Name: Un sistema 3D per condrociti articolari umani in coltura liquido sinoviale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: Impara un sistema di coltura 3D per condrociti articolari umani utilizzando fluido sinoviale. Questo metodo consente colture a lungo termine in un microambiente fisiologico per studiare la rigenerazione cartilaginea.

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Vorremmo ringraziare Robin Nye (Tufts Medical Center), Tomoya Uchimura e Dana Cairns (Tufts University) per aver fornito aiuto di stoccaggio liquido sinoviale e centrifugazione. Questo lavoro è stato finanziato dal NIH (1R01AR059106-01A1) per LZ

Un sistema 3D per condrociti articolari umani in coltura liquido sinoviale In questo lavoro, abbiamo incapsulato condrociti articolari umani in perle di alginato utilizzando una versione modificata produzione-ha suggerito protocollo di incapsulamento (Lonza, e 31). Utilizzando questi costrutti 3D, abbiamo sviluppato un sistema per la coltura delle cellule in un terreno di coltura contenente varie percentuali di liquido sinoviale e umane hanno valutato questi costrutti 3D per l&#39;espressione genica della cartilagine. 1. Preparare condrociti articolari umani (HAC) per tre dimensioni (3D) incapsulamento <ol><li> Scongelare una fiala (1 ml) di condrociti articolari umani (HAC) (Lonza) (Passaggio 2) a bagnomaria 37 ° C per 1 min. </li><li> Mescolare con 1 ml di terreni di crescita dei condrociti (Lonza) e centrifugare a 3000 rpm per 3-5 minuti per raccogliere le cellule. Scartare il surnatante. </li><li> Risospendere il pellet di cellule in terreno di coltura di condrociti (Lonza). </li><li> Le cellule in un tessuto piatto 10 centimetripiastra di coltura (BD Biosciences), e la cultura in terreni di coltura di condrociti (Lonza) fino a quando le cellule sono confluenti. HACs deve essere utilizzato in un numero passaggio non superiore a 3 o 4 (P3 e P4). </li><li> Lavare HACs sulla piastra con 155mm di NaCl al posto della PBS standard, seguita da trypsinzation per raccogliere le cellule per l&#39;incapsulamento alginato tallone. Una volta che le cellule si staccano, centrifugare le cellule a 3000rpm per 5min. Le cellule sono ora pronti per l&#39;incapsulamento 3D. </li></ol> 2. Incapsulare HACs in perline 3D Risospendere il HACs alginato in soluzione 1,2% (Sigma) ad una densità di 8x10 5 cellule / ml. Numero di cellule è stato determinato prima di incapsulamento, utilizzando un contatore cella standard. E &#39;molto importante mescolare bene per assicurare una distribuzione uniforme delle celle in perline. <ol><li> Pipettare l&#39;HAC / soluzione di alginato miscela in una siringa da 12 ml collegata ad un 22-gauge (Tyco Healthcare, Inc.). </li><li> Nel frattempo, preparare un bicchiere da 50 ml con 102 mM CaCl 2 in un volume di 5 volte quella della soluzione HAC / aginate. Inserire una ancoretta all&#39;interno del bicchiere e mescolare il 102 mm CaCl 2 soluzione lentamente (a circa 150 giri al minuto). </li><li> Tenere la punta della siringa di circa 6 centimetri al di sopra della superficie della soluzione di CaCl 2 e aggiungere l&#39;HAC / alginato composto nella soluzione di CaCl 2 goccia a goccia. In generale, le perle alginato risultanti sono 2 millimetri di diametro con una densità di incapsulamento di circa 10 4 cellule / tallone. Nota: L&#39;altezza della siringa sulla soluzione di CaCl 2 è importante. Distanza più breve si tradurrà in lacrima a forma sferica, invece di perle a forma, causando irregolare integrità meccanica e l&#39;incapsulamento delle celle. </li><li> Lasciate