Name: Applicazione di MassSQUIRM per le misure quantitative delle attività demetilasi lisina (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 2 s
Description: Scopri come quantificare l'attività delle demetilasi lisina con spettrometria di massa MALDI e marcatura isotopica. Questo metodo permette di misurare con precisione i cambiamenti nei livelli di metilazione lisina.

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Ringraziamo il Fondo UAMS Proteomics supporto spettrometria di massa. Il finanziamento per questo progetto è stato fornito da sovvenzioni NIH P20RR015569, P20RR016460 e R01DA025755.

Questo protocollo è stato modificato da Blair et al. 6. 1. LSD1 demetilazione Assay <ol><li> In un volume finale di 20 pl, combinare 125 ng LSD1 ricombinante con 0,25 mg di metil-istone H3 peptide (ARTKme2QTARKSTGGKAPRKQLYK-biotina) in tampone demetilasi (50 mM Tris-Cl pH 8,5, 50 mM KCl, 5 mM MgCl 2, 5% glicerolo). Inoltre, eseguire un controllo solo peptide senza enzima. Il controllo è per la sezione 3 e non necessita di metilazione riduttiva. </li><li> Incubare per 2 ore a 37 ° C. </li><li> Per raccogliere i peptidi, aggiungere 8 microlitri Poros R2 sfere 20 micron a ciascun campione e agitare per 15 minuti a temperatura ambiente. Preparare perline Poros sospendendo 1 volume di perline con 1 volume di metanolo, e quindi aggiungere 10 volumi di 5% di acido formico / 0,2% TFA. </li><li> Condizione due C 18 ZipTips aspirando 20 microlitri di 0.1% TFA nella punta e spingendolo indietro con una pipetta. Fate questo due volte con lo 0,1% TFA, quattro volte con il 70% acetonitrile / 0,1% TFA, e quattro volte di nuovo con 0,1% TFA. </li><li> Caricare i due campioni (controllo e la reazione demetilasi) sulle condizionata C 18 ZipTips pipettando l&#39;impasto tallone dietro la resina C 18 nelle ZipTips e spingendo il volume attraverso con una pipetta. </li><li> Lavare ZipTips due volte con 20 pl di 0,1% TFA. </li><li> Eluire in 40 pl di 70% acetonitrile / 0,1% TFA. </li><li> Liofilizzato ogni eluente completamente con un concentratore SpeedVac. </li></ol> 2. Metilazione riduttiva Questa porzione del protocollo viene modificato da Blair et al. E Rayment et al. 6,7. <ol><li> Risospendere la reazione demetilasi in 100 pl di tampone fosfato 50 mM, pH 7,4. </li><li> Per la reazione demetilasi, aggiungere 8 pl di 15 mg / mL borano dimetilammina. Borano dimetilammina viene sciolto in tampone fosfato 50 mM, pH 7,4, per dare 15 mg / ml di soluzione concentrata.Questo dovrebbe essere fresco. </li><li> Per la reazione demetilasi, aggiungere 16 pl di 250 mM formaldeide deuterato. La 250 formaldeide mM deuterato si prepara diluendo lo stock in H 2 0. Questo dovrebbe essere fresco. </li><li> Incubare a 4 ° C per 2 ore. </li><li> Ripetere i punti 2.2, 2.3 e 2.4. </li><li> Ripetere il punto 2.2. </li><li> Incubare a 4 ° C per circa 15 ore. </li><li> Per il campione demetilasi, aggiungere 12,5 microlitri di 1 M Tris, pH 7,4 per placare la reazione riduttiva metilazione. </li></ol> 3. Spettrometria di massa MALDI <ol><li> Aggiungi Poros R2 20 perline micron alla reazione demetilasi, e raccogliere il ZipTips come descritto nei passaggi 1,3-1,6. </li></ol> Nota: Re-sospendere il controllo in 100 pl di tampone fosfato 50 mM, pH 7,4 e trattare come l&#39;altro campione partendo dal punto 3,1. <ol start="2"><li> Eluire il controllo e campioni di reazione demetilasi dalle ZipTips su una piastra di campioni utilizzando MALDI 2 microlitri di 33% saturared 2,5-diidrossibenzoico acido. Per preparare il 33% di acido 2,5-diidrossibenzoico, una soluzione satura di acido 2,5-diidrossibenzoico in 70% acetonitrile / 0,1% TFA e quindi diluire al 33% saturo in 70% acetonitrile / 0,1% TFA. Lasciare i campioni eluiti ad asciugare e cristallizzare. </li><li> Raccogliere spettri di massa con un MALDI-prOTOF spettrometro di massa PerkinElmerSciex o disponibili ad alta risoluzione spettrometro di massa MALDI 8,9,10. </li><li> Vedi spettri ed estrarre le aree dei picchi che utilizzano software