Name: Trapianto di cellule staminali in un In vitro Simulato ischemia / riperfusione Modello (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: Impara a valutare gli effetti della terapia con cellule staminali su cellule cardiache postischemiche utilizzando un modello in vitro di ischemia/riperfusione. Questo metodo permette di analizzare le interazioni cellulari e i meccanismi di recupero.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Questo lavoro è stato sostenuto da OTKA (Fondo di ricerca scientifica ungherese) D45933, T049621, TET (ungherese Fondazione Scienza e Tecnica) A4/04, Arg-17/2006 e SIN, Bolyai, borse di studio e Öveges TÁMOP 4.2.2-08 / 1 / KMR-2008-0004 e 4.2.1 / B 09/1/KMR-2010-0001. OTKA 83803. Vorremmo ringraziare Gesztes William per la fornitura del voice-over.

1. Preparazione H9c2 cellule cardiomyoblast H9c2 cardiomyoblasts ratto sono stati ottenuti da ATCC (Wesel, Germania) e ampliato nel glucosio (4,5 g / L) DMEM contenente 10% di siero fetale bovino, 4 mM L-glutammina, 100 U / ml di penicillina e 100 mg / ml di streptomicina. La linea cellulare H9c2 mioblasti è derivato da cuore di ratto embrionale, è usato come un modello in vitro sia per muscolo scheletrico e cardiaco 8,9. Preparare 12 pozzetti di H9c2 celle: <ol><li> Togliere terreno di coltura da piastra di Petri di H9c2 cellule. </li><li> Lavare le cellule due volte con 5 ml di PBS e digerire con 2-3 ml 0,05% tripsina / EDTA. </li><li> Mettere le capsule di Petri per 5 minuti nel 37 ° C incubatore. </li><li> Inibire la tripsina con 10 ml di mezzo di coltura DMEM. </li><li> Spin down delle celle a 1200 rpm per 8 minuti. </li><li> Dopo aver rimosso il surnatante, risospendere le cellule in 1 ml di mezzo di coltura DMEM e contare le cellule con emocitometro utilizzando tripan colorazione blu.</li><li> Semi di 30.000 H9c2 cellule in 2 ml di DMEM per bene in un piatto ben 12. </li><li> Collocare la piastra nel 37 ° C CO 2 incubatore per 24 ore. </li></ol> 2. Ischemia simulata / riperfusione Ischemia / riperfusione è stato simulato in vitro effettuando glucosio privazione di ossigeno (OGD) H9c2 su colture cellulari. Questa procedura è stata eseguita sul palco del microscopio confocale Zeiss con il sistema di incubazione delle cellule Pecon (Erbach, Germania) che consente l&#39;osservazione delle cellule durante OGD. <ol><li> Rimuovere medio di aspirazione da 12 pozzetti di H9c2 cellule. </li><li> Lavare le cellule due volte con PBS. </li><li> Aggiungi 3 medio glucosio libero ml per pozzetto. </li><li> Posizionare la piastra nel sistema di incubazione delle cellule. </li><li> Avvio di gas azoto per eliminare l&#39;ossigeno dal sistema di incubazione. </li><li> Attendere che il livello di ossigeno raggiunge il 0,5% poi avviare il timer. 0,5% di ossigeno significa circa 3 mmHg tensione parziale. Cellule soggette a 150 minuti di ischemia simulata. </li><li> Alla fine di ischemia simulata, rimuovere il supporto di glucosio libero dalle cellule. </li><li> Pipettare 2 ml di terreno di coltura normale ai pozzetti. </li><li> Posizionare i 12 pozzetti per 30 minuti nel 37 ° C CO 2 incubatore, questo è il &quot;periodo di riperfusione&quot;. </li></ol> 3. Preparazione salvataggio cellule staminali mesenchimali Midollo osseo di origine umana è stata presa in T75 palloni e diluito con Media Dulbecco Modified Eagle (DMEM) terreno di coltura contenente il 10% di siero fetale bovino (FCS), 100 U / ml di penicillina e 100 mg / ml di streptomicina, 4 mM L-glutamina e 1 g / l di glucosio. I palloni sono state incubate a 37 ° C in un ambiente completamente umidificata al 5% di CO 2 per 3 giorni. Dopo il periodo di incubazione