Percorso di conferma metaboliche e scoperta attraverso ¹³ C-etichettatura dei proteinogenici Aminoacidi

Lo scopo di questo protocollo è studiare il metabolismo batterico mediante l'analisi del metabolismo assistita dal carbonio 13. Per iniziare, i microrganismi vengono coltivati in presenza di substrati di carbonio marcati, che vengono incorporati nelle proteine microbiche. I microrganismi vengono quindi raccolti ed estratti gli amminoacidi, che vengono successivamente idrolizzati e derivatizzati.

I campioni vengono analizzati mediante gascromatografo e spettrometro di massa, o GCMS. Tracciando i percorsi di transizione degli atomi tra i metaboliti nella rete biochimica, è possibile determinare i percorsi metabolici funzionali utilizzati dal microrganismo. Sono Bert Burla.

Il metodo che presentiamo qui può essere utilizzato come complemento alla trascrittomica e alla proteomica per determinare i percorsi metabolici nei microrganismi. Abbiamo utilizzato questa tecnica per studiare microrganismi fotosintetici come le cianobatterie per l'utilizzo di carbonio miotrofico o eterotrofico. In questo video, utilizzeremo ANOTHE 5 1 1 42 come ceppo modello per dimostrare l'uso di substrati di carbonio marcati al fine di scoprire nuove funzioni enzimatiche.

A dimostrare la procedura sarò io, Li Yu e Chu Yang Fang. Iniziare la procedura coltivando batteri Cyana thesei in un mezzo non marcato. Quando i batteri raggiungono la fase di crescita logaritmica media, inoculare il 3% in volume nel mezzo marcato con carbonio 13.

Successivamente, per evitare l'introduzione di carbonio non marcato dal subcoltura iniziale nel mezzo marcato durante la fase di crescita logaritmica media. Quando i batteri Cy Thesei marcati con carbonio 13 raggiungono la fase di crescita logaritmica media, raccogliere 10 millilitri mediante centrifugazione. Ri-sospendere il pellet in 1,5 millilitri di acido cloridrico 6 M e trasferirlo in un vial chiaro in vetro con tappo a vite per cromatografia gassosa o GC.

Chiudere le provette e posizionarle in un forno a 100 gradi Celsius per 24 ore per idrolizzare le proteine della biomassa in aminoacidi. L'idrolisi dei pellet di biomassa produce 16 dei 20 aminoacidi comuni; dopo l'idrolisi, trasferire la soluzione di aminoacidi in provette microcentrifuga da due millilitri quindi centrifugare a 20.000 G per cinque minuti. Dopo l'idrolisi, trasferire la soluzione di aminoacidi in provette microcentrifuga da due millilitri quindi centrifugare a 20.000 G per cinque minuti al fine di depositare le particelle solide.

Dopo la centrifugazione, trasferire i soprannatanti in nuovi vial per GC per rimuovere le particelle solide dalla soluzione di idrolisi, in modo che non entrino nella colonna cromatografica. Successivamente, gli amminoacidi vengono derivatizzati per renderli volatili e adatti alla separazione mediante cromatografia gassosa; sciogliere i campioni essiccati con 150 microlitri di tetraidrofurano, THF, e 150 microlitri di *tert*-butil-dimetilsilano e metiltri fluorosilano.

Acetamide, reagente di derivatizzazione T-B-D-M-S: incubare tutti i campioni in forno tra 65 e 80 gradi Celsius per un'ora. Vortexare occasionalmente i campioni per assicurarsi che i metaboliti nel vial siano disciolti. Centrifugare i campioni a 20.000 ×g per 10 minuti, quindi trasferire il soprannatante in nuovi vial per GC.

Il surnatante dovrebbe essere una soluzione giallastra limpida. Le temperature della CG sono le seguenti: mantenere a 150 gradi Celsius per due minuti. Aumentare di tre gradi Celsius al minuto fino a 280 gradi Celsius.