PerkinElmerSciex TOFworks o software fornito dal produttore spettrometro di massa. </li><li> Verificare prodotti di reazione da MS 2 con un sistema di spettrometria di massa disponibile fornendo funzionalità di spettrometria di massa tandem. </li></ol> 4. Analisi dei dati <ol><li> Al fine di compensare la sovrapposizione isotopici creati utilizzando formaldeide pesante (Figura 1B), determinare l&#39;area di picco (A) rapporto di 13 C 2 e 13 C 4 isotopi relative per il picco monoisotopico per il campione di controllo, che non ha subito metilazione riduttiva (Fig. 2A). Eq 1: A 13C2 / A 12C = r 1 Eq 2: A 13C4 / A 12C = r 2 Questo vi darà il rapporto di peptide esistenti in questi stati isotopica (r 1 e r 2) specifico per il tuo esperimento e spettrometro di massa. </li><li> Utilizzare la r 1 r 2 e valori nelle seguenti formule per quantificare la quantità relativa di peptide esistente in ogni stato modificazione del campione reazione demetilasi (Fig. 2B): Eq 3: H3K4me2 = A 1 Eq 4: H3K4me = A 2 - r 1 (A 1) Eq 5: H3K4 = A 3 - r 2 (A 1) - [r 1 (A 2 - r 1 (A 1))] </li></ol> 5. Risultati rappresentativi Utilizzando LSD1, ci mostrano l&#39;efficacia di MassSQUIRM per quantificaredemetilazione lisina. Come descritto nella sezione Testo protocollo, abbiamo eseguito un saggio demetilasi con 125 ng di LSD1 e 0,25 mg di metil-istone H3 peptide (ARTKme2QTARKSTGGKAPRKQLYK-biotina). Il controllo e la reazione demetilasi campioni sono stati sottoposti a metilazione riduttiva e spettrometria di massa MALDI. La reazione di controllo che non ha subito metilazione riduttiva mostrato la busta isotopico tipico per questo peptide e fornito aree di picco di equazioni 1 e 2 (Figura 2A). Lo spettro di massa per la reazione demetilasi fornito aree di picco per 3-5 equazioni (Figura 2B). Utilizzando le aree dei picchi dal controllo e reazione demetilasi, abbiamo determinato che LSD1 demetilato il peptide per dare i seguenti prodotti di reazione: 33,7% di metil-Lys4, 42,3% mono-metil Lys4, e 24% non-metilata Lys 4. Fare riferimento a Blair et al. Per l&#39;analisi completa di LSD1 attività demetilasi nonché studi inibitori 6. Si noti che le variabili cambiano come tempo di reazione, enzimaticaconcentrazione e la concentrazione del substrato consentirà una approfondita analisi delle attività. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3604/3604fig1.jpg" /> Figura 1. Panoramica MassSQUIRM. (A) Un peptide N-terminale da istone H3 viene mostrato come un-(verde), mono-(rosso), o di-(blu) metilato a lisina 4. Variazione della composizione chimica di ciascun peptide porta a ionizzazione differenziale rendere complesso quantificazione. (B) metilazione riduttiva converte tutti i residui di lisina al di-metil stato che fa sì che tutti i peptidi per ionizzare in modo simile. L&#39;uso di formaldeide pesante nella reazione di metilazione riduttiva permette la conservazione dell&#39;identità della metilazione originale. Cerchi aperti indicano metilazione luce, mentre i cerchi chiusi indicano metilazione pesante. Modificato da Blair et al. 2011 6. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3604/3604fig2.jpg" /> Figure 2. MassSQUIRM può essere utilizzato per quantificare peptidi differenzialmente metilati. (A) di A-metilato sintetico istone H3 peptide (ARTKme2QTARKSTGGKAPRKQLYK-biotina) è stato analizzato mediante spettrometria di massa e rapporti di picco relativa al picco monoisotopico sono state rilevate come r 1 ed r 2 in equazioni 1 e 2. (B) Lo stesso peptide sintetico è stato incubato con 125 ng LSD1 in tampone demetilasi per due ore a 37 ° C. I campioni sono stati poi sottoposti ad analisi MassSQUIRM. Una popolazione mista di sovrapposizione picchi rappresentano tre diversi stati di metilazione come si vede nella figura 1B. Le aree sotto i picchi sono stati notati monoisotopico come A 1, A 2 e A 3. Aree dei picchi sono stati utilizzati nelle equazioni 3-5. Cerchi aperti indicano metilazione luce, mentre i cerchi chiusi indicano metilazione pesante. Modificato da Blair et al. 2011 6.

