Microscopia intravitale della Milza: analisi quantitativa della mobilità Parasite e del flusso sanguigno

In questa procedura, mostriamo un approccio di microscopia intravitale quantitativa per valutare la dinamica del passaggio del parassita attraverso la milza. In un modello di malaria nei roditori, i topi infettati da parassiti transgenici GFP vengono preparati per la microscopia intravitale della vena della milza. Durante l'esperimento, le cellule fluorescenti si muovono in diverse aree della milza.

Forniamo la mitologia per descrivere la mobilità dei parassiti nel compartimento lento tridimensionale della polpa rossa e calcoliamo il flusso sanguigno dei vasi. Questi parametri sono stati utilizzati per confrontare la dinamica della milza di due ceppi POLE. Ciao a tutti.

Mi chiamo Nando El Portillo e una delle principali domande di ricerca nel mio laboratorio è cercare di capire il ruolo della milza nella malaria. La Splenomegalia è uno dei punti di riferimento di questa malattia, ma a causa di questioni tecniche ed etiche cercare di affrontare gli studi di questo organo è molto difficile. Per fare ciò, abbiamo abilitato tecnologie che ci permettono di vedere il passaggio dinamico di questo parassita e quantificare questo fenomeno.

Questo è ciò che Lorena e MI spiegheranno in questi protocolli. Questa ricerca è in parte condotta in collaborazione con i gruppi del Dr.Ler dell'Università di Amburgo in Germania e la Dr.Maria Kbo qui alla clinica ospedaliera e ha ricevuto il finanziamento generale del fion trovato Cellex e della CIA ministeriale In Español l'infezione è iniziata dal donatore M infettato da parassiti GFP letali o non letali al 10% di parassita. Per controllare il parassita, prelevare una piccola goccia di sangue dalla vena della coda del topo ed estenderla al microscopio.

Far scorrere una colorazione metrica chole con i GIM. Una soluzione consentirà la visualizzazione dei globuli rossi infetti una volta essiccati, fissare lo striscio di sangue con metanolo per due minuti, applicare una soluzione GIM e incubare per 20 minuti. Lavare il vetrino con acqua di rubinetto corrente e asciugare enumerando la percentuale di pbcs sul totale dei globuli rossi utilizzando un microscopio ottico con cento volte l'olio. Obiettivo.

Infettare i topi con parassiti letali o non letali ottenuti dal sangue della coda di topi donatori diluito in PBS. Regolare la dose per iniettare mezzo milione di parassiti per topo al fine di raggiungere un parassita periferico dell'1% al terzo giorno dopo l'infezione e iniettare Intraperitoneal. In alternativa, i globuli rossi marcati FITC possono essere utilizzati nel controllo.

Gli animali raccolgono un millilitro di sangue arterioso da un topo e lavano il pellet mediante centrifugazione in PBS contenente EDTA re span in soluzione FITC e incubano per due ore al buio con leggera agitazione. Trascorso questo tempo, rimuovere il surnatante mediante centrifugazione e lavare accuratamente. Iniettare in un topo di controllo in media dell'1% nella circolazione periferica e procedere con esperimenti in vivo.

Ciao, sono mija. Per visualizzare la milza in vivo, dobbiamo eseguire una piccola sinergia dell'animale per esporre la milza su una tecnica ovviamente di questa tecnica. L'ho imparato da Stephanie GR nel laboratorio dell'operaio Heisler, a cui vorrei ringraziare e ora vi mostrerò come procedere.

Imaging della miosi infetta Eseguito al terzo giorno dopo l'infezione, quando il parat è dell'1% in entrambi i ceppi. Mantenere il topo anestetizzato e a temperatura regolata durante tutta la procedura. Proteggere gli occhi dall'idratazione e verificare che il mouse sia completamente anestetizzato eseguendo un ping sul cuscinetto del piede prima di procedere in modo da facilitare la somministrazione endovenosa di sostanze.

Durante il corso dell'esperimento, incannulare la vena della coda del topo per costruire la cannula. Inserire un piccolo ago in un'estremità di un tubo e il suo applicatore nell'altra. Caricare la cannula con soluzione fisiologica per rimuovere le bolle e verificare che la soluzione scorra correttamente attraverso la cannula.

