Name: Microscopia intravitale della Milza: analisi quantitativa della mobilità Parasite e del flusso sanguigno (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 36 s
Description: Scopri la microscopia intravitale quantitativa per analizzare la mobilità dei parassiti della malaria e il flusso sanguigno nella milza utilizzando parassiti transgenici GFP in modelli murini.

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Siamo particolarmente grati a S. Graewe e V. Heussler per la formazione iniziale e continua di ingresso in microscopia intravitale di parassiti della malaria, a J. Burns per la donazione GFP parassiti transgenici, ad A. Bosch (Unità confocale, CCIT-UB, IDIBAPS) per l&#39;assistenza in analisi di immagini e quantificazione e di P. Astola per assistenza tecnica. Ringraziamo Tous R. e Caralt I. per la produzione video. MF è un destinatario di una borsa di studio laureati dal Generalità della Catalogna. HAP è un professore di ricerca ICREA. Il lavoro nel laboratorio di HAP è finanziato dal Settimo programma quadro della Comunità europea (FP7/2007-2013) sotto della convenzione di sovvenzione n. 242095, dalla Fondazione Privata CELLEX (Catalogna, Spagna), e dal Ministero spagnolo della Scienza e dell&#39;Innovazione ( SAF2009-07760).

<ol><li>Amino, R., Menard, R., Frischknecht, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+malaria+parasites--recent+advances+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of malaria parasites--recent advances and future directions.</a> Curr. Opin. Microbiol. 8, 407-414 (2005).</li>
<li>Heussler, V., Doerig, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+enters+parasitology%5BTitle%5D)+AND+%22Trends.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging enters parasitology.</a> Trends. Parasitol. 22, 192-195 (2006).</li>
<li>Amino, R., Thiberge, S., Blazquez, S., Baldacci, P., Renaud, O., Shorte, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+malaria+sporozoites%5BTitle%5D)+AND+%22in+the+dermis+of+the+mammalian%22%5BJournal%5D)">Imaging malaria sporozoites.</a> in the dermis of the mammalian. 2, 1705-1712 (2007).</li>
<li>Gueirard, P., Tavares, J., Thiberge, S., Bernex, F., Ishino, T., Milon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+malaria+parasite+in+the+skin+of+the+mammalian+host%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Development of the malaria parasite in the skin of the mammalian host.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 18640-18645 (2010).</li>
<li>Sturm, A., Amino, R., van de Sand, C., Regen, T., Retzlaff, S., Rennenberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulation+of+host+hepatocytes+by+the+malaria+parasite+for+delivery+into+liver+sinusoids%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Manipulation of host hepatocytes by the malaria parasite for delivery into liver sinusoids.</a> Science. 313, 1287-1290 (2006).</li>
<li>Gruring, C., Heiber, A., Kruse, F., Ungefehr, J., Gilberger, T. W., Spielmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+host+cell+modifications+of+Plasmodium+falciparum+blood+stages+in+four+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Development and host cell modifications of Plasmodium falciparum blood stages in four dimensions.</a> Nat. Commun. 2, 165-165 (2011).</li>
<li>Martin-Jaular, L., Ferrer, M., Calvo, M., Rosanas-Urgell, A., Kalko, S., Graewe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strain-specific+spleen+remodelling+in+Plasmodium+yoelii+infections+in+Balb%2Fc+mice+facilitates+adherence+and+spleen+macrophage-clearance+escape%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Strain-specific spleen remodelling in Plasmodium yoelii infections in Balb/c mice facilitates adherence and spleen macrophage-clearance escape.</a> Cell. Microbiol. 13, 109-122 (2011).</li>
<li>Linden, M. vander, R, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Plasmodium+berghei+reference+line+that+constitutively+expresses+GFP+at+a+high+level+throughout+the+complete+life+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biochem.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">A Plasmodium berghei reference line that constitutively expresses GFP at a high level throughout the complete life cycle.</a> Mol. Biochem. Parasitol. 137, 23-33 (2004).</li>
<li>Cormack, B. P., Valdivia, R. H., Falkow, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FACS-optimized+mutants+of+the+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein.</a> 173, 33-38 (1996).</li>
<li>Dunn, K. W., Sandoval, R. M., Kelly, K. J., Dagher, P. C., Tanner, G. A., Atkinson, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+studies+of+the+kidney+of+living+animals+using+multicolor+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Functional studies of the kidney of living animals using multicolor two-photon microscopy.</a> Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 283, C905-C916 (2002).</li>
<li>Zhong, Z., Petrig, B. L., Qi, X., Burns, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+measurement+of+erythrocyte+velocity+and+retinal+blood+flow+using+adaptive+optics+scanning+laser+ophthalmoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Express%22%5BJournal%5D)">In vivo measurement of erythrocyte velocity and retinal blood flow using adaptive optics scanning laser ophthalmoscopy.</a> Opt. Express. 16, 12746-12756 (2008).</li>
<li>Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+lymphocyte+motility+and+antigen+response+in+intact+lymph+node%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node.</a> Science. 296, 1869-1873 (2002).</li>
<li>Bowdler, A. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBowdler%2C+AJ+%22The+complete+spleen%22">The complete spleen</a>. , Totowa. Humana Press. (2002).</li>
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<li>Khandoga, A. G., Khandoga, A., Reichel, C. A., Bihari, P., Rehberg, M., Krombach, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+and+quantitative+analysis+of+leukocyte+directional+migration+and+polarization+in+inflamed+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS.+One%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging and quantitative analysis of leukocyte directional migration and polarization in inflamed tissue.</a> PLoS. One. 4, 4693-4693 (2009).</li>
<li>Weiss, L., Geduldig, U., Weidanz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+splenic+control+of+murine+malaria%3A+reticular+cell+activation+and+the+development+of+a+blood-spleen+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Anat%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of splenic control of murine malaria: reticular cell activation and the development of a blood-spleen barrier.</a> Am. J. Anat. 176, 251-285 (1986).</li>
<li>Swirski, F. K., Nahrendorf, M., Etzrodt, M., Wildgruber, M., Cortez-Retamozo, V., Panizzi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+splenic+reservoir+monocytes+and+their+deployment+to+inflammatory+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification of splenic reservoir monocytes and their deployment to inflammatory sites.</a> Science. 325, 612-616 (2009).</li>
<li>Grayson, M. H., Chaplin, D. D., Karl, I. E., Hotchkiss, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confocal+fluorescent+intravital+microscopy+of+the+murine+spleen%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Confocal fluorescent intravital microscopy of the murine spleen.</a> J. Immunol. Methods. 256, 55-63 (2001).</li>
<li>Bajenoff, M., Glaichenhaus, N., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblastic+reticular+cells+guide+T+lymphocyte+entry+into+and+migration+within+the+splenic+T+cell+zone%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Fibroblastic reticular cells guide T lymphocyte entry into and migration within the splenic T cell zone.</a> J. Immunol. 181, 3947-3954 (2008).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