della BMSCs aderito alla superficie dei palloni e gli altri componenti del midollo osseo sono stati eliminati mediante lavaggio con PBS. Il BMSCs utilizzati sono stati tra 1 e 5 passaggi negli esperimenti. Identitità di cellule è stata confermata dalla presenza di marcatori cellulari lineage-specifica superficie con citometria a flusso. Ematopoietiche linage specifici marcatori di superficie (CD34, CD45) e marcatori di superficie mesenchimali (CD73, CD90, CD105 e CD166) sono stati studiati. Durante l&#39;ischemia simulata, preparare salvataggio cellule staminali mesenchimali per il trapianto. <ol><li> Diluire il colorante fluorescente Vybrant DiD in rapporto 1:200 nel terreno di coltura DMEM. </li><li> Aspirare il terreno dalle cellule di soccorso e aggiungere 300 ml con DMEM Vybrant DiD. </li><li> Mettere le capsule di Petri per 30 minuti nel 37 ° C CO 2 incubatore. </li><li> Togliere terreno di coltura da piastra di Petri di cellule staminali mesenchimali. </li><li> Lavare le cellule due volte con 5 ml di PBS e digerire con 2-3 ml 0,05% tripsina / EDTA. </li><li> Mettere le capsule di Petri per 5 minuti nel 37 ° C incubatore. </li><li> Inibire la tripsina con 10 ml di mezzo di coltura DMEM. </li><li> Spin down delle celle a 1200 rpm per 8 minuti. </li><li> Dopo aver rimosso il Supernatant, risospendere le cellule in 1 ml di mezzo di coltura DMEM e contare le cellule con emocitometro utilizzando tripan colorazione blu. </li><li> Dopo 30 minuti alla fine della riperfusione aggiungere 20.000 cellule staminali mesenchimali per bene al postischemica H9c2 mioblasti cardiaci. </li><li> Luogo di co-coltura di cellule in 37 ° C CO 2 incubatore per 24 ore. </li></ol> 4. Analisi con microscopia confocale Dopo la simulazione di ischemia / riperfusione, le cellule vengono incubate in terreno di coltura normale per 24 ore. <ol><li> Dopo 24 ore lavare le cellule due volte con PBS. </li><li> Macchiare le cellule in 500 microlitri dal vivo / morto soluzione colorante per 30 minuti (5 calceina nM e 400 nM di etidio-omodimero-2 in PBS) (5x10 4 cellule / ml). </li></ol> La valutazione delle immagini confocale per le cellule vive e morte selezionati dalla morfologia e dalla fluorescenza può essere effettuata con il software ImageJ (National Institutes of Health, USA). In caso di co-culture, MSC può essere distinto dal H9c2 cellule a causa della loro etichettatura delle cellule Vybrant DiD. Il rapporto tra le cellule morte possono essere valutati in 4 campi indipendenti di vista (obiettivo 10x) per ogni cultura in maniera cieca 10. H9c2 cardiomyoblasts coltivati ​​su coprioggetto mm 42 di vetro possono anche essere studiate con microscopia video di lasso di tempo durante e dopo ischemia / riperfusione mediante il sistema di incubazione delle cellule del microscopio confocale. Cellula-cellula interazioni, come la fusione cellulare e la formazione di nanotubi intercellulare possono essere studiati nel corso del tempo. 5. Analisi con citometria a flusso Dopo la simulazione di ischemia / riperfusione, le cellule vengono incubate in terreno di coltura normale per 24 ore. <ol><li> Dopo 24 ore, raccogliere i terreni di coltura. E &#39;molto importante raccogliere il terreno di coltura anche perché alcune cellule morte potrebbe essere staccato dalla superficie del piatto cultura durante l&#39;incubazione 24 orezione. </li><li> Lavare le cellule due volte con PBS e digerire con il 0,05% tripsina-EDTA. </li><li> Inibire la tripsina con terreno di coltura DMEM. </li><li> Spin basso le celle e il terreno di coltura raccolto a 1200 giri (circa 150-200g) per 8 minuti. </li><li> Scartare il surnatante. </li><li> Sospendere