che i grani mescolare nella soluzione di CaCl 2 per 20-25 min. Mentre altri protocolli di incapsulamento alginato di indicare un tempo di incubazione molto più breve di 10 minuti, abbiamo trovato che il tempo di incubazione più lungo con il CaCl 2 soluzione migliore l&#39;integrità del essereannunci. </li><li> Rimuovere la soluzione di CaCl 2, lavare le perle 2-3 volte in 2-3 volumi di NaCl, e poi una volta in media di differenziazione dei condrociti (Lonza). Mentre altri protocolli di incapsulamento alginato tallone comportano l&#39;uso di un filtro per le suddette procedure di lavaggio, abbiamo scoperto che le perle alginato diventano spesso intrappolato nel filtro fuori e asciutto, riducendo così l&#39;efficienza di incapsulamento. Abbiamo trovato più efficiente per consentire le perle di depositarsi sul fondo del bicchiere prima di scartare la soluzione. </li><li> Utilizzare una spatola standard per trasferire le perline in piatti della cultura. Noi di solito la cultura 12 perle per ben 3 centimetri per 2 giorni nel terreno di coltura di condrociti condrociti per consentire di adeguarsi al processo di incapsulamento nel medio sono state coltivate a loro prima di passare alla media di differenziazione dei condrociti (Lonza) con liquido sinoviale. </li></ol> 3. Condrociti cultura nella coltura del liquido sinoviale medio <ol><li> Fresco liquido sinoviale può essere ottenuto da un outpatient clinica (Abbiamo ottenuto liquido sinoviale presso la Tufts Medical Center). Il liquido sinoviale può essere trasferito in tubi 15ml falco al laboratorio, e immediatamente centrifugato a 3000 rpm per 15 minuti per rimuovere i detriti cellulari. Aliquota cell-free liquido sinoviale in provette da 1,5 ml microcentrifuga, al fine di evitare ripetuti di congelamento-scongelamento. Surnatante può essere conservato a -80 ° C fino al momento dell&#39;uso. </li><li> Prima di coltura, mescolare il liquido sinoviale con il mezzo di differenziazione dei condrociti (CDM, Lonza) a diversi rapporti volumetrici, con una concentrazione costante di acido ascorbico 100mM e 9 mM CaCl 2 (tale importo traccia di CaCl 2 è quello di garantire l&#39;integrità del alginato perline). </li><li> Tenere la piastra su una piattaforma oscillante in un incubatore ° C 37 (frequenza a dondolo: circa 75 volte / min) per aiutare la distribuzione dei nutrienti all&#39;interno della perline alginato, e per ridurre aggregazione delle perline. Ciò è particolarmente importante in quanto abbiamo la cultura di questi condrociti per un lungo periodo di tempo (fino a 4 settimane). Nota: Mentre la crescita dei condrociti e dei media differenziazione (Lonza) contengono due comuni antibiotici gentamicina e amfotericina, non abbiamo alcun supplemento antibiotici quando abbiamo usato diverse percentuali di liquido sinoviale per la coltura di condrociti. Nessuna contaminazione è stata mai osservata. </li><li> Cambia miscele dei media ogni 2-3 giorni. La viscosità del liquido sinoviale è stato un grande ostacolo in condrociti coltura incapsulati in microsfere di alginato durante il lungo periodo culture. Abbiamo trovato più efficace per diluire il liquido sinoviale medio-integrato con 102mm CaCl 2 (50% v / v), che rafforza anche l&#39;integrità delle perline alginato. In questo modo, il mezzo può essere rimosso lentamente con una pipetta, senza danneggiare le perline. </li></ol> 4. HACs raccolto in perle di alginato per l&#39;analisi di espressione genica Particolare cura deve essere presa durante la raccolta del HACs dalle perle alginato per l&#39;analisi di espressione genica. <ol><li> Lavare