La vena laterale della coda sarà incannulata in modo pulito. Migliora la sua visibilità facendo una leggera costrizione alla base della coda. Introdurre la punta della cannula all'interno della vena.

La comparsa di sangue indicherà che l'ago è ben posizionato. In caso contrario, ripetere l'incannulamento a monte della vena, quindi fissare la cannula alla coda utilizzando colla e nastro adesivo. Esporre la parte inferiore della milza attraverso una piccola incisione nella pelle e nella muscolatura sul lato dorsale sinistro dell'animale.

Posizionare una milza dove si osserva meno movimento del respiro e applicare PBS sulla superficie esposta per mantenerla pulita dai peli del topo e idratata. Sigillare la milza con una copertura per consentire la visualizzazione. Ciao, mi chiamo Lorena.

Il protocollo mostrato ci permetterà di visualizzare il movimento dei parassiti PULI attraverso la milza. Questo è stato possibile grazie ai parassiti transgenici GFP. Si prega di donare James Burnes della Drexel University.

L'imaging del movimento dei parassiti fluorescenti ci permetterà di sapere se ci sono differenze nel comportamento tra ceppi letali e non letali. Gli esperimenti di microscopia Vidal sono stati condotti in un microscopio multifotone Leica, dotato di un sistema di incubazione con controllo della temperatura e di un obiettivo 63 x glicerolo. Posizionare l'animale sul tavolino del microscopio con una milza notturna rivolta verso l'obiettivo. Inizialmente.

La visualizzazione della milza a ingrandimenti più bassi fornirà una visione generale della struttura microcircolatoria dell'organo. Focalizzare la milza utilizzando tessuti autofluorescenti, si osservano parassiti GFP che passano attraverso le diverse aree della milza. Ciao, mi chiamo Maria Albo dei Centri Scientifici e Tecnologici dell'Università di Barcellona e faremo l'imaging intravitale della milza.

Per studiare il flusso sanguigno e la mobilità dei globuli rossi infetti, utilizzeremo un microscopio confocale dotato di una scansione risonante che consente l'imaging ad alta velocità, molto utile per evitare il movimento dell'organo. Si tratta di un microscopio spettrale che permette di selezionare il campo visivo. Per ottenere immagini molto veloci, eseguiremo l'acquisizione simultanea delle due fluoresceine, marcature e riflessione.

Seleziona diverse zone da visualizzare con l'aiuto di globuli rossi, riflessione, contrasto e coloranti Vidal per evidenziare la microvascolarizzazione della milza. Spiegheremo ora come misurare la mobilità dei parassiti nel flusso sanguigno dei vasi sanguigni utilizzando la microscopia Vidal e il software di immagine J per seguire il movimento dei parassiti nella rete tridimensionale della polpa rossa. Acquisisci immagini attraverso cinque profondità Z utilizzando una modalità di scansione ad alta velocità.

Converti le pile di immagini in filmati a colori con codifica Z per facilitare il tracciamento di una singola cella fluorescente. Informazioni dettagliate fornite nel testo: traccia le diverse particelle nel tempo su Profondità su ciascun video utilizzando le coordinate X, Y, Z e T, i parametri di mobilità come la direzionalità, la velocità media e il tempo di residenza possono essere calcolati e rappresentati come mappe di distribuzione per consentire l'analisi comparativa tra le popolazioni di ceppi. Il flusso vascolare nella milza può essere visualizzato mediante iniezione sistemica di diverse molecole fluorescenti descritte nella tabella di supporto come la destrina.

E utilizzando la scansione endogena del contrasto di riflessione eritrocitaria, il flusso sanguigno della linea centrale impostando i vasi orizzontalmente nella direzione della scansione laser e utilizzando la media della linea migliorata. In queste immagini, le strisce risultanti dalle cellule in movimento verranno utilizzate per calcolare il flusso sanguigno, scattare immagini di vasi con diametri diversi e durante il ciclo cardiaco per compensare le fluttuazioni. La milza è stata a lungo considerata una scatola nera nella ricerca sulla malaria e qui abbiamo sviluppato un approccio di microscopia intravitale quantitativa per ottenere informazioni sulle dinamiche dell'infezione parassitaria e del flusso sanguigno in questo organo, permettendoci di affrontare importanti questioni biologiche come l'aderenza in vivo dei globuli rossi infetti alla milza.

Grazie e.