le cellule in 500 microlitri dal vivo / morto soluzione colorante per 30 minuti (5 calceina nM e 400 nM di etidio-omodimero-2 in PBS) (5x10 4 cellule / ml). </li><li> Trasferimento alle cellule di tubi di citometria a flusso. </li><li> Avviare il software Pro CellQuest. </li><li> Per impostare il citometro a flusso per la misura, preparare del campioni di cellule vive e morte. <ol class="lalpha"><li> Piastra H9c2 cellule ad una densità di 3x10 4 in 12-pozzetti, come descritto al punto 1. </li><li> Preparare vivere controlli cella con trypsinisation singolo come descritto al punto 1. </li><li> Preparare i controlli cellule morte da un trattamento con 10 mM H 2 O 2 per 1 ora. </li><li> Dopo trypsinisation, resuspend vivere e controlli cellule morte in 500 microlitri dal vivo / morto soluzione colorante (5 nM calceina-AM e 400 Nm di etidio-omodimero-2 in PBS). </li></ol></li><li> Le impostazioni dello strumento dovrebbe essere regolata in modo le cellule viventi sono calceina positive e etidio omodimero negativo, mentre le cellule morte sono calceina negativi e positivi omodimero etidio. </li><li> La percentuale di queste popolazioni può essere espresso come barre su un grafico e analisi statistiche possono essere eseguite su questi valori. </li><li> Misurare i diversi gruppi sperimentali. </li></ol> 6. Rappresentante dei risultati: I nostri risultati hanno dimostrato che le cellule staminali mesenchimali aggiunto potrebbe migliorare la sopravvivenza di postischemica cellule cardiache. Immagini di microscopia confocale hanno rivelato diretto cellula-cellula interazioni, come la connessione a membrana parziale o nanotubi intercellulare, che probabilmente giocano un ruolo importante nella protezione osservati 10. I nanotubi arco su distanze di cellule diverse diameters, e il loro diametro era tra i 200 ei 500 nm (frecce bianche). <img src="/files/ftp_upload/3575/3575fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Formazione di nanotubi tra le cellule. Nanotubi di formazione (freccia bianca) è stata osservata tra Vybrant cardiomyoblasts DIO etichettati e Vybrant DiD cellule staminali mesenchimali etichettati. Analisi di citometria a flusso ha mostrato le popolazioni di sopravvivere e cardiomyoblasts necrotiche e cellule staminali mesenchimali. È interessante notare che abbiamo anche osservato un terzo, &#39;ferito&#39; cardiomyoblast popolazione cellulare che conteneva calceina ma conteneva anche l&#39;indicatore delle cellule morte, etidio omodimero (Figura 2). <img src="/files/ftp_upload/3575/3575fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Rappresentante dot-plot della diverse popolazioni cellulari dopo l&#39;ischemia simulata. La valutazione di diversi esperimenti shomer che l&#39;aggiunta di cellule staminali mesenchimali per postischemica cardiomyoblast H9c2 aumentato in modo significativo la percentuale di cellule viventi rispetto ai mioblasti cardiaci colta da sola dopo ischemia (Figura 3). <img src="/files/ftp_upload/3575/3575fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. . Effetto del trattamento con cellule staminali su cardiomyoblasts postischemica Percentuale di cellule viventi era significativamente ridotta dopo ischemia simulata rispetto al controllo (controllo rispetto al modello IR: 90,36 ± 2,60 vs 10,52 ± 0,48, *** p&gt; 0,001), che è aumentato dopo l&#39;aggiunta di cellule staminali mesenchimali (IR modello vs IR + BMSC: 10,52 ± 0,48 vs 25,21 ± 2,13, *** p&gt; 0,001). I dati rappresentano media ± SEM. L&#39;analisi statistica dei dati è stata effettuata utilizzando una analisi della varianza con il post di comparazione multipla di Tukey hoc test.