le perline alginato 3 Times in 102 mM CaCl 2 per circa 5 minuti ogni volta. </li><li> Recuperare i condrociti con l&#39;aggiunta di 55 mM NaCitrate a un volume 4-5 volte quella delle perline. E &#39;importante che le perline alginato sono totalmente immerso nella soluzione NaCitrate. Agitare o roccia per 20-30 min. </li><li> Spin giù le cellule ed eliminare il surnatante. </li><li> Per RT-PCR, risospendere il pellet cellulare in un tampone di lisi cellulare (Qiagen RNA Kit di isolamento), e procedere con la purificazione di RNA. </li></ol> 5. Fix HACs in perline alginato per l&#39;analisi istologica Particolare cura deve essere presa per raccogliere il HACs dalle perle 3D per l&#39;analisi istologica. <ol><li> Lavare le perline alginato 3 volte in 102 mM CaCl 2 per circa 5 minuti ogni volta. Per lavare via tutto il liquido viscoso sinoviale, abbiamo trovato più efficace di lavare con mezzo di differenziazione dei condrociti (Lonza) durante la notte, oscillando in un incubatore ° C 37 (frequenza a dondolo: circa 75s / min). Il terreno di coltura di condrociti è stato utilizzato per assicurare la sopravvivenza di condrociti in questo lavaggio prolungato e per consentire la massima penetrazione dell&#39;agente di fissaggio. </li><li> Fissare le perline in etanolo al 70% durante la notte, e procedere con l&#39;analisi istologica. Per eseguire la colorazione DAPI, incubare perline alginato con DAPI soluzione (500ng/ml) per 1 ora in dolce dondolio, e lavare per 3 volte con 102 mm CaCl 2 per 15 minuti ogni volta. Dapi immagini possono poi essere visualizzate al microscopio a fluorescenza. Le sfere possono anche essere sezionate per alcian blu e colorazione H &amp; E. </li></ol> 6. Rappresentante Risultati Il nostro metodo di coltura 3D per condrociti umani in alte percentuali di liquido sinoviale è raffigurato nello schema elettrico mostrato in Fig.1. Dopo condrociti umani sono stati incapsulati in microsfere di alginato, sono stati lasciati crescere in media integrato con diversi rapporti di liquido sinoviale. A causa della viscosità del liquido sinoviale, è essenzialecondrociti cultura a dondolo in condizioni costanti per evitare l&#39;accumulo dei costrutti cartilagine e per garantire un&#39;equa distribuzione delle sostanze nutritive. E &#39;anche essenziale per lavare le sfere di alginato ampiamente prima di recuperare i condrociti, in modo che la fissazione o tampone di lisi può penetrare le perline (Fig.1). Luminoso campo (BF) immagini di condrociti nelle perline alginato sono mostrati in figura 2. Colorazione DAPI è stata eseguita per confermare usniform distribuzione delle cellule all&#39;interno della sfere (Fig. 2). Al termine dei 21 giorni di cultura, analisi di espressione genica è stata effettuata da qRT-PCR. Il riferimento gene GAPDH è stato utilizzato per la normalizzazione di tutti PCR, come è stato determinato da uno dei geni di riferimento più affidabili per l&#39;analisi qPCR sui condrociti 32. Un esempio è mostrato in fig. 3, dove abbiamo analizzato i risultati di condrociti articolari umani colti nel liquido sinoviale aggregati di sei pazienti con osteoartrosi. Coerente con il fatto che i condrociti daLonza sono stati estesi in culture 2D, che porterebbe inevitabilmente alla de-differenziazione 33, abbiamo scoperto che giorno 0 condrociti espresso livelli minimi di cartilagine geni della matrice (Fig. 3). 