<ol><li>Goldberg, A. D., Allis, C. D., Bernstein, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetics%3A+a+landscape+takes+shape%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Epigenetics: a landscape takes shape.</a> Cell. 128, 635-638 (2007).</li>
<li>Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+modifications+and+their+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Chromatin modifications and their function.</a> Cell. 128, 693-705 (2007).</li>
<li>Blair, L. P., Cao, J., Zou, M. R., Sayegh, J., Yan, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+Regulation+by+Lysine+Demethylase+5+%28KDM5%29+Enzymes+in+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Epigenetic Regulation by Lysine Demethylase 5 (KDM5) Enzymes in Cancer.</a> Cancers (Basel). 3, 1383-1404 (2011).</li>
<li>Cole, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+probes+for+histone-modifying+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemical probes for histone-modifying enzymes.</a> Nat. Chem. Biol. 4, 590-597 (2008).</li>
<li>Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+demethylation+mediated+by+the+nuclear+amine+oxidase+homolog+LSD1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Histone demethylation mediated by the nuclear amine oxidase homolog LSD1.</a> Cell. 119, 941-953 (2004).</li>
<li>Blair, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MassSQUIRM%3A+An+assay+for+quantitative+measurement+of+lysine+demethylase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics%22%5BJournal%5D)">MassSQUIRM: An assay for quantitative measurement of lysine demethylase activity.</a> Epigenetics. 6, 490-499 (2011).</li>
<li>Rayment, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+structure+of+myosin+subfragment-1%3A+a+molecular+motor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional structure of myosin subfragment-1: a molecular motor.</a> Science. 261, 50-508 (1993).</li>
<li>Collom, S. L., Jamakhandi, A. P., Tackett, A. J., Radominska-Pandya, A., Miller, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CYP2E1+active+site+residues+in+substrate+recognition+sequence+5+identified+by+photoaffinity+labeling+and+homology+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Biochem.+Biophys%22%5BJournal%5D)">CYP2E1 active site residues in substrate recognition sequence 5 identified by photoaffinity labeling and homology modeling.</a> Arch. Biochem. Biophys. 459, 59-69 (2007).</li>
<li>Gradolatto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saccharomyces+cerevisiae+Yta7+Regulates+Histone+Gene+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Saccharomyces cerevisiae Yta7 Regulates Histone Gene Expression.</a> Genetics. 179, 291-304 (2008).</li>
<li>Taverna, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yng1+PHD+finger+binding+to+histone+H3+trimethylated+at+lysine+4+promotes+NuA3+HAT+activity+at+Lysine+14+of+H3+and+transcripiton+at+a+subset+of+targeted+ORFs%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Yng1 PHD finger binding to histone H3 trimethylated at lysine 4 promotes NuA3 HAT activity at Lysine 14 of H3 and transcripiton at a subset of targeted ORFs.</a> Mol. Cell. 24, 785-796 (2006).</li>
</ol>

Non abbiamo nulla da rivelare.