<ol><li>Dimmeler, S., Burchfield, J., Zeiher, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-Based+Therapy+of+Myocardial+Infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell-Based Therapy of Myocardial Infarction.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 28, (2008).</li>
<li>Kim, S. U., de Vellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell-based+cell+therapy+in+neurological+diseases%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Stem cell-based cell therapy in neurological diseases: A review.</a> Journal of Neuroscience Research. 87, 2183-21 (2009).</li>
<li>Lee, K., Chan, C. K., Patil, N., Goodman, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+therapy+for+bone+regeneration-Bench+to+bedside%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research+Part+B%3A+Applied+Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Cell therapy for bone regeneration-Bench to bedside.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 89, 252-25 (2009).</li>
<li>Gaipa, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GMP-based+CD133%2B+cells+isolation+maintains+progenitor+angiogenic+properties+and+enhances+standardization+in+cardiovascular+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">GMP-based CD133+ cells isolation maintains progenitor angiogenic properties and enhances standardization in cardiovascular cell therapy.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 14, 1619-1619 (2010).</li>
<li>Trounson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+perspectives+in+human+stem+cell+therapeutic+research%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+medicine%22%5BJournal%5D)">New perspectives in human stem cell therapeutic research.</a> BMC medicine. 7, 29-29 (2009).</li>
<li>Mazhari, R., Hare, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+action+of+mesenchymal+stem+cells+in+cardiac+repair%3A+potential+influences+on+the+cardiac+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Clin+Pract+Cardiovasc+Med%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of action of mesenchymal stem cells in cardiac repair: potential influences on the cardiac stem cell niche.</a> Nat Clin Pract Cardiovasc Med. 4, Suppl 1. S21-S21 (2007).</li>
<li>Kimes, B. W., Brandt, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+a+clonal+muscle+cell+line+from+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Properties of a clonal muscle cell line from rat heart.</a> Experimental Cell Research. 98, 367-367 (1976).</li>
<li>Sardao, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vital+imaging+of+H9c2+myoblasts+exposed+to+tert-butylhydroperoxide--characterization+of+morphological+features+of+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Vital imaging of H9c2 myoblasts exposed to tert-butylhydroperoxide--characterization of morphological features of cell death.</a> BMC Cell Biol. 8, 11-11 (2007).</li>
<li>Hescheler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological%2C+biochemical%2C+and+electrophysiological+characterization+of+a+clonal+cell+%28H9c2%29+line+from+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+research%22%5BJournal%5D)">Morphological, biochemical, and electrophysiological characterization of a clonal cell (H9c2) line from rat heart.</a> Circulation research. 69, 1476-1476 (1991).</li>
<li>Cselenyak, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+rescue+cardiomyoblasts+from+cell+death+in+an+in+vitro+ischemia+model+via+direct+cell-to-cell+connections%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells rescue cardiomyoblasts from cell death in an in vitro ischemia model via direct cell-to-cell connections.</a> BMC Cell Biol. 11, 29-29 (2010).</li>
<li>Sauvant, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implementation+of+an+in+vitro+model+system+for+investigation+of+reperfusion+damage+after+renal+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Physiol+Biochem%22%5BJournal%5D)">Implementation of an in vitro model system for investigation of reperfusion damage after renal ischemia.</a> Cell Physiol Biochem. 24, 567-567 (2009).</li>
<li>Namas, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia-Induced+Overexpression+of+BNIP3+is+Not+Dependent+on+Hypoxia-Inducible+Factor+1alpha+in+Mouse+Hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Shock%22%5BJournal%5D)">Hypoxia-Induced Overexpression of BNIP3 is Not Dependent on Hypoxia-Inducible Factor 1alpha in Mouse Hepatocytes.</a> Shock. 36, 196-196 (2011).</li>