3D coltura di condrociti di media differenziazione dei condrociti (Lonza) o media integrato con liquido sinoviale significativo aumento di espressione genica cartilagine del collagene, aggrecano e MMP13, che indica condrociti ri-differenziazione per giorno 21 (Fig.3) 34. Aumentare la percentuale di liquido sinoviale nei media ha portato a livelli comparabili di matrice cartilaginea marcatori collagene II e l&#39;espressione di mRNA aggrecano (Fig.3a e 3B). Inoltre, condrociti coltivati ​​nel 100% del liquido sinoviale anche mostrato una diminuzione di enzimi degradanti cartilagine MMP13 espressione di mRNA rispetto a quelli coltivati ​​in media solo (Fig.3C). È interessante notare che il livello di espressione di indicatore delle cellule morte caspasi 3 gradualmente diminuita con rapporti sempre maggiore di liquido sinoviale, suggerendo che scoltura del liquido ynovial ha portato a livelli di apoptosi diminuzione (Fig. 3D). Pertanto, i nostri risultati mostrano che condrociti articolari umani in coltura alti livelli di liquido sinoviale in un ambiente 3D è una tecnologia fattibile. Tabelle e figure <img alt="Figura 1." src="/files/ftp_upload/3587/3587fig1.jpg" /> Figura 1. Schema del metodo di condrociti articolari cultura umana in alte percentuali di liquido sinoviale in perle di alginato 3D. In primo luogo, condrociti e la soluzione di alginato si mescolano. Quando viene applicato goccia a goccia alla soluzione di CaCl 2, condrociti sono immobilizzati all&#39;interno del reticolato di Ca-alginato di perline idrogel. Questi costrutti 3D vengono poi coltivate in mezzo differenziazione dei condrociti (Lonza) con diversi rapporti di umana liquido sinoviale. Dopo 21 giorni di coltura in una condizione a dondolo, perle di alginato contenenti le cellule sono lavate ampiamente trascorso il quale le cellule vengono recuperati per il geneanalisi di espressione. <img alt="Figura 2." src="/files/ftp_upload/3587/3587fig2.jpg" /> Figura 2. Campo chiaro (BF) e le immagini DAPI di condrociti articolari umani culture incapsulato con lo 0%, 30%, 50%, 70% e il 100% del liquido sinoviale. Condrociti erano di forma sferica in tutte le condizioni di coltura. Immagini del campo chiaro (BF) e DAPI sono stati sovrapposti per confermare la posizione e la distribuzione dei condrociti. Inserti, le immagini ingrandite. Punte di freccia, colocalizzazione dei condrociti in BF e immagini colorazione DAPI. <img alt="Figura 3." src="/files/ftp_upload/3587/3587fig3.jpg" /> Figura 3. QRT-PCR di incapsulato condrociti articolari umani al giorno 0 (D0) uno dopo 21 giorni di coltura (D21) in un mezzo integrato con rapporti variabili di liquido sinoviale (SF) (0%, 30%, 50%, 70 % e 100%). Risultati di quattro campioni indipendenti sono mostrati qui. GAPDH è stato utilizzato come riferimento interno per tutte le PCR. <strong&gt; A. Collagene II espressione di mRNA. B. Aggrecano espressione di mRNA. C. MMP13 espressione di mRNA. D. Caspasi 3 mRNA espressione. La significatività statistica è stata valutata per il Giorno 0 Giorno 21 campioni e campioni dello 0% e 100% del liquido sinoviale (SF) coltura, utilizzando il software INSTAT. * Denota P &lt;0,05.

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Non abbiamo nulla da rivelare.

In questo rapporto, abbiamo sviluppato un metodo che permette per la cultura dei condrociti articolari umani in un ambiente 3D in mezzo che contiene alte concentrazioni di liquido sinoviale umano. Liquido sinoviale è uno dei principali componenti che costituiscono l&#39;ambiente naturale nella cavità articolare, dove risiedono condrociti articolari. Tuttavia, la viscosità del liquido sinoviale è stata una grande sfida per tridimensionali a lungo termine coltura di condrociti. Per superare la sfida di mantenere la distri...