MassSQUIRM è un metodo poco costoso e quantitative per l&#39;analisi complessiva dell&#39;attività di demethylases lisina coinvolti in mono-e di-metilazione. MassSQUIRM quantificazione offre non solo del prodotto della reazione, ma anche per gli intermedi. Questa analisi può essere utilizzato come un potente strumento per studiare il meccanismo di demethylases istone LSD1 e altri. Sarà anche utile per classificare molti enzimi recentemente scoperti demetilasi lisina come PHF8 e potrebbe essere utilizzato per alcuni enzi...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> LSD1 </td><td> BPS Biosciences </td><td> 50100 </td></tr><tr><td> H3K4me2-biotina peptide </td><td> preparato in-house </td><td> nessuno </td></tr><tr><td> POROS R2 20 perline micron </td><td> Applied Biosystems </td><td> 1-1129-06 </td></tr><tr><td> C 18 ZipTip </td><td> Millipore </td><td> ZTC18M </td></tr><tr><td> Acido trifluoroacetico (TFA) </td><td> Thermo </td><td> 28904 </td></tr><tr><td> acetonitrile </td><td> Pescatore </td><td> A996 </td></tr><tr><td> 2,5-diidrossibenzoico acido </td><td> Sigma </td><td> 85707 </td></tr><tr><td> Borano dimetilammina </td><td> Sigma </td><td> 180238 </td></tr><tr><td> isotopicamente pesante d 2-formaldeide </td><td> Cambridge Isotope Laboratories </td&gt; <td> DLM-805-20 </td></tr><tr><td> Tris </td><td> Pescatore </td><td> BP154 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> Pescatore </td><td> BP366 </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> Pescatore </td><td> BP214 </td></tr><tr><td> Glicerina </td><td> Pescatore </td><td> G33 </td></tr><tr><td> Acido formico </td><td> Fluka </td><td> 06440 </td></tr><tr><td> Metanolo </td><td> Pescatore </td><td> A452 </td></tr><tr><td> Na-fosfato </td><td> Pescatore </td><td> BP329 </td></tr><tr><td> SpeedVac Concentrator </td><td> Dotto </td><td> DNA110 </td></tr><tr><td> MALDI-prOTOF Spettrometro di massa e TOFworks software </td><td> PerkinElmerSciex </td><td> nessuno </td></tr></tbody></table>

applicazione di masssquirm per le misure quantitative delle attività demetilasi lisina

Application of MassSQUIRM for Quantitative Measurements of Lysine Demethylase Activity

