Applicazione di MassSQUIRM per le misure quantitative delle attività demetilasi lisina

Il protocollo di squirm di massa mira a quantificare l'attività della lisina demetilasi utilizzando la metilazione isotopica e la spettrometria di massa maldi esegue prima reazioni di demetilazione catalizzate da enzimi su peptidi contenenti lisina metilata. I residui quindi metilano chimicamente i prodotti peptidici della reazione della demetilasi con formaldeide deuterata per produrre peptidi uniformemente metilati che ionizzano allo stesso modo mediante maldi procedono a quantificare ciascuna specie peptidica con spettrometria di massa multipla e tengono conto della sovrapposizione isotopica. Al fine di identificare le quantità relative di un mono colorante e peptidi metilati trimm, i risultati dello squirm di massa determinano le quantità relative di ciascun prodotto di reazione della demetilasi in base alle variazioni di massa.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la spettrometria di massa ammuffita di routine è che il punteggio di massa tiene conto delle differenze di ionizzazione tra peptidi metilati diversi. Abbiamo avuto l'idea di questo approccio quando abbiamo sviluppato un metodo per misurare i livelli di acetilazione degli istoni utilizzando anidride acetica isotopicamente pesante. La sfida di questa tecnica è l'estrazione dei dati dell'area di picco, che può essere complicata dalla sovrapposizione degli inviluppi isotopici dei peptidi.

Per la reazione della demetilasi hanno combinato 125 nanogrammi di demetilasi specifica per lisina ricombinante un enzima con 0,25 microgrammi di peptide biotinilato dimetil isone H tre in un volume finale di 20 microlitri di tampone demetilasi. Preparare anche un campione di controllo contenente 0,25 microgrammi di peptide senza l'LSD, un enzima, incubare le provette di reazione e di controllo per due ore a 37 gradi Celsius. Successivamente, per preparare R, due perle porose da 20 micron mescolano volumi uguali di perle e metanolo.

Quindi aggiungere 10 volumi di acido formico TFA, aggiungere otto microlitri di perle porose a ciascun campione e agitare per 15 minuti a temperatura ambiente. Nel frattempo, condizionare due punte della cerniera C 18. Pipettare due volte con 20 microlitri di TFA 0,1%, quattro volte con nitrile aceto al 70%, 0,1% TFA e quattro volte con TFA 0,1%.

Quindi, caricare i due campioni sulle punte delle cerniere condizionate. Con un pipettatore, spingere il volume attraverso la resina C 18. Ripetere l'operazione fino a quando il volume totale di entrambi i campioni non è stato spinto attraverso le punte della cerniera.

Quindi lavare due volte le punte della cerniera con 20 microlitri di campioni di eluizione TFA allo 0,1% in 40 microlitri di tampone illusione e procedere all'asciugatura completa con un concentratore speed vac. Per prima cosa risospendere il campione in 100 microlitri di tampone fosfato 50 millimolare pH 7,4. Quindi aggiungere otto microlitri di bore dimetil ammina e 16 microlitri di formaldeide declassata.

Incubare a quattro gradi Celsius per due ore. Ripetere la metilazione riduttiva aggiungendo la noiosa dimetillamina e la formaldeide deuterata e incubare per due ore. La terza volta, aggiungere la noiosa dimetillamina e incubare a quattro gradi Celsius per 15 ore.

Spegnere la reazione con 12,5 microlitri di tris molare a pH 7,4 procedere all'asciugatura completa con un concentratore speed vac. Per prima cosa, sospendere i campioni di controllo e di reazione della demetilasi in 100 microlitri di tampone fosfato 50 millimolare pH 7,4.

Ora aggiungi otto microlitri di perle porose ai campioni di controllo e di reazione della demetilasi e raccogli sulle punte delle cerniere come mostrato in precedenza. Eludere in volumi di due microlitri su una piastra per campioni MALDI e lasciare asciugare a temperatura ambiente fino alla cristallizzazione. Procedere all'analisi dei campioni mediante spettrometria di massa.

Apri i file spectro nel software di lavoro ed esporta nel software M su Z. Verificare ulteriormente i prodotti di reazione mediante spettrometria di massa tandem. Innanzitutto, determinare il rapporto dell'area del picco degli isotopi del carbonio 13 C due e del carbonio 13 C quattro rispetto al picco monoisotopico per il campione di controllo.

Utilizzare questi rapporti calcolati per quantificare la quantità relativa di peptide esistente in ciascuna modifica. Stato del campione di reazione della demetilasi. L'enzima LSD one può essere efficacemente utilizzato nella quantificazione di massa della demetilazione della lisina.

Poiché la reazione di controllo non subisce una metilazione riduttiva, indica l'inviluppo isotopico tipico per questo peptide Le aree di picco risultanti determinano i rapporti di fondo del peptide esistente nel carbonio 13 C due e nel carbonio 13 C quattro. Gli stati isotopici, le aree di picco dello spettro di massa per la reazione di controllo consentono la quantificazione della quantità relativa di peptide esistente in ogni stato di modifica. Nella reazione della demetilasi, le aree di picco di queste reazioni di controllo e demetilasi determinano il 33,7% di dimetillisina 4, 42, 0,3% di monometil lisina quattro e il 24% di lisina non metilata quattro.

Questo approccio di massa offre intuizioni chiave nel campo dell'epigenetica degli istoni, come ad esempio il modo in cui la demetilazione dei residui di lisina istonica contribuisce a varie malattie. Sebbene questo test di metilazione sia stato applicato per studiare le demetilasi, può essere utilizzato anche per studiare le metiltransferasi.