Tabella di reagenti e attrezzature specifiche: <table border="1"><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti </th></tr><tr><td> Alginato (acido alginico sale di sodio) </td><td> Sigma </td><td> A2158-250G </td><td> 2,4% soluzione conservata a 40 ° C </td></tr><tr><td> Cloruro di calcio diidrato, granulare </td><td> JT Baker </td><td> A19339 </td><td></td></tr><tr><td width="239" rowspan="2" > La crescita dei media condrogenico </td><td width="254" rowspan="2" > Lonza </td><td width="182" > CC-3156 (base media) </td><td width="141" rowspan="2" ></td></tr><tr><td width="182" > CC-4409 (supplemento) </td></tr><tr><td width="239" rowspan="2" > Differenziazione media condrogenico </td><td width="254" rowspan="2" > Lonza </td><td width="182" > CC-3226 (base media) </td><td width="141" rowspan="2" ></td></tr><tr><td width="182" > CC-4408 (supplemento) </td></tr><tr><td> Condrociti articolari umani </td><td> Lonza </td><td > CC-2550 </td><td></td></tr><tr><td> DAPI (4 &#39;,6-Diamidino-2-fenilindolo dicloridrato) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td > D9542 </td><td></td></tr><tr><td> RNeasy mini kit (per l&#39;estrazione di RNA) </td><td> Qiagen </td><td > 74104 </td><td></td></tr><tr><td> Reagenti PCR: SYBR-green </td><td> Quanta </td><td > 95053-500 </td><td></td></tr><tr><td> Siringa da 12 ml </td><td> Tyco-Kendall-Monoject </td><td > 512852 </td><td></td></tr><tr><td> 22-Gague aghi ipodermici </td><td> Tyco Kendall-Monoject </td><td > 8881 </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio </td><td> Olimpo </td><td > IX71 </td><td></td></tr><tr><td> Piattaforma rocker </td><td> Thermolyne Thermoscientific </td><td > Vari-mix </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td ></td><td></td></tr><tr><td> Primer sequenze </td><td></td><td ></td><td></td></tr><tr><td> Collagene IIa-forward </td><td> 5&#39;-ATC CCA CCC TTC TCT CAC AGT-3 &#39; </td><td ></td><td></td></tr><tr><td> Collagene IIa-reverse </td><td> CCTCTGCCTTGACCCGAA-5&#39;-3 &#39; </td><td ></td><td></td></tr><tr><td> MMP13-forward </td><td> 5&#39;-GCC TGT CTT CTT ACA CAC GAC ACT-3 &#39; </td><td ></td><td></td></tr><tr><td> MMP13-reverse </td><td> 5&#39;-GAG AGC AGA TGA CTT GTC ATT GCC-3 &#39; </td><td ></td><td></td></tr><tr><td> Caspasi 3-forward </td><td> 5&#39;-TCA TTA TTC AGG CCT GCC GTG GTA-3 &#39; </td><td ></td><td></td></tr><tr><td> Caspasi 3-reverse </td><td> 5&#39;-TGG ATG AAC CAG GAG CCA CCT TTT -3 &#39; </td><td ></td><td></td></tr></table>

un sistema 3d per condrociti articolari umani in coltura liquido sinoviale

A 3D System for Culturing Human Articular Chondrocytes in Synovial Fluid

Distruzione della cartilagine è un elemento centrale patologica di osteoartrite, una delle principali cause di disabilità negli Stati Uniti. La cartilagine nell&#39;adulto non si rigenera in modo molto efficiente in vivo, e, di conseguenza, l&#39;artrosi conduce alla irreversibile perdita della cartilagine ed è accompagnata da dolore cronico e 1,2 immobilità. Ingegneria dei tessuti cartilagine offre un potenziale promettente per rigenerare e ripristinare la funzionalità dei tessuti. Questa tecnologia in genere implica condrociti semina in ponteggi naturale o sintetica e la coltura del 3D che dà luogo a costruire un mezzo equilibrato per un periodo di tempo con l&#39;obiettivo di un tessuto di ingegneria biochimica e biomeccanica mature che possono essere trapiantate in un sito difetto in vivo 3-6 . Raggiungere una condizione ottimale per la crescita dei condrociti e la deposizione della matrice è essenziale per il successo di ingegneria dei tessuti cartilaginei. Nella nativa comune cavità, cartilagine al articcolare superficie dell&#39;osso è immersa nel liquido sinoviale. Questo liquido chiaro e viscoso fornisce sostanze nutritive per la cartilagine articolare avascolare e contiene fattori di crescita, citochine e gli enzimi che sono importanti per il metabolismo dei condrociti 7,8. Inoltre, il