Recentemente, i regolatori epigenetici sono stati scoperti come i giocatori chiave per molte diverse malattie 1-3. Come risultato, questi enzimi sono obiettivi primari di studi piccola molecola e sviluppo 4 farmaci. Molti regolatori epigenetici hanno solo recentemente è stato scoperto e sono ancora in fase di classificazione. Tra questi enzimi sono demethylases lisina che rimuovono gruppi metilici da lisine degli istoni ed altre proteine. A causa della natura di questa nuova classe di enzimi, pochi saggi sono stati sviluppati per studiare la loro attività. Questo è stato un blocco stradale sia per la classificazione e lo studio elevato throughput di demethylases istoni. Attualmente, saggi demetilasi esistono pochi. Quelli che esistono tendono ad essere di natura qualitativa e non possono contemporaneamente discernere tra i diversi stati di metilazione della lisina (Nazioni Unite-, mono-, di-e tri-). La spettrometria di massa è comunemente usato per determinare l&#39;attività demetilasi ma gli attuali dosaggi di massa spettrometria di farenon affrontare se peptidi differenzialmente metilati ionizzare in modo diverso. Ionizzazione dei peptidi metilati differenziale rende il confronto stati metilazione difficile e certamente non quantitativa (Figura 1A). Così test disponibili non sono ottimizzati per l&#39;analisi completa delle attività demetilasi. Qui si descrive un metodo chiamato MassSQUIRM (spettrometria di massa quantificazione utilizzando isotopica metilazione riduttiva) che si basa sulla metilazione riduttiva di gruppi amminici con formaldeide deuterato di costringere tutti lisine essere di-metilato, rendendoli così in sostanza la stessa specie chimiche e quindi ionizzare l&#39; stesso (figura 1B). La differenza chimica soltanto dopo la metilazione riduttiva è idrogeno e deuterio, che non influenza l&#39;efficienza di ionizzazione MALDI. Il dosaggio MassSQUIRM è specifico per i prodotti di reazione demetilasi con un-lisine, mono-o di-metilati. Il saggio è applicabile anche a methyltransferases lisina dando la same prodotti di reazione. Qui, si usa una combinazione chimica di metilazione riduttiva e spettrometria di massa MALDI per misurare l&#39;attività di LSD1, uno demetilasi lisina in grado di rimuovere di-e mono-metil gruppi, su un substrato peptidico sintetico 5. Questa analisi è semplice e facilmente suscettibili di qualsiasi laboratorio con accesso ad uno spettrometro di massa MALDI in laboratorio o attraverso un servizio di proteomica. Il saggio deve ~ 8 volte la gamma dinamica, ed è facilmente scalabile in formato piastra 5.

Presentiamo un metodo per utilizzare spettrometria di massa MALDI e chimica metilazione riduttiva per quantificare variazioni di metilazione lisina.

Applicazione di MassSQUIRM per le misure quantitative delle attività demetilasi lisina

Recentemente, i regolatori epigenetici sono stati identificati come elementi chiave in molte diverse patologie 1-3. Di conseguenza, questi enzimi rappresentano bersagli primari per piccole...