Aumentare di 20 gradi Celsius al minuto fino a 300 gradi Celsius, quindi mantenere per cinque minuti. Successivamente, per una colonna GC da 30 metri, impostare il ritardo del solvente a circa cinque minuti e l'intervallo del rapporto massa/carica tra 60 e 500. Analizzare i campioni mediante GCMS utilizzando un volume di iniezione da uno a cinque o da uno a 10 con rapporto di split di un microlitro e gas trasportatore elio a 1,2 millilitri al minuto seguendo l'analisi.

Analizzare i dati GCMS utilizzando Microsoft Excel. In questa figura sono illustrati il tempo di ritenzione in gascromatografia e i picchi unici di rapporto massa/carica per ciascun aminoacido. Gli aminoacidi derivatizzati T-B-D-M-S sono solitamente chiaramente suddivisi dalla spettrometria di massa in due frammenti carichi: il frammento M meno 57, che contiene l'intero aminoacido, e il frammento M meno 159, che manca del gruppo carbossilico alfa dell'aminoacido, nel caso della leucina e dell'isoleucina.

Il picco M meno 57 era sovrapposto ad altri frammenti di picchi di massa. L'N meno 15 può essere utilizzato per analizzare l'intera marcatura degli amminoacidi. Inoltre, il gruppo F 3 0 2 è spesso rilevato nella maggior parte degli amminoacidi e contiene soltanto il primo gruppo carbossilico alfa e i secondi carboni dello scheletro di un amminoacido.

Tuttavia, poiché questo picco di Ms.Peak presenta spesso elevati rapporti tra rumore e segnale, non si consiglia l'uso di F 3 0 2 per l'analisi quantitativa dei flussi metabolici. La derivatizzazione degli amminoacidi o dei metaboliti centrali introduce quantità significative di isotopi naturalmente marcati, tra cui carbonio 13, ossigeno 18, silicio 29 e silicio 30. Il rumore di misura causato dagli isotopi naturali nel campione grezzo di isotopi di massa o nello spettro può essere corretto mediante l'uso di software pubblicati.

I dati finali di marcatura isotopica sono riportati come frazioni di massa. Ad esempio, M zero, M1, M due, M tre e M quattro, che rappresentano frammenti contenenti da zero a quattro atomi di carbonio marcati con carbonio 13. Questo 5 1 1 2 non contiene l'enzima treonina ammoniaca liasi, che catalizza la conversione della treonina in alfa-chetobutirrato nel tipico percorso di sintesi dell'isoleucina.

Pertanto, per risolvere il percorso metabolico dell'isoleucina in questo organismo, Cyana THESEI 5 1 1 42 è stato coltivato nel mezzo ASP due contenente glicerolo 54 millimolare ed analizzato mediante GCMS come descritto in questo video e mostrato qui. Cyana Thesei 5 1 1 4 2 utilizza il glicerolo marcato in posizione secondaria come principale fonte di carbonio, e abbiamo osservato che la treonina e l'alanina, i cui precursori sono il piruvato, presentano un carbonio marcato, mentre l'isoleucina è marcata con tre atomi di carbonio. Pertanto, la sintesi dell'isoleucina in Cyana Thesei 5 1 1 4 2 non può derivare dalla via della treonina utilizzata dalla maggior parte degli organismi. D'altro canto, la leucina e l'isoleucina presentano identici schemi di marcatura basati sul frammento M meno 15 e sul frammento M meno 1 59.

Ad esempio, l'isotopo o i dati provenienti da N-15 contenenti amminoacidi non frammentati hanno mostrato un'etichettatura identica per la leucina e l'isoleucina. Pertanto, leucina e isoleucina devono essere sintetizzate a partire dagli stessi precursori, il piruvato e l'acetil-CoA. Questa osservazione è coerente con il passaggio del carbonio marcato nel percorso della citramalato per la sintesi dell'isoleucina.

Questo metodo può essere utilizzato per studiare il metabolismo di una grande varietà di microrganismi e, una volta appreso, può essere eseguito dalla preparazione alla conclusione in circa una settimana.