Percorso di conferma metaboliche e scoperta attraverso ¹³ C-etichettatura dei proteinogenici Aminoacidi

L'obiettivo di questo protocollo è studiare il metabolismo batterico utilizzando l'analisi del metabolismo assistito al carbonio 13. Per cominciare, i microbi vengono coltivati in presenza di substrati di carbonio marcati, che sono incorporati nelle proteine microbiche. I microbi vengono quindi raccolti e gli amminoacidi vengono estratti, idrolizzati e derivatizzati.

I campioni vengono applicati a un gascromatografo e spettrometro di massa o GCMS. Tracciando i percorsi di transizione degli atomi tra i metaboliti nella rete biochimica, è possibile determinare le vie metaboliche funzionali utilizzate dal microbo. Sono Bert Burla.

Il metodo che presentiamo qui può essere utilizzato come complemento alla trascrittomica e alla proteomica per determinare le vie metaboliche nei microbi. Abbiamo utilizzato questa tecnica per studiare i microbi fotosintetici come i cianobatteri per l'utilizzo miotrofico o eterotrofico del carbonio. In questo video, utilizzeremo ANOTHE 5 1 1 42 come ceppo modello per dimostrare l'uso di substrati di carbonio marcati per scoprire nuove funzioni enzimatiche.

A dimostrare la procedura saremo io, li Yu e Chu Yang Fang. Inizia questa procedura coltivando i batteri cyana thesei in un terreno non marcato. Quando i batteri raggiungono la fase di crescita del log medio, inoculare il 3% in volume nel terreno marcato con carbonio 13.

Quindi per evitare l'introduzione di carbonio non marcato dalla sottocoltura iniziale dell'inoculo nello stesso terreno etichettato nella fase di crescita del log medio. Quando i batteri Cy Thesei marcati con carbonio 13 raggiungono la fase di crescita del log medio, raccoglierne 10 millilitri per centrifugazione. Risospendere il pellet in 1,5 millilitri di acido cloridrico a sei molari e trasferirlo in una gascromatografia con tappo a vite in vetro trasparente o in una fiala GC.

Tappare le fiale e metterle in un forno a 100 gradi Celsius per 24 ore per idrolizzare le proteine della biomassa in amminoacidi. L'idrolisi dei pellet di biomassa produce 16 dei 20 amminoacidi comuni dopo l'idrolisi, trasferisce la soluzione di amminoacido in provette da microcentrifuga da due millilitri, quindi centrifuga a 20.000 Gs per cinque minuti. Dopo l'idrolisi, trasferire la soluzione di amminoacidi in provette da microcentrifuga da due millilitri, quindi centrifugare a 20.000 GS per cinque minuti per depositare le particelle solide.

Dopo la centrifuga, trasferire i surnatanti in nuove fiale GC per rimuovere le particelle solide nella soluzione di idrolisi, in modo che non entrino nella colonna GC. Successivamente, gli amminoacidi sono in grado di renderli. Volatile per la separazione mediante gascromatografia sciogliere i campioni essiccati con 150 microlitri di tetraedro, THF e 150 microlitri di silo di butile dimetile e trifluoro metilico.

Acetammide, reagente di derivatizzazione T-B-D-M-S Incubare tutti i campioni in un forno a una temperatura compresa tra 65 e 80 gradi Celsius per un'ora. Agitare i campioni di tanto in tanto per assicurarsi che i metaboliti nella fiala siano disciolti. Centrifugare i campioni a 20.000 GS per 10 minuti e quindi trasferire il surnatante in nuove fiale GC.

Il surnatante dovrebbe essere un programma di soluzione giallastro chiaro. Le temperature GC come segue, si mantengono a 150 gradi Celsius per due minuti. Aumentare di tre gradi Celsius al minuto a 280 gradi Celsius.

Aumentare a 20 gradi Celsius al minuto fino a 300 gradi Celsius, quindi tenere premuto per cinque minuti. Quindi, per una colonna GC da 30 metri, impostare il ritardo del solvente a circa cinque minuti e l'intervallo del rapporto massa/carica tra 60 e 500. Analizzare i campioni mediante GCMS utilizzando un volume di iniezione da uno a cinque o da uno a 10 di un microlitro e un gas di trasporto elio di 1,2 millilitri al minuto dopo la corsa.

Analizza i dati GCMS utilizzando Microsoft Excel. Il tempo di ritenzione GC e i picchi unici del rapporto massa/carica per ciascun amminoacido sono illustrati in questa figura. T-B-D-M-S. Gli amminoacidi derivati sono solitamente chiaramente divisi dalla MS in due frammenti carichi: il frammento M meno 57, che contiene l'intero amminoacido e il frammento M meno 1 59, che manca del gruppo alfa carbossilico dell'amminoacido per la leucina e l'isoleucina.

Il picco M meno 57 è stato sovrapposto da altri frammenti di picchi di massa. N meno 15 può essere utilizzato per analizzare l'intera etichettatura degli amminoacidi. Inoltre, il gruppo F 3 0 2 è spesso rilevato nella maggior parte degli amminoacidi e contiene solo il primo gruppo alfa carbossilico e il secondo carbonio in una spina dorsale di amminoacidi.

Tuttavia, poiché questo Ms.Peak ha spesso un elevato rapporto rumore/segnale, F 3 0 2 non è raccomandato per analizzare quantitativamente i flussi metabolici. La derivatizzazione di amminoacidi o metaboliti centrali introduce quantità significative di isotopi marcati naturalmente, tra cui carbonio 13, ossigeno 18, silicio 29 e silicio 30. Il rumore di misura degli isotopi naturali nell'isotopo di massa grezzo o nello spettro può essere corretto utilizzando un software pubblicato.

I dati finali di marcatura isotopica sono riportati come frazioni di massa. Ad esempio, M zero, M1, M due, M tre e M quattro, che rappresentano frammenti contenenti da zero a quattro carbonio 13 marcati con carbonio ciano. Questi 5 1 1 2 non contengono l'enzima tre anina ammoniaca liasi, che catalizza la conversione di tre anina in due cheto butirrato nella tipica via di sintesi dell'isola.

Pertanto, per risolvere il percorso dell'isola in questo organismo, Cyana THESEI 5 1 1 42 è stato coltivato in ASP due terreni con glicerolo 54 millimolare e analizzato da GCMS come descritto in questo video come mostrato qui, Cyana Thesei 5 1 1 4 2 utilizza la seconda posizione etichettata glicerolo come principale fonte di carbonio, e abbiamo osservato che la tianina e l'alanina il cui precursore è il piruvato, hanno un carbonio etichettato mentre la leucina ISO è stata etichettata con tre atomi di carbonio. Pertanto, sintesi e ciano, questi 5 1 1 4 2 non possono essere derivati dalla via della tianinina impiegata dalla maggior parte degli organismi. D'altra parte, la leucina e la leucina ISO hanno modelli di marcatura identici basati sul frammento M meno 15 e sul frammento M meno 1 59.

Ad esempio, l'isotopo o i dati di N meno 15 contenenti amminoacidi non frammentati hanno mostrato un'etichettatura identica per la leucina e la leucina ISO. Quindi la leucina e la leucina ISO devono essere sintetizzate dagli stessi precursori, piruvato e acetil-CoA. Questa osservazione è coerente con la transizione del carbonio marcata nella via del citramalato per la sintesi delle isole.

Questo metodo può essere utilizzato per studiare il metabolismo di un'ampia varietà di microbi e, una volta padroneggiato, può essere eseguito dall'inizio alla fine in circa una settimana.