<li>Cao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia%2FReoxygenation+Up-Regulated+the+Expression+of+Death+Receptor+5+and+Enhanced+Apoptosis+in+Human+Hepatocyte+Line%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation+Proceedings%22%5BJournal%5D)">Hypoxia/Reoxygenation Up-Regulated the Expression of Death Receptor 5 and Enhanced Apoptosis in Human Hepatocyte Line.</a> Transplantation Proceedings. 38, 2207-2207 (2006).</li>
<li>Meloni, B. P., Meade, A. J., Kitikomolsuk, D., Knuckey, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+neuronal+cell+death+in+acute+and+delayed+in+vitro+ischemia+%28oxygen-glucose+deprivation%29+models%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Characterisation of neuronal cell death in acute and delayed in vitro ischemia (oxygen-glucose deprivation) models.</a> Journal of Neuroscience Methods. 195, 67-67 (2011).</li>
<li>Mimeault, M., Hauke, R., Batra, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells%3A+a+revolution+in+therapeutics--recent+advances+in+stem+cell+biology+and+their+therapeutic+applications+in+regenerative+medicine+and+cancer+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Pharmacology+%26+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Stem cells: a revolution in therapeutics--recent advances in stem cell biology and their therapeutic applications in regenerative medicine and cancer therapies.</a> Clinical Pharmacology & Therapeutics. 82, 252-252 (2007).</li>
<li>Angoulvant, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cell+conditioned+media+attenuates+in+vitro+and+ex+vivo+myocardial+reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Heart+Lung+Transplant%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cell conditioned media attenuates in vitro and ex vivo myocardial reperfusion injury.</a> J Heart Lung Transplant. 30, 95-95 (2010).</li>
<li>Lim, Y. J., Zheng, S., Zuo, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphine+Preconditions+Purkinje+Cells+against+Cell+Death+under+In+Vitro+Simulated+Ischemia%2FReperfusion+Conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">Morphine Preconditions Purkinje Cells against Cell Death under In Vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Conditions.</a> Anesthesiology. 100, 562-562 (2004).</li>
<li>Guo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen-receptor-mediated+protection+of+cerebral+endothelial+cell+viability+and+mitochondrial+function+after+ischemic+insult+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Estrogen-receptor-mediated protection of cerebral endothelial cell viability and mitochondrial function after ischemic insult in vitro.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 30, 545-545 (2010).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il protocollo è dimostrato un approccio in vitro alla questione molto più complessa di terapia con cellule staminali in infarto miocardico, con tutti i vantaggi e gli svantaggi di un tale modello. Ovviamente non può riflettere il complesso (ad esempio, immunologici) eventi che si svolgeranno durante e dopo l&#39;infarto del miocardio, ma può concentrarsi sugli effetti diretti delle cellule aggiunto sulle cellule postischemica. Gli effetti di ischemia simulata su H9c2 cardiomyoblasts molto dipende dal tempo di OGD, sul n...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> calceina-AM </td><td> Molecular Probes </td><td> L3224, C3099 </td><td> <a href="http://www.invitrogen.com">http://www.invitrogen.com</a> </td></tr><tr><td> etidio omodimero-2 </td><td> Molecular Probes </td><td> L3224, E3599 </td><td> <a href="http://www.invitrogen.com">http://www.invitrogen.com</a> </td></tr><tr><td> Vybrant DiD </td><td> Molecular Probes </td><td> V22887 </td><td> <a href="http://www.invitrogen.com">http://www.invitrogen.com</a> </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Reagenti. <table border="1"><tbody><tr><td> Nome del materiale </td><td> Azienda </td><td> Commenti (opzionale) </td></tr><tr><td> Pecon sistema a celle di incubazione per microscopi Zeiss </td><td> Pecon GmbH </td><td> <a href="http://www.pecon.biz/">www.pecon.biz/</a> </td></tr></tbody></table> Tabella 2. Apparecchiature.