Il protocollo mass squirm mira a quantificare l'attività della lisina desmetilasi utilizzando la metilazione isotopica e la spettrometria di massa MALDI. In primo luogo, si eseguono reazioni enzimatiche di desmetilazione su peptidi contenenti lisina metilata. Successivamente, si metilano chimicamente i prodotti peptidici della reazione di desmetilazione con formaldeide deuterata per generare peptidi uniformemente metilati che ionizzano nello stesso modo mediante MALDI. Si procede quindi a quantificare ciascuna specie peptidica mediante spettrometria di massa e si tiene conto dell'overlap isotopico. Al fine di identificare le quantità relative di peptidi metilati in forma non, mono, di e trimetilata, i risultati del mass squirm determinano le quantità relative di ciascun prodotto della reazione di desmetilasi in base alle variazioni di massa.Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la spettrometria di massa su coltura tradizionale, è che il punteggio di massa tiene conto delle differenze di ionizzazione tra peptidi con diverso grado di metilazione. Abbiamo concepito per la prima volta questa strategia quando abbiamo sviluppato un metodo per misurare i livelli di acetilazione delle istoni utilizzando anidride acetica isotopicamente pesante. La difficoltà principale di questa tecnica consiste nell'estrazione dei dati relativi all'area dei picchi, che può risultare complicata dall'overlap degli involucri isotopici dei peptidi.Per la reazione della desmetilasi, combinare 125 nanogrammi di enzima ricombinante lisina-specifica desmetilasi uno con 0,25 microgrammi di peptide di istone H3 dimetilato biotinilato in un volume finale di 20 microlitri di tampone per desmetilasi. Preparare inoltre un campione di controllo contenente 0,25 microgrammi di peptide senza l'enzima LSD1 e incubare i tubi della reazione e del controllo per due ore a 37 gradi Celsius. Successivamente, per preparare R2, perle porose da 20 micron, mescolare volumi uguali di perle e metanolo.Quindi aggiungere 10 volumi di acido trifluoroacetico (TFA), aggiungere otto microlitri di perle porose a ogni campione e agitare per 15 minuti a temperatura ambiente. Nel frattempo, condizionare due zip tip C18. Pipettare due volte con 20 microlitri di TFA 0,1%, quattro volte con acetonitrile 70% in TFA 0,1% e nuovamente quattro volte con TFA 0,1%.Successivamente, caricare i due campioni sui puntali zip condizionati. Con una pipetta, spingere il volume attraverso la resina C 18. Ripetere fino a quando l'intero volume di entrambi i campioni è stato fatto passare attraverso i puntali zip.Quindi lavare le punte a zip due volte con 20 microlitri di TFA 0,1%, eluire i campioni in 40 microlitri di buffer illusione e procedere all'essiccazione completa mediante un concentratore a vuoto. Per prima cosa risospendere il campione in 100 microlitri di buffer fosfato 50 millimolare a pH 7,4. Quindi aggiungere otto microlitri di dimetilammina borica e 16 microlitri di formaldeide deradata.Incubare a quattro gradi Celsius per due ore. Ripetere la metilazione riduttiva aggiungendo dimetilammina normale e formaldeide deuterata e incubare per due ore. La terza volta, aggiungere dimetilammina normale e incubare a quattro gradi Celsius per 15 ore.Terminare la reazione aggiungendo 12,5 microlitri di tris uno molare, pH 7,4, quindi portare a completo essiccamento con un concentratore a vuoto. Per prima cosa, risospendere i campioni di controllo e quelli della reazione con la desmetilasi in 100 microlitri di tampone fosfato 50 millimolare, pH 7,4.Ora aggiungere otto microlitri di perle porose ai campioni di controllo e alle reazioni della demetilasi e raccoglierli su zip tip come mostrato in precedenza. Eluire in volumi di due microlitri su una piastra campione per MALDI e lasciare essiccare a temperatura ambiente fino alla cristallizzazione. Procedere con l'analisi dei campioni mediante spettrometria di massa.Aprire i file spettro nel software di elaborazione ed esportarli nel software M su Z. Verificare ulteriormente i prodotti della reazione mediante spettrometria di massa in tandem. Innanzitutto, determinare il rapporto tra l'area dei picchi degli isotopi carbonio 13 C due e carbonio 13 C quattro rispetto al picco mono-isotopico per il campione di controllo.Utilizzare questi rapporti calcolati per quantificare la quantità relativa di peptide presente in ciascuna modificazione. Stato del campione della reazione di desmetilazione. L'enzima LSD1 può essere efficacemente utilizzato nella quantificazione tramite spettrometria di massa della desmetilazione della lisina.Poiché la reazione di controllo non subisce metilazione riduttiva, indica l'abituale profilo isotopico per questo peptide. Le aree dei picchi risultanti determinano i rapporti di fondo del peptide esistente in carbonio 13 C due e carbonio 13 C quattro. Gli stati isotopici, insieme alle aree dei picchi dello spettro di massa della reazione di controllo, permettono la quantificazione della quantità relativa di peptide presente in ciascuno stato di modificazione. Nella reazione della demetilasi, le aree dei picchi di queste reazioni di controllo e della reazione della demetilasi indicano il 33,7% di lisina 4 dimetilata, il 42,0% di lisina 4 monometilata e il 24% di lisina 4 non metilata.Questo approccio di massa su squame offre spunti fondamentali nel campo dell'epigenetica degli istoni, ad esempio su come la demetilazione dei residui di lisina negli istoni contribuisca a diverse malattie. Sebbene questo saggio di metilazione sia stato applicato per lo studio delle demetilasi, può essere utilizzato anche per lo studio delle metiltransferasi.

