Tutta la perfusione di fissaggio degli animali per i roditori

L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare la nostra tecnica di fissazione mediante perfusione, che sottolinea l'uso di pressioni fisiologiche per preservare adeguatamente il tessuto cerebrale di ratto per procedure di immunohistochimica. Innanzitutto, viene illustrato l'uso e il montaggio dell'apparato di perfusione. Successivamente, vengono assemblati gli strumenti necessari per eseguire sia l'intervento chirurgico di perfusione sia l'asportazione del cervello, e l'animale profondamente anestetizzato viene posizionato su un vassoio poco profondo riempito di ghiaccio tritato.

Viene praticata un'incisione laterale di cinque-sei centimetri attraverso l'integumento e la parete addominale appena al di sotto della gabbia toracica. Si espone il cuore e si effettua la perfusione dell'animale. L'ultimo passaggio consiste nel rimuovere il cervello e collocarlo in una provetta contenente un liquido fissativo con un volume pari ad almeno dieci volte quello del cervello stesso.

L'obiettivo generale di questa procedura è illustrare la nostra tecnica di fissazione mediante perfusione, che sottolinea l'uso di pressioni fisiologiche per preservare correttamente il tessuto cerebrale di ratto ai fini dell'immunohistochimica. Inizieremo preparando l'apparato di perfusione, operazione che richiederà circa 10 minuti. Utilizzando una siringa da 50 millilitri, ripetutamente sciacquare e svuotare la linea del fissativo con tampone fino a quando tutte le bolle d'aria saranno rimosse.

È fondamentale per il successo di una perfusione non avere bolle d'aria in nessuno dei tubi. Questo si ottiene posizionando la valvola di uscita in un becher riempito con tampone. Ora, chiudere la valvola di uscita.

Quindi rimuovere il tubo dalla siringa comprimendolo in modo che una goccia di tampone penda dall'estremità. Posizionare il tubo riempito, con l'ingresso del fissativo, in una bottiglia contenente 200 millilitri di fissativo a base di paraldeide per animale, avendo cura di non introdurre bolle d'aria.

Serrare il tappo, assicurandosi che la guarnizione sia correttamente alloggiata. Se non è posizionata correttamente, la pressione all'interno del sistema chiuso non si manterrà. Posizionare la bottiglia nell'apparato di perfusione.

Impostare il flusso solo dalla linea del tampone chiudendo il porto di uscita e ruotando la valvola del tampone nella stessa posizione della valvola del fissativo. Aprire il porto di uscita e svuotare la linea del tampone come fatto in precedenza per la linea del fissativo. Una volta svuotata la linea, posizionare il tubo nella bottiglia del tampone.

Successivamente, verificare la capacità del sistema di mantenere la pressione. Pompano la bolla di gomma del manometro, si incontrerà una resistenza. Come ultima preparazione.

Riempire l'ago di perfusione con tampone per evitare l'introduzione di aria. Il sistema è ora pronto per la perfusione. Dopo aver somministrato una miscela di chetamina e xilazina, non verificata per determinare il livello chirurgico di anestesia mediante il metodo della pressione sul dito del piede, posizionare il ratto completamente anestetizzato su un vassoio poco profondo riempito di ghiaccio tritato.

Non procedere a meno che l'animale non sia completamente anestetizzato. Iniziare l'intervento chirurgico con un'incisione laterale di cinque-sei centimetri attraverso l'integumento e la parete addominale appena al di sotto della gabbia toracica. Separare con cura il fegato dal diaframma.

Eseguire una piccola incisione nel diaframma utilizzando forbici curve e smussate. La posizione e la pressione del dito possono facilitare il taglio del diaframma. Continuare l'incisione lungo tutta la lunghezza della gabbia toracica per esporre la cavità pleurica.

Posizionare le forbici curve e smussate lungo un lato delle costole, spostando con attenzione i polmoni, e praticare un taglio attraverso la gabbia toracica fino alla clavicola. Successivamente, eseguire un taglio simile sul lato controlaterale. Ora sollevare lo sterno e rimuovere con cura qualsiasi tessuto che lo connetta al cuore.