trapianto di cellule staminali in un in vitro simulato ischemia / riperfusione modello

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

Protocolli di trapianto di cellule staminali stanno trovando la loro strada nella pratica clinica 1,2,3. Ottenere risultati migliori, rendendo i protocolli più robusto, e di trovare nuove fonti di cellule impiantabili sono al centro di recenti ricerche 4,5. Indagare l&#39;efficacia delle terapie cellulari non è un compito facile e nuovi strumenti sono necessari per indagare i meccanismi coinvolti nel processo di trattamento 6. Abbiamo progettato un protocollo sperimentale di ischemia / riperfusione in modo da consentire l&#39;osservazione di connessioni cellulari e dei meccanismi subcellulari anche durante l&#39;ischemia / riperfusione e dopo il trapianto di cellule staminali e per valutare l&#39;efficacia della terapia cellulare. H9c2 cellule cardiomyoblast sono stati collocati su piastre di coltura cellulare 7,8. Ischemia è stato simulato con 150 minuti in media glucosio libero con il livello di ossigeno inferiore allo 0,5%. Poi, i media normale e livelli di ossigeno sono state reintrodotte per simulare riperfusione. Dopo la deprivazione di ossigeno glucosio,le cellule danneggiate sono state trattate con il trapianto di midollo osseo umano etichettato cellule staminali mesenchimali aggiungendoli alla cultura. Cellule staminali mesenchimali sono preferiti negli studi clinici, perché sono facilmente accessibili con chirurgia mini-invasiva, facilmente espandibile e autologhe. Dopo 24 ore di co-coltura, le cellule sono state colorate con calceina e etidio-omodimero di distinguere tra cellule vive e morte. Questa configurazione ci ha permesso di indagare le connessioni intercellulari utilizzando la microscopia confocale a fluorescenza e di quantificare il tasso di sopravvivenza delle cellule postischemica mediante citometria di flusso. Microscopia confocale hanno mostrato le interazioni delle due popolazioni cellulari, come la fusione cellulare e la formazione di nanotubi intercellulari. Analisi di citometria a flusso ha rivelato 3 gruppi di cellule danneggiate, che può essere tracciata su un grafico e analizzati statisticamente. Queste popolazioni possono essere indagati separatamente e si possono trarre conclusioni su questi dati sull&#39;efficacia del simulatoapproccio terapeutico.

Dimostriamo come impostare uno<em&gt; In vitro</em&gt; Ischemia / riperfusione modello e come valutare l&#39;effetto della terapia con cellule staminali su postischemica cellule cardiache.

Trapianto di cellule staminali in un In vitro Simulato ischemia / riperfusione Modello

I protocolli di trapianto di cellule staminali stanno entrando nella pratica clinica1,2,3. Per ottenere risultati migliori, rendere i protocolli più robusti e...

Le cellule cardiache derivate vengono posizionate su piastre per colture cellulari per simulare l'ischemia. Il modello di ischemia con riperfusione viene ottenuto mantenendo le cellule per 150 minuti in un mezzo privo di glucosio, con livelli di ossigeno inferiori allo 0,5%. Questo periodo ischemico provoca il raggrinzimento e il blebbing della maggior parte delle cellule. Successivamente, vengono reintrodotti il mezzo normale e livelli normali di ossigeno per simulare la riperfusione.Le cellule staminali mesenchimali vengono aggiunte e coltivate insieme alle cellule danneggiate. Dopo 24 ore di cocoltura, le cellule vengono colorate con calcio e etidio bromuro omidimero per differenziare tra cellule vive e morte. Mediante microscopio confocale, si osserva chiaramente la presenza di due popolazioni cellulari e le loro interazioni. L'analisi mediante citometria a flusso rivela tre cluster di cellule danneggiate, che possono essere rappresentati su un grafico e analizzati statisticamente. Il trapianto di cellule staminali è oggetto di studi recenti volti a introdurre i protocolli nella pratica clinica, a migliorare i risultati ottenuti, a rendere i protocolli più robusti e a individua

stem-cell-transplantation-an-vitro-simulated-ischemiareperfusion

Research

Ricerca

JoVE Journal

Medicine

Medicina

La procedura chirurgica per la consegna delle cellule staminali embrionali derivate le cellule endoteliali alle arti posteriori ischemico è dimostrato, con il monitoraggio non invasivo per l'imaging bioluminescenza.

Cellule embrionali staminali endoteliali derivati ​​dalle cellule per il trattamento di ischemia degli arti posteriori

Qui, vi presentiamo un protocollo per generare ingegneria dei tessuti dei vasi innesti che sono funzionali per l'innesto in topi con un doppio semina cellule staminali pluripotenti indotte in parte (PiPSC) - derivato cellule muscolari lisce e PiPSC - cellule endoteliali derivate su una nave decellularized ponteggio bioreattore.

Generazione e innesto delle navi tissutale in un modello di topo

Un modello murino di ischemia-riperfusione cerebrale è istituito per studiare la patofisiologia del colpo. Abbiamo distalmente legare l'arteria cerebrale centrale di destra e l'arteria carotica comune di destra e ripristinare il flusso sanguigno dopo 10 o 40 min di ischemia.