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Biologia

L'attività della decarbossilasi inducibile lisina è monitorato facendo reagire il substrato L-lisina e il prodotto cadaverina con 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acido per formare addotti che hanno solubilità differenziale in toluene.

Un test per misurare l&#39;attività di Escherichia coli Inducibile Lisina Decarboxyase

Vengono descritti due metodi per assegnare i segnali di risonanza magnetica nucleare α- e ε-dimetilammina di una lisina N-terminale riduttivamente metilata 13C. Un metodo utilizza la selettività indotta dal pH della reazione di metilazione riduttiva e l'altro utilizza l'aminopeptidasi per rimuovere selettivamente la lisina N-terminale.

Metodi per identificare le risonanze NMR dell'ammina 13C-dimetil N-terminale su proteine metilate riduttivamente

Combinando nativa e reticolazione cromatina immunoprecipitazione con alta risoluzione di Spettrometria di Massa, l'approccio ChroP permette di sezionare il composito dell'architettura proteomica delle modificazioni degli istoni, le varianti e le proteine ​​non istoniche Synergizing a domini di cromatina funzionalmente distinte.

L&#39;approccio ChroP Combina ChIP e Spettrometria di Massa a sezionare Locus-specifiche proteomica Paesaggi della cromatina

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Viene presentato un protocollo per sintetizzare peptoidi con funzionalità cationica mista nella stessa sequenza (monomeri di tipo lisina e arginina). Viene anche descritto il successivo test di questi composti contro la Leishmania mexicana, i protozoi parassiti che causano la leishmaniosi cutanea.

Un metodo efficiente per la sintesi di peptoids con monomeri misto Lisina-tipo / Arginina-tipo e valutazione della loro attività anti-Leishmania

Qui, presentiamo imparziale quantificazione di occupazione acetilazione e/o succinylation site-specific protein (stechiometria) di un intero proteoma attraverso un'analisi raziometrici endogeno modifiche modifiche introdotte dopo quantitativa Acilazione chimica utilizzando anidridi con etichetta isotopo stabile. In combinazione con spettrometria di massa sensibile acquisizione dati-indipendente, sito accurata occupazione misurazioni sono ottenute.

Quantificazione di site-specific Protein lisina acetilazione e stechiometria Succinylation usando la spettrometria totale di acquisizione dati-indipendente

Qui, presentiamo un protocollo per misurare kDM1A target engagement in una cellula umana o animale, tessuto o campioni di sangue trattati con inibitori KDM1A. Il protocollo utilizza l'etichettatura chemioprobe dell'enzima KDM1A gratuito e la quantificazione diretta dell'occupazione target utilizzando immunoasisti basati sulla chemiospa e può essere utilizzato in studi preclinici e clinici.

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Questi protocolli forniscono la metodologia utilizzata per valutare l'attività enzimatica dei singoli membri della proteina arginina metiltransferasi (PRMT) nelle cellule. Vengono descritte linee guida dettagliate sulla valutazione dell'attività delle PRMT utilizzando biomarcatori endogeni ed esogeni, anticorpi di riconoscimento metil-arginina e composti degli utensili inibitori.

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Questo studio ha stabilito un metodo che utilizza l'espansione del codice genetico per incorporare con successo la lattil-lisina (Klac) in siti specifici dell'enolasi-1 umana (hENO1) e della GFP superfolder (sfGFP) in Escherichia coli e cellule di mammiferi.

Lattilazione della lisina specifica per sito tramite espansione del codice genetico in E. coli e nelle cellule di mammiferi

Scopri come quantificare l'attività delle demetilasi lisina con spettrometria di massa MALDI e marcatura isotopica. Questo metodo permette di misurare con precisione i cambiamenti nei livelli di metilazione lisina.

Applicazione di MassSQUIRM per le misure quantitative delle attività demetilasi lisina

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