Un sistema 3D per condrociti articolari umani in coltura liquido sinoviale

L'obiettivo generale del seguente esperimento è coltivare condrociti articolari umani in liquido sinoviale mediante colture a lungo termine. Questo risultato si ottiene innanzitutto incapsulando i condrociti in perle di alginato. Successivamente, i condrociti vengono coltivati in liquido sinoviale, il che permette loro di proliferare in un ambiente tridimensionale che imita le loro normali condizioni di crescita.

Il mezzo deve essere sostituito periodicamente per garantire alle cellule un adeguato accesso ai nutrienti. L'ultimo passaggio della procedura consiste nel raccogliere i condrociti dalle perle di alginato per l'analisi dell'espressione genica e l'analisi istologica. Queste analisi confermano che i condrociti coltivati in perle di alginato sono vitali, proliferano e esprimono una quantità significativa di matrice cartilaginea.

I principali vantaggi dell'utilizzo di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti consistono nell'analizzare le cellule cartilaginee in un contesto tridimensionale anziché bidimensionale e nel utilizzare il liquido sinoviale come mezzo anziché un mezzo artificiale. Pertanto, la combinazione dell'impiego di una struttura tridimensionale e del liquido sinoviale ci consente di analizzarle in un ambiente più naturale, a differenza del contesto bidimensionale su una piastra e del mezzo artificiale.

Il metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nel campo della biologia della cartilagine e dell'ingegneria tissutale. Ad esempio, come si comportano le cellule cartilaginee o condrociti nel liquido sinoviale a lungo termine? E inoltre, dovremmo abituare le cellule cartilaginee al liquido sinoviale prima del trapianto negli ospiti?

Preparare un vial da un millilitro di condrociti articolari umani o HACs scongelandoli in acqua calda per un minuto. Quindi mescolare gli HACs in un vial contenente due millilitri di mezzo di crescita per condrociti preriscaldato. Per rimuovere il mezzo di congelamento, che contiene DMSO, centrifugare le cellule a 3000 giri al minuto per tre-cinque minuti, scartare il soprannatante e risospendere le cellule in sette millilitri di mezzo di crescita per condrociti.

Successivamente, trasferire le cellule in una piastra da 10 centimetri e coltivarle fino a quando le cellule non diventano confluenti. Le linee cellulari devono essere utilizzate a un numero di passaggio non superiore a tre o quattro. Una volta raggiunta la confluenza, lavare le linee cellulari con una soluzione di cloruro di sodio anziché con PBS.

Quindi raccogliere le cellule mediante tripsinizzazione utilizzando 0,5 millilitri di soluzione standard di tripsina-EDTA. Una volta che le cellule si sono staccate, centrifugarle e saranno pronte per l'incapsulamento in 3D. Prendendo le cellule pelletizzate, rimuovere il soprannatante e quindi sospenderle in una soluzione di alginato all'1,2% a una densità di 800.000 cellule per millilitro.

Ora preparare una soluzione di cloruro di calcio con un volume pari a cinque volte quello della soluzione di alginato hack. Mantenere la soluzione in lenta agitazione mentre si prepara l'alginato hack. Pipettare la soluzione di alginato hack in una siringa da 12 millilitri collegata a un ago da 22 gauge.

Quando il cloruro di calcio è pronto, tenere la punta della siringa a circa quindici centimetri sopra la superficie della soluzione di cloruro di calcio. L'altezza della siringa è sufficiente. La soluzione di cloruro di calcio è molto importante.

Se non lo si tiene abbastanza in alto, le perle non saranno sferiche e ben formate. Quindi aggiungere la miscela di alginato frammentato, goccia a goccia. Tipicamente, le perle risultanti hanno un diametro di due millimetri e contengono circa 10 alla quarta cellule per perla.

Per migliorare l'integrità delle perle, lasciare agitare le perle in soluzione per 20-25 minuti. Una volta terminata l'agitazione, lasciare sedimentare le perle e decantare la soluzione di cloruro di calcio. Successivamente, lavare le perle da due a tre volte con soluzione di cloruro di sodio, utilizzando un volume pari a circa due-tre volte il volume delle perle.

Invece di utilizzare filtri, mantenere le perle umide permettendo loro di sedimentare tra un cambio e l'altro della soluzione di lavaggio. Dopo i lavaggi con cloruro di calcio, effettuare un lavaggio con mezzo di differenziazione per condrociti. Quindi, utilizzando una spatola, trasferire le perle in piatti di coltura e coltivare le perle per 48 ore in mezzo di crescita per condrociti prima di passare al mezzo per condrociti.

