Trapianto di cellule staminali in un In vitro Simulato ischemia / riperfusione Modello

Le cellule cardiache derivate vengono posizionate su piastre per colture cellulari per simulare l'ischemia. Il modello di ischemia con riperfusione viene ottenuto mantenendo le cellule per 150 minuti in un mezzo privo di glucosio, con livelli di ossigeno inferiori allo 0,5%. Questo periodo ischemico provoca il raggrinzimento e il blebbing della maggior parte delle cellule. Successivamente, vengono reintrodotti il mezzo normale e livelli normali di ossigeno per simulare la riperfusione.

Le cellule staminali mesenchimali vengono aggiunte e coltivate insieme alle cellule danneggiate. Dopo 24 ore di cocoltura, le cellule vengono colorate con calcio e etidio bromuro omidimero per differenziare tra cellule vive e morte. Mediante microscopio confocale, si osserva chiaramente la presenza di due popolazioni cellulari e le loro interazioni. L'analisi mediante citometria a flusso rivela tre cluster di cellule danneggiate, che possono essere rappresentati su un grafico e analizzati statisticamente. Il trapianto di cellule staminali è oggetto di studi recenti volti a introdurre i protocolli nella pratica clinica, a migliorare i risultati ottenuti, a rendere i protocolli più robusti e a individuare nuove fonti di cellule impiantabili.

Studiare l'efficacia delle terapie cellulari non è un compito semplice e sono necessari nuovi strumenti per indagare i meccanismi coinvolti nel processo terapeutico. Abbiamo progettato un protocollo sperimentale che permette l'osservazione delle connessioni cellulari e persino dei meccanismi subcellulari durante l'ischemia, il danno da perfusione e dopo il trapianto di cellule staminali. I nostri criteri di progettazione prevedono un sistema completamente in vitro, in cui sono presenti soltanto le cellule dell'ospite e quelle del donatore.

Pertanto, viene isolata dal tessuto circostante. Misurazione continua della vitalità cellulare prima, durante e dopo la lesione per un periodo fino a 24 ore. E chiara identificazione di entrambe le popolazioni cellulari in modo che il destino delle cellule trapiantate possa essere tracciato.

Per raggiungere questo obiettivo, abbiamo impostato un protocollo di deprivazione di ossigeno e glucosio, comunemente abbreviato come OGD, seguito da un periodo di reossigenazione. La nostra scelta delle cellule ospiti è ricaduta su cellule C2C12, una nota linea cellulare di mioblasti cardiache di ratto. Dopo l'OGD, le cellule danneggiate sono state sostenute mediante il trapianto di cellule staminali mesenchimali derivate dal midollo osseo, aggiungendole alla coltura.

Questa configurazione ci ha permesso di studiare le connessioni intercellulari mediante microscopia confocale e di quantificare il tasso di sopravvivenza delle cellule danneggiate mediante citometria a flusso. Cominciamo e vediamo come procedere. Rimuovere il mezzo di coltura dalle cellule H nine C two.

Lavare le cellule due volte con PBS e digerire con tripsina EDTA 0,05% in piatti di Petri per cinque minuti. In un incubatore a 37 gradi, inibire la tripsina con mezzo di coltura DMEM. Centrifugare le cellule a 1200 giri/min per otto minuti.

Dopo aver rimosso il soprannatante, risospendere le cellule in un millimetro di mezzo di coltura DMEM, quindi contare le cellule con l’emocitometro utilizzando la colorazione con blu di tripano: 30.000 cellule H9C2 per pozzetto. In una piastra a 12 pozzetti, posizionare la piastra nell’incubatore con anidride carbonica a 37 gradi per 24 ore. Rimuovere il mezzo mediante aspirazione e lavare le cellule due volte con PBS.

Aggiungere tre millimetri di mezzo privo di glucosio. Posizionare la piastra nel sistema di incubazione cellulare. Avviare il flusso di gas azoto per rimuovere l'ossigeno dal sistema di incubazione.