Stringere con una pinza emostatica la punta dello sterno e posizionare la pinza sopra la testa. Il torace dovrebbe sollevarsi, offrendo una visione chiara dei vasi principali. Utilizzando forbici a iris, praticare una piccola incisione all'estremità posteriore del ventricolo sinistro.

Fare passare un ago da perfusione ottuso o con punta oliva del calibro di 15 attraverso il ventricolo tagliato fino all'aorta ascendente. La punta deve essere visibile attraverso la parete dell'aorta e non deve raggiungere l'arco aortico, dove si diramano le arterie brachiali e carotidee. Per fissare l'ago ed evitare perdite, clampare il cuore con una pinza emostatica.

Infine, utilizzare le forbici a iris per creare un'ampia apertura nell'atrio destro. Prestare attenzione a non danneggiare l'aorta discendente. A questo punto, l'animale è pronto per essere perfuso.

Collegare l'ago di perfusione all'atrio destro al porto di uscita senza introdurre bolle d'aria e aprire il porto di uscita. Quindi pompare rapidamente e uniformemente la bolla del manometro fino a una pressione di 80 millimetri di mercurio. Mantenere questa pressione per tutta la durata dell'infusione del tampone.

Ora avviare un cronometro. Regolare l'angolo dell'ago in modo da ottenere il flusso più intenso e, quando il tampone è quasi terminato, commutare la valvola del tampone. Il liquido inizierà a scorrere limpido quando il fegato sarà perfuso.

Questo è un indicatore di una buona perfusione e il momento in cui il fegato si schiarisce deve essere annotato molto rapidamente. Dopo questo evento, si osserveranno tremori di fissazione. Indicare questo come il momento della fissazione vera e propria. Per mantenere una portata costante, la pressione può essere aumentata gradualmente fino a un massimo di 130 millimetri di mercurio.

Una volta quasi terminato il fissativo, chiudere la valvola di uscita e prendere nota dell'ora. Il ratto ora dovrebbe essere rigido. Gli organi del ratto possono ora essere prelevati. Per rimuovere il cervello, iniziare la dissezione del ratto fissato rimuovendo la testa mediante una ghigliottina.

Successivamente, effettuare un'incisione mediana lungo l'integumento dal collo al naso ed esporre il cranio con forbici, orals. Rimuovere i muscoli residui del collo in modo da esporre la base del cranio. Inserire l'estremità affilata di un paio di forbici ad iris nel foro e nel magnum su un lato, facendo scivolare con attenzione le forbici lungo la superficie interna del cranio.

Successivamente, effettuare un taglio che si estenda fino al margine distale della superficie posteriore del cranio. Eseguire un taglio identico sul lato controlaterale. Quindi utilizzare il theros per rimuovere le ossa craniche intorno al cervelletto.

Fare scivolare con attenzione la punta delle forbici lungo la superficie interna del cranio, dall'angolo dorsale distale posteriore al margine frontale distale. Evitare di danneggiare il cervello sollevando la punta della lama. Durante questa operazione, ripetere il taglio sul lato opposto.

Quindi, utilizzando le pinzette, staccare la superficie dorsale del cranio dal cervello. Rimuovere anche i lati del cranio sempre con le pinzette. Ora, usando una spatola, recidere i bulbi olfattivi e le connessioni nervose lungo la superficie ventrale del cervello e staccare delicatamente il cervello dalla testa.

Utilizzando forbici per iridectomia, recidere qualsiasi dura madre che connette il cervello al cranio. Una volta rimosso il cervello, collocarlo in una provetta contenente un fissativo almeno 10 volte il volume del cervello stesso. Conservare la provetta a quattro gradi Celsius per 24 ore.

Dopo 24 ore, lavare il cervello con PBS 3 volte con movimenti delicati a vortice. Il cervello può quindi essere conservato in PBS o in Hanks. Con azide di sodio a quattro gradi Celsius, i cervelli possono essere conservati per tre mesi.

Un sezionato. Una volta padroneggiato, l'intera perfusione può essere completata tra cinque e otto minuti.