Mezzo di differenziazione con liquido sinoviale, il liquido sinoviale deve essere preparato subito dopo il prelievo. Trasferire il liquido sinoviale fresco in provette da 15 millilitri e centrifugarle immediatamente a 3000 giri al minuto per 15 minuti. Per rimuovere i detriti cellulari, il supernatante è il liquido sinoviale purificato; aliquotare il liquido in provette microcentrifuga da 1,5 millilitri da conservare a meno 80 gradi Celsius fino a quando non viene determinata la concentrazione ottimale di liquido sinoviale.

Utilizzare diversi mezzi di coltura composti da liquido sinoviale e mezzo di differenziazione dei condrociti, in rapporti volumetrici variabili con una concentrazione costante di acido ascorbico e di cloruro di calcio. Incubare le piastre su una piattaforma oscillante in un incubatore a 37 gradi Celsius. Cambiare il mezzo ogni due o tre giorni prima di rimuovere il vecchio mezzo.

Diluirlo con soluzione di cloruro di calcio per ridurre la viscosità e, contemporaneamente, rafforzare l'integrità delle perle. Successivamente, prelevarlo lentamente dalle piastre mediante pipetta. Le perle possono essere coltivate fino a quattro settimane prima del raccolto, a seconda della produzione della matrice di proliferazione e degli obiettivi dell'esperimento.

Quando si raccolgono gli explant dagli idrogel di alginato per l'analisi dell'espressione genica o istologica, lavare le perle di alginato tre volte in soluzione di cloruro di calcio senza utilizzare un filtro per l'analisi dell'espressione genica. Isolare i condrociti immergendoli in citrato di sodio a un volume quattro-cinque volte superiore a quello delle perle. Agitare la miscela per 20-30 minuti, quindi centrifugare le cellule in provette da 15 millilitri.

Eliminare il soprannatante e risospendere il pellet cellulare nel tampone di lisi cellulare proveniente da un kit convenzionale, quindi procedere con il protocollo standardizzato di purificazione dell'RNA per preparare le perle lavate per la fissazione. Dopo i lavaggi con cloruro di calcio, eseguire un'incubazione notturna con il mezzo di differenziamento per condrociti di Wash Inc.

Fissare le perle in due millilitri di etanolo al 70% per più di 15 minuti a quattro gradi Celsius e procedere con l'analisi istologica per la colorazione dappy. Incubare le perle di alginato in soluzione di DAPI per un'ora sotto agitazione delicata. Successivamente lavare le perle tre volte con soluzione di cloruro di calcio prima di visualizzare le perle di alginato al microscopio a fluorescenza.

Le perle possono anche essere sezionate per l'analisi istologica con colorazione di Ian Blue e con ematossilina ed eosina; la sovrapposizione delle immagini di perle di alginato colorate con DAPI con immagini a campo chiaro ha mostrato una distribuzione uniforme delle cellule all'interno delle perle coltivate in tutte le condizioni, dal mezzo privo di liquido sinoviale al mezzo basato interamente su liquido sinoviale. Al termine del periodo di coltura di 21 giorni, è stata misurata l'espressione genica di condrociti articolari umani coltivati in liquido sinoviale, ottenuto dalla raccolta del liquido di sei pazienti affetti da osteoartrite, in accordo con quanto riportato in studi precedenti. I condrociti del giorno zero esprimevano livelli minimi di geni della matrice cartilaginea; la coltura tridimensionale dei condrociti con mezzo di differenziamento per condrociti o mezzo integrato con liquido sinoviale ha aumentato significativamente l'espressione genica cartilaginea di collageno II, ACAN e MMP-13, indicando un processo di redifferenziazione dei condrociti.

Al giorno 21, l'aumento della percentuale di liquido sinoviale nel mezzo ha determinato livelli comparabili di marcatori della matrice cartilaginea. I condrociti coltivati in liquido sinoviale al 100% hanno mostrato persino una riduzione dell'espressione genica di MMP-13, un enzima degradante la cartilagine, rispetto a quelli coltivati nel solo mezzo. In modo interessante, il livello di espressione della caspasi 3, un indicatore della morte cellulare, è diminuito gradualmente all'aumentare dei rapporti di liquido sinoviale, suggerendo che la coltura in liquido sinoviale ha portato a livelli ridotti di apoptosi.

Pertanto, coltivare condrociti articolari umani e alti livelli di liquido sinoviale in un ambiente 3D è una tecnologia realizzabile. Una volta acquisita padronanza, la tecnica di incapsulamento potrebbe richiedere meno di un'ora per essere completata. È necessario assicurarsi di lavare accuratamente le perle tra un cambio e l'altro del mezzo di coltura.

E inoltre è necessario fare attenzione a non danneggiare le perle durante l'utilizzo della pipetta.