Attendere fino a quando il livello di ossigeno raggiunge lo 0,5%. Quindi avviare il cronometro: un'ossigeno dello 0,5% corrisponde a una pressione parziale di circa tre millimetri di mercurio. Sottoporre le cellule a 150 minuti di ischemia simulata. Durante l'ischemia, le cellule si staccano dalla superficie e la loro membrana inizia a presentare vescicolazioni. Abbiamo riscontrato che ogni popolazione richiede tempi leggermente diversi per raggiungere un'immagine cellulare del 60-80%.

Per questo motivo suggeriamo di iniziare con l'incubazione a due R. E se non fosse sufficiente, aumentare il tempo di OGD. Nel nostro caso, le cellule age nine C due necessitano tipicamente da 150 a 70 minuti di OGD al termine dell'ischemia simulata.

Rimuovere il mezzo privo di glucosio dalle cellule e aggiungere con pipetta il mezzo di coltura normale nei pozzetti. Collocare una piastra a 12 pozzetti per 30 minuti nell'incubatore con anidride carbonica a 37 gradi. Questo è il periodo di riperfusione.

Durante l'ischemia simulata, preparare le cellule di riserva per il trapianto. Diluire la dieta fluorescente, il DID vibrant, in un rapporto da uno a 200 nel mezzo di coltura DMEM. Aspirare il mezzo dalle cellule di riserva e aggiungere 300 microlitri di DMEM dai piatti di Petri vibrant Brent Place per 30 minuti nell'incubatore con anidride carbonica a 37 gradi.

Dopo 30 minuti al termine della riperfusione, aggiungere mille cellule staminali mesenchimali per pozzetto ai mioblasti cardiaci H nine C two post-ischemici. I passaggi iniziali sono gli stessi della semina di H nine C two: lavaggio due volte con PBS, tripsinizzazione e conteggio. Posizionare la coltura co-coltivata delle cellule nell'incubatore a 37 gradi centigradi con anidride carbonica per 24 ore.

Dopo 24 ore, raccogliere il mezzo di coltura e le cellule aderenti dai pozzetti con ization. È molto importante raccogliere anche il mezzo di coltura, poiché alcune cellule morte potrebbero essersi staccate dalla superficie della piastra durante l'incubazione di 24 ore.

Sospendere le cellule in 500 microlitri di soluzione live, dead, die, 5 NMO di calcio e 400 NMO di omologo di etere in PBS a una concentrazione di cinque volte 10 alla potenza di quattro cellule per millilitro. In caso di colture co, le cellule staminali mesenchimali sono distinte dalle cellule H nine C due grazie all'etichettatura fluorescente specifica per ciascun tipo cellulare. In questo modo è possibile rilevare la fusione cellulare e i siti di contatto tra cellula e cellula.

Il rapporto tra cellule morte può essere valutato in quattro campi visivi indipendenti, utilizzando un obiettivo da 10 volte per ogni coltura in modo cieco, il che fornisce un risultato riproducibile del conteggio cellulare. Trasferire le cellule in provette per citometria a flusso. Avviare il software Cell Quest Pro per configurare il citometro a flusso per la misurazione.

Preparare campioni di controllo di cellule vive e morte. Le cellule vive vengono coltivate alla stessa densità in condizioni normali e colorate con calcio. Le cellule morte vengono preparate mediante trattamento per un'ora con 10 micromoli di perossido di idrogeno, colorate con etidio, omodimero, e raccolte nello stesso modo; le impostazioni dello strumento devono essere regolate in modo che le cellule vive risultino positive al calcio e negative all'etidio omodimero.

Mentre le cellule morte sono negative per il calcio e positive per l'omodimero di etere, la percentuale di queste popolazioni può essere espressa mediante barre su un grafico e su questi valori può essere effettuata un'analisi statistica. Abbiamo scoperto che l'aggiunta di cellule staminali sane aumenta il rapporto tra cellule sopravvissute nella popolazione. In modo interessante, abbiamo inoltre osservato che le cellule salvate dopo il danno possono essere selezionate non solo rispetto a quelle morte, ma anche rispetto a quelle rimaste vive.

Riteniamo che questa popolazione richieda ulteriori indagini. Dopo aver visto questo video, dovreste avere una buona comprensione di come condurre esperimenti di ischemia simulata con trapianto di cellule staminali in vitro in modo standardizzato. Questo è tutto.

Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti. Se avete domande tecniche, non esitate a contattarci. Saremo a disposizione per assistervi.