liquido sinoviale facilita il movimento a basso attrito tra le superfici cartilaginee che secernono principalmente attraverso due componenti chiave, acido ialuronico e lubricin 9 10. Al contrario, la cartilagine di ingegneria tessutale è spesso colto in mezzi artificiali. Mentre questi media sono probabilmente in grado di offrire condizioni più definite per lo studio del metabolismo dei condrociti, liquido sinoviale più accuratamente riflette l&#39;ambiente naturale di cui condrociti articolari risiedono in Infatti, il liquido sinoviale ha il vantaggio di essere facile da ottenere e conservare, e che spesso può essere regolarmente rifornito dal corpo. Diversi gruppi hanno completato il terreno di coltura con liquido sinoviale in crescita umano, bovino, coniglio e cane chondrocytes, ma soprattutto utilizzato solo bassi livelli di liquido sinoviale (inferiore al 20%) 11-25. Mentre condrociti pollo, cavallo e umani sono stati colti nel mezzo con una maggiore percentuale di liquido sinoviale, questi sistemi di coltura erano bidimensionali 26-28. Qui vi presentiamo il nostro metodo di coltura di condrociti articolari umani in un sistema 3D con un alta percentuale di liquido sinoviale (fino al 100%) per un periodo di 21 giorni. Nel fare ciò, abbiamo superato un grande ostacolo presentato dalla viscosità del liquido sinoviale. Questo sistema offre la possibilità di studiare condrociti umani nel liquido sinoviale in un ambiente 3D, che può essere ulteriormente raggruppati con altri due importanti fattori (tensione di ossigeno e carico meccanico), 29,30 che costituiscono l&#39;ambiente naturale per la cartilagine di imitare l&#39;ambiente naturale per cartilagine di crescita. Inoltre, questo sistema può essere utilizzato anche per saggiare l&#39;attività del liquido sinoviale sui condrociti e fornire una piattaforma per lo sviluppotecnologie di rigenerazione della cartilagine e le opzioni terapeutiche per l&#39;artrite.

Un sistema 3D di coltura di condrociti articolari umani in alti livelli di liquido sinoviale è descritto. Liquido sinoviale riflette il microambiente più naturale per la cartilagine articolare, e può essere facilmente ottenuti e memorizzati. Questo sistema quindi può essere utilizzato per studiare la rigenerazione della cartilagine e per terapie di screening per il trattamento di artrite.

Un sistema 3D per condrociti articolari umani in coltura liquido sinoviale

La distruzione della cartilagine è una caratteristica patologica centrale dell'osteoartrite, una delle principali cause di disabilità negli Stati Uniti. La cartilagine nell'adulto non ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è coltivare condrociti articolari umani in liquido sinoviale mediante colture a lungo termine. Questo risultato si ottiene innanzitutto incapsulando i condrociti in perle di alginato. Successivamente, i condrociti vengono coltivati in liquido sinoviale, il che permette loro di proliferare in un ambiente tridimensionale che imita le loro normali condizioni di crescita.Il mezzo deve essere sostituito periodicamente per garantire alle cellule un adeguato accesso ai nutrienti. L'ultimo passaggio della procedura consiste nel raccogliere i condrociti dalle perle di alginato per l'analisi dell'espressione genica e l'analisi istologica. Queste analisi confermano che i condrociti coltivati in perle di alginato sono vitali, proliferano e esprimono una quantità significativa di matrice cartilaginea.I principali vantaggi dell'utilizzo di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti consistono nell'analizzare le cellule cartilaginee in un contesto tridimensionale anziché bidimensionale e nel utilizzare il liquido sinoviale come mezzo anziché un mezzo artificiale. Pertanto, la combinazione dell'impiego di una struttura tridimensionale e del liquido sinoviale ci consente di analizzarle in un ambiente più naturale, a differenza del contesto bidimensionale su una piastra e del mezzo