte il volume del cervello stesso. Conservare la provetta a quattro gradi Celsius per 24 ore.Dopo 24 ore, lavare il cervello con PBS 3 volte con movimenti delicati a vortice. Il cervello può quindi essere conservato in PBS o in Hanks. Con azide di sodio a quattro gradi Celsius, i cervelli possono essere conservati per tre mesi.Un sezionato. Una volta padroneggiato, l'intera perfusione può essere completata tra cinque e otto minuti.

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