Occlusione del vaso due Mouse modello di Ischemia-riperfusione cerebrale

Qui, descriviamo un modello animale pre-clinico per studiare la fisiofisiologia della lesione ischemia-reperfusione nella microchirurgia ricostruttiva. Questo modello di lembo della pelle gratuito basato sui vasi epigastrici caudali superficiali nel ratto può anche consentire la valutazione di diverse terapie e composti per contrastare i danni da lesione da complicamento dell'ischemia.

Un modello di ratto preclinico per lo studio delle lesioni ischemia-reperfusione in microchirurgia ricostruttiva

Abbiamo cercato di stabilire un modello suine di insufficienza cardiaca indotta dal blocco dell'arteria circumflex sinistra e dal rapido ritmo per testare l'effetto e la sicurezza della somministrazione intramiocardiale delle cellule staminali per terapie basate sulle cellule.

Istituzione di un modello suina di infarto post-miocardico per il trattamento delle cellule staminali

Le cellule staminali sono continuamente studiate come potenziali trattamenti per gli individui con danni miocardiali, tuttavia, la loro diminuzione della vitalità e della ritenzione all'interno del tessuto ferito può influenzare la loro efficacia a lungo termine. In questo manoscritto descriviamo un metodo alternativo per la consegna di cellule staminali in un modello murino di lesione da reperfusione di ischemia.

Consegna intramiocardica ritardata di cellule staminali dopo l'infortunio di ricottamento ischemia in un modello Murine

La distanza spaziale è un parametro chiave nella valutazione del danno da ipossia/riossigenazione in un modello di co-coltura di strati cellulari endoteliali e cardiomiociti separati, suggerendo, per la prima volta, che l'ottimizzazione dell'ambiente spaziale di co-coltura è necessaria per fornire un modello in vitro favorevole per testare il ruolo delle cellule endoteliali nella protezione dei cardiomiociti.

Sviluppo di un modello di co-coltura cellulare per imitare l'ischemia/riperfusione cardiaca in vitro

Questo documento descrive la modellazione ischemia-riperfusione (I / R) in un embrione di pulcino di 3 giorni utilizzando un gancio personalizzato con ago spinale per comprendere meglio lo sviluppo e il trattamento I / R. Questo modello è semplice, veloce e poco costoso.

Generazione di un modello di ischemia-riperfusione del gancio utilizzando un embrione di pulcino in via di sviluppo di tre giorni

La somministrazione cellulare guidata da ultrasuoni intorno al sito di infarto miocardico nei topi è un modo sicuro, efficace e conveniente di trapianto cellulare.

Impianto di cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte ecoguidate in topi infartuati miocardici

Il protocollo mira a fornire metodi per l'encefalomiosinangiosi - innesto di un lembo muscolare temporale vascolare sulla superficie piale del tessuto cerebrale ischemico - per il trattamento dell'ictus ischemico acuto non moyamoya. L'efficacia dell'approccio nell'aumentare l'angiogenesi viene valutata utilizzando un modello transitorio di occlusione dell'arteria cerebrale media nei topi.

Un modello per il trattamento dell'encefalomiosinangiosi dopo ictus indotto da occlusione dell'arteria cerebrale media nei topi

Qui descriviamo un protocollo in vitro per modellare danni da ipossia/reossigenazione nelle cellule epiteliali tubulari prossimali altamente metaboliche. Questo modello è progettato per indurre danni indotti dallo stress metabolico, che possono essere misurati attraverso l'espressione di marcatori di danno prossimale dei tubuli e la valutazione della funzione respiratoria mitocondriale.

Modellizzazione dell'ipossia/lesione da reossigenazione nelle cellule epiteliali tubolari prossimali

Impara a valutare gli effetti della terapia con cellule staminali su cellule cardiache postischemiche utilizzando un modello in vitro di ischemia/riperfusione. Questo metodo permette di analizzare le interazioni cellulari e i meccanismi di recupero.

Trapianto di cellule staminali in un In vitro Simulato ischemia / riperfusione Modello

Esplora altri video