artificiale.Il metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nel campo della biologia della cartilagine e dell'ingegneria tissutale. Ad esempio, come si comportano le cellule cartilaginee o condrociti nel liquido sinoviale a lungo termine? E inoltre, dovremmo abituare le cellule cartilaginee al liquido sinoviale prima del trapianto negli ospiti?Preparare un vial da un millilitro di condrociti articolari umani o HACs scongelandoli in acqua calda per un minuto. Quindi mescolare gli HACs in un vial contenente due millilitri di mezzo di crescita per condrociti preriscaldato. Per rimuovere il mezzo di congelamento, che contiene DMSO, centrifugare le cellule a 3000 giri al minuto per tre-cinque minuti, scartare il soprannatante e risospendere le cellule in sette millilitri di mezzo di crescita per condrociti.Successivamente, trasferire le cellule in una piastra da 10 centimetri e coltivarle fino a quando le cellule non diventano confluenti. Le linee cellulari devono essere utilizzate a un numero di passaggio non superiore a tre o quattro. Una volta raggiunta la confluenza, lavare le linee cellulari con una soluzione di cloruro di sodio anziché con PBS.Quindi raccogliere le cellule mediante tripsinizzazione utilizzando 0,5 millilitri di soluzione standard di tripsina-EDTA. Una volta che le cellule si sono staccate, centrifugarle e saranno pronte per l'incapsulamento in 3D. Prendendo le cellule pelletizzate, rimuovere il soprannatante e quindi sospenderle in una soluzione di alginato all'1,2% a una densità di 800.000 cellule per millilitro.Ora preparare una soluzione di cloruro di calcio con un volume pari a cinque volte quello della soluzione di alginato hack. Mantenere la soluzione in lenta agitazione mentre si prepara l'alginato hack. Pipettare la soluzione di alginato hack in una siringa da 12 millilitri collegata a un ago da 22 gauge.Quando il cloruro di calcio è pronto, tenere la punta della siringa a circa quindici centimetri sopra la superficie della soluzione di cloruro di calcio. L'altezza della siringa è sufficiente. La soluzione di cloruro di calcio è molto importante.Se non lo si tiene abbastanza in alto, le perle non saranno sferiche e ben formate. Quindi aggiungere la miscela di alginato frammentato, goccia a goccia. Tipicamente, le perle risultanti hanno un diametro di due millimetri e contengono circa 10 alla quarta cellule per perla.Per migliorare l'integrità delle perle, lasciare agitare le perle in soluzione per 20-25 minuti. Una volta terminata l'agitazione, lasciare sedimentare le perle e decantare la soluzione di cloruro di calcio. Successivamente, lavare le perle da due a tre volte con soluzione di cloruro di sodio, utilizzando un volume pari a circa due-tre volte il volume delle perle.Invece di utilizzare filtri, mantenere le perle umide permettendo loro di sedimentare tra un cambio e l'altro della soluzione di lavaggio. Dopo i lavaggi con cloruro di calcio, effettuare un lavaggio con mezzo di differenziazione per condrociti. Quindi, utilizzando una spatola, trasferire le perle in piatti di coltura e coltivare le perle per 48 ore in mezzo di crescita per condrociti prima di passare al mezzo per condrociti.Mezzo di differenziazione con liquido sinoviale, il liquido sinoviale deve essere preparato subito dopo il prelievo. Trasferire il liquido sinoviale fresco in provette da 15 millilitri e centrifugarle immediatamente a 3000 giri al minuto per 15 minuti. Per rimuovere i detriti cellulari, il supernatante è il liquido sinoviale purificato; aliquotare il liquido in provette microcentrifuga da 1,5 millilitri da conservare a meno 80 gradi Celsius fino a quando non viene determinata la concentrazione ottimale di liquido sinoviale.Utilizzare diversi mezzi di coltura composti da liquido sinoviale e mezzo di differenziazione dei condrociti, in rapporti volumetrici variabili con una concentrazione costante di acido ascorbico e di cloruro di calcio. Incubare le piastre su una