L&#39;attuazione di microscopia intravitale della milza in questo modello la malaria roditore ha aperto la possibilità di indagare il passaggio dinamica dei parassiti attraverso questo organo che fino ad ora è stato considerato un &quot;black-box&quot; a causa di considerazioni tecniche. Qui, un grande sforzo è stato messo per adattare un metodo quantitativo che permette l&#39;analisi comparativa delle diverse linee di parassiti a livello singolo e della popolazione. A differenza di altri tessuti e cellule, che era stat...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> Leica TCS-SP5 microscopio confocale </td><td> Leica Microsystems, Heidelberg, Germania </td><td> TCS-SP5 non seriale. 5100000419 </td><td></td></tr><tr><td> Ketamina (Ketolar 50 mg / ml) </td><td> Pfizer </td><td> 631028 </td><td></td></tr><tr><td> Midazolam 15 mg / 3 ml </td><td> Normon </td><td> 838193 </td><td></td></tr><tr><td> 70.000 MW Destrano, coniugato con Texas Red </td><td> Molecular Probes </td><td> D1830 </td><td></td></tr><tr><td> Fluoresceina isotiocianato, isomero I (CIC) </td><td> Sigma </td><td> F7250 </td><td></td></tr><tr><td> Hoechst 33342 </td><td> Sigma </td><td> H1399 </td><td></td></tr><tr><td> Giemsa </td><td> Sigma </td><td> GS1 </td><td> Soluzione di lavoro è al 10% in acqua distillata </td></tr><tr><td> Super Glue Loctite-3 </td><td> Loctite </td><td> 9975-0880 </td><td></td></tr></tbody></table>

microscopia intravitale della milza: analisi quantitativa della mobilità parasite e del flusso sanguigno

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

L&#39;avvento della microscopia intravitale in modelli sperimentali malaria roditore ha permesso importanti progressi alla conoscenza del parassita-ospite 1,2 interazioni. Così, in imaging in vivo di parassiti della malaria durante la pre-eritrocitaria fasi hanno portato alla luce l&#39;ingresso attivo di parassiti nei linfonodi pelle 3, il completo sviluppo del parassita nella pelle 4, e la formazione di un derivato degli epatociti merosome per assicurare la migrazione e rilascio di merozoiti nel flusso sanguigno 5. Inoltre, lo sviluppo di parassiti singoli negli eritrociti è stata recentemente documentata mediante imaging 4D e ha sfidato la nostra visione attuale in materia di esportazione delle proteine ​​della malaria 6. Così, l&#39;imaging intravitale ha radicalmente cambiato la nostra visione sugli eventi chiave nello sviluppo Plasmodium. Purtroppo, gli studi del passaggio dinamico di parassiti della malaria attraverso la milza, un organo importante linfoide squisitamente adattate per cancellare infetti rosso blood cellule sono carenti a causa di vincoli tecnici. Utilizzando il modello murino della malaria da Plasmodium yoelii in topi BALB / c, abbiamo implementato l&#39;imaging intravitale della milza e ha riportato un rimodellamento differenziale di essa e l&#39;aderenza dei globuli rossi parassitati (pRBCs) alle cellule barriera di origine fibroblastica nella polpa rosso durante infezione con il non-letale parassita linea P.yoelii 17X rispetto alle infezioni con la linea 17XL P.yoelii letale parassita 7. Per arrivare a queste conclusioni, una metodologia specifica con ImageJ software libero è stato sviluppato per consentire la caratterizzazione del veloce movimento tridimensionale del singolo pRBCs. I risultati ottenuti con questo protocollo consentono di determinare il tempo della velocità, direzionalità e di soggiorno dei parassiti nella milza, tutti i parametri di indirizzamento aderenza in vivo. Inoltre, riportiamo la metodologia per quantificare il flusso di sangue al microscopio intravitale e l&#39;uso di DIFferent coloranti al fine di conoscere la struttura complessa del microcircolo della milza. Dichiarazione etica Tutti gli studi su animali sono stati effettuati presso le strutture animale dell&#39;Università di Barcellona, ​​in conformità alle linee guida e protocolli approvati dal Comitato Etico per la Sperimentazione Animale dell&#39;Università di Barcellona CEEA-UB (protocollo n. DMAH: 5429). Femmina Balb / c topi di 6-8 settimane di età sono stati ottenuti da Charles River Laboratories.