piattaforma oscillante in un incubatore a 37 gradi Celsius. Cambiare il mezzo ogni due o tre giorni prima di rimuovere il vecchio mezzo.Diluirlo con soluzione di cloruro di calcio per ridurre la viscosità e, contemporaneamente, rafforzare l'integrità delle perle. Successivamente, prelevarlo lentamente dalle piastre mediante pipetta. Le perle possono essere coltivate fino a quattro settimane prima del raccolto, a seconda della produzione della matrice di proliferazione e degli obiettivi dell'esperimento.Quando si raccolgono gli explant dagli idrogel di alginato per l'analisi dell'espressione genica o istologica, lavare le perle di alginato tre volte in soluzione di cloruro di calcio senza utilizzare un filtro per l'analisi dell'espressione genica. Isolare i condrociti immergendoli in citrato di sodio a un volume quattro-cinque volte superiore a quello delle perle. Agitare la miscela per 20-30 minuti, quindi centrifugare le cellule in provette da 15 millilitri.Eliminare il soprannatante e risospendere il pellet cellulare nel tampone di lisi cellulare proveniente da un kit convenzionale, quindi procedere con il protocollo standardizzato di purificazione dell'RNA per preparare le perle lavate per la fissazione. Dopo i lavaggi con cloruro di calcio, eseguire un'incubazione notturna con il mezzo di differenziamento per condrociti di Wash Inc.Fissare le perle in due millilitri di etanolo al 70% per più di 15 minuti a quattro gradi Celsius e procedere con l'analisi istologica per la colorazione dappy. Incubare le perle di alginato in soluzione di DAPI per un'ora sotto agitazione delicata. Successivamente lavare le perle tre volte con soluzione di cloruro di calcio prima di visualizzare le perle di alginato al microscopio a fluorescenza.Le perle possono anche essere sezionate per l'analisi istologica con colorazione di Ian Blue e con ematossilina ed eosina; la sovrapposizione delle immagini di perle di alginato colorate con DAPI con immagini a campo chiaro ha mostrato una distribuzione uniforme delle cellule all'interno delle perle coltivate in tutte le condizioni, dal mezzo privo di liquido sinoviale al mezzo basato interamente su liquido sinoviale. Al termine del periodo di coltura di 21 giorni, è stata misurata l'espressione genica di condrociti articolari umani coltivati in liquido sinoviale, ottenuto dalla raccolta del liquido di sei pazienti affetti da osteoartrite, in accordo con quanto riportato in studi precedenti. I condrociti del giorno zero esprimevano livelli minimi di geni della matrice cartilaginea; la coltura tridimensionale dei condrociti con mezzo di differenziamento per condrociti o mezzo integrato con liquido sinoviale ha aumentato significativamente l'espressione genica cartilaginea di collageno II, ACAN e MMP-13, indicando un processo di redifferenziazione dei condrociti.Al giorno 21, l'aumento della percentuale di liquido sinoviale nel mezzo ha determinato livelli comparabili di marcatori della matrice cartilaginea. I condrociti coltivati in liquido sinoviale al 100% hanno mostrato persino una riduzione dell'espressione genica di MMP-13, un enzima degradante la cartilagine, rispetto a quelli coltivati nel solo mezzo. In modo interessante, il livello di espressione della caspasi 3, un indicatore della morte cellulare, è diminuito gradualmente all'aumentare dei rapporti di liquido sinoviale, suggerendo che la coltura in liquido sinoviale ha portato a livelli ridotti di apoptosi.Pertanto, coltivare condrociti articolari umani e alti livelli di liquido sinoviale in un ambiente 3D è una tecnologia realizzabile. Una volta acquisita padronanza, la tecnica di incapsulamento potrebbe richiedere meno di un'ora per essere completata. È necessario assicurarsi di lavare accuratamente le perle tra un cambio e l'altro del mezzo di coltura.E inoltre è necessario fare attenzione a non danneggiare le perle durante l'utilizzo della pipetta.

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