Mostriamo il metodo per l&#39;esecuzione di microscopia intravitale della milza con GFP parassiti della malaria transgenici e la quantificazione della mobilità parassita e del flusso sanguigno all&#39;interno di questo organo.

Microscopia intravitale della Milza: analisi quantitativa della mobilità Parasite e del flusso sanguigno

L'avvento della microscopia intravitale nei modelli sperimentali di malaria nei roditori ha permesso importanti progressi nella conoscenza delle interazioni parassita-ospite 1,2. ...

In questa procedura, mostriamo un approccio di microscopia intravitale quantitativa per valutare la dinamica del passaggio del parassita attraverso la milza. In un modello di malaria su roditore, topi infettati con parassiti transgenici GFP vengono preparati per la microscopia intravitale; la cannullatura della vena splenica permetterà l'iniezione di coloranti intravitali. Durante l'esperimento, le cellule fluorescenti vengono osservate mentre si muovono in diverse aree della milza.Forniamo la metodologia per descrivere la mobilità del parassita nel compartimento lento tridimensionale della polpa rossa e per calcolare il flusso sanguigno nei vasi. Questi parametri sono stati utilizzati per confrontare la dinamica splenica di due ceppi PULE. Ciao a tutti.Il mio nome è Nando El Portillo e una delle principali domande di ricerca nel mio laboratorio è cercare di comprendere il ruolo della milza nella malaria. La splenomegalia è uno dei segni caratteristici di questa malattia, ma a causa di problemi tecnici ed etici, condurre studi su questo organo è molto difficile. Per riuscirci, abbiamo sviluppato tecnologie che ci permettono di osservare il passaggio dinamico di questo parassita e d

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Gli invade parassita della malaria e replicati all'interno delle cellule rosse del sangue. La valutazione accurata di invasione merozoite e parassitemia è quindi fondamentale per la valutazione nel corso di infezione malarica. Qui si descrive un protocollo basato citometria a flusso per la misurazione di questi parametri in un modello murino di malaria.

In Vivo Valutazione del roditore Plasmodium parassitemia e merozoite Invasion di Citometria a flusso

Questa applicazione semplificata della microscopia intravitale delle vene mesenterarie nei topi può essere utilizzata in diversi modelli di infiammazione per osservare le interazioni leucociti-endoteliali e piastrine-leucociti.

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Descriviamo un modello murino di malaria cerebrale sperimentale e mostriamo come la patologia infiammatoria e microvascolare possa essere monitorata in vivo utilizzando la risonanza magnetica.

Tracciamento in vivo di sviluppo dell&#39;edema e patologia microvascolare in un modello di malaria cerebrale sperimentale mediante l&#39;utilizzo di immagini a risonanza magnetica

A causa delle sorprendenti somiglianze del ciclo di vita e della biologia dei parassiti della malaria dei roditori con i parassiti della malaria umana, i modelli di malaria dei roditori sono diventati indispensabili per la ricerca sulla malaria. Qui, abbiamo standardizzato alcune delle tecniche più importanti utilizzate nell'analisi fenotipica di specie di malaria roditore selvatico e transgenico.

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Tutte le specie di Leishmania patogene risiedono e replicano all'interno dei macrofagi dei loro ospiti vertebrati. Qui, presentiamo un protocollo per infettare i macrofagi murini derivate da midollo osseo nella cultura con Leishmania, seguita da quantificazione precisa della cinetica di crescita intracellulare. Questo metodo è utile per lo studio di singoli fattori che influenzano l'interazione ospite-patogeno e la virulenza di Leishmania .

Quantificazione della crescita intracellulare all'interno di macrofagi è un veloce e affidabile metodo per valutare la virulenza dei parassiti di Leishmania

Scopri la microscopia intravitale quantitativa per analizzare la mobilità dei parassiti della malaria e il flusso sanguigno nella milza utilizzando parassiti transgenici GFP in modelli murini.

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