Costruire un idrogel collagene per la fornitura di Stem Cell-loaded Chitosan Microsfere

Questo protocollo offre una strategia in vitro per fornire cellule staminali da microsfere di chitosano in un'impalcatura di gel di collagene, raccolta e coltura. Le cellule staminali degli adipociti primari si emulsionano e recuperano un preparato di microsfere di chitosano. Successivamente, seminare le cellule staminali sulle microsfere di chitosano e coltivarle in un inserto di coltura a membrana di otto micron di poro per produrre un CSM caricato con CS, infine mescolare il sistema di consegna della microsfera con un'impalcatura tridimensionale in gel di collagene.

In definitiva, questo sistema CSM offre un potenziale per l'uso nella medicina rigenerativa e nella somministrazione di farmaci. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come l'iniezione cellulare o la microincapsulazione, è la capacità delle cellule di attaccarsi a un materiale di supporto e persistere dopo l'applicazione iniziale. In generale, gli individui che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché le microsfere di esan hanno una carica statica intrinseca.

E caricare le cellule su un letto di microsfere sarà impegnativo senza disturbarle. Asciugare e lavare il tessuto adiposo perineale ed epidermico da un involucro, tritare il tessuto, quindi trasferire da uno a due grammi in 25 millilitri di HBSS contenente l'1% di FBS. Dopo la centrifugazione, raccogliere lo strato di tessuto adiposo libero in un pallone di Erlenmeyer da 125 millilitri.

Aggiungere 25 millilitri di collagenasi di tipo due e incubare la reazione su un agitatore orbitale. A questo punto rimuovete con cura la frazione liquida sottostante lo strato di olio e adiposo e filtrate in sequenza attraverso filtri a rete di nylon da 170 micron. Raccogliere le cellule per centrifugazione dopo due lavaggi con 25 millilitri.

HBSS Resus, sospendere il pellet in 30 millilitri di terreno di coltura mesen pro integrato. Dividere le cellule staminali di derivazione adiposa purificata in due fiasche di coltura T 75 e amplificare la preparazione A SC in un incubatore umidificato con anidride carbonica al 5% a 37 gradi Celsius. Questo protocollo CSM è un processo di emulsionazione dell'acqua in olio che utilizza una tecnica di coer ionico.

Emulsionare sei millilitri di una soluzione acquosa di chitosano in 100 millilitri di una miscela in fase oleosa utilizzando l'agitazione dall'alto e magnetica contemporaneamente in direzioni opposte per un'ora all'emulsione stabile di acqua e olio, aggiungere 1,5 millilitri di idrossido di potassio all'1% in n ottale ogni 15 minuti per quattro ore. Dopo il completamento della reazione di reticolazione ionica, decantare lentamente la fase oleosa e aggiungere immediatamente le sfere a 100 millilitri di acetone. Lavare le sfere con acetone fino a quando la fase oleosa non sarà completamente rimolta.

Quindi asciugare le sfere recuperate sottovuoto. L'essiccazione determina la superficie media delle particelle CSM per milligrammo e il volume cubico unitario utilizzando l'analizzatore granulometrico. Procedere al lavaggio del CSM tre volte con acqua sterile per rimuovere i sali residui.

Ora sterilizzare la preparazione CSM con alcol assoluto per l'uso negli esperimenti cellulari in una provetta di vetro da 50 millilitri, mescolare cinque milligrammi di microsfere con un millilitro di soluzione di TNBS allo 0,5% e incubare per quattro ore a 40 gradi Celsius. Quindi aggiungere tre millilitri di acido cloridrico normale e incubare a 60 gradi Celsius per due ore. Dopo aver raffreddato i campioni a temperatura ambiente, aggiungere cinque millilitri di acqua deionizzata e 10 millilitri di etere Ethel.

Per estrarre il TNBS libero, rimuovere un'aliquota di cinque millilitri della fase acquosa e scaldare a 40 gradi Celsius in un bagno d'acqua per 15 minuti per far evaporare l'etere residuo dopo il raffreddamento a temperatura ambiente. Diluire con 15 millilitri di acqua con uno spettrofotometro. Misurare l'assorbanza delle microsfere di chitosano preparate a 345 nanometri utilizzando TNBS come bianco.

Misurare anche il chitosano utilizzato per la preparazione del CSM. Ora, calcola il numero di gruppi amminici liberi del CSM rispetto al numero totale di gruppi amminici nel chitosano. Equilibrare cinque milligrammi di CSM sterilizzato in HBSS sterile durante la notte.

Trasferire il CSM in un inserto a membrana da otto micron per piastre di coltura a 24 pozzetti. Dopo che il CSM si è stabilizzato, aspirare con cura l'HBSS. Ora aggiungi 300 microlitri di terreno di coltura all'interno dell'inserto e 700 microlitri di terreno di coltura all'esterno dell'inserto. Resus.

Sospendi le cellule staminali derivate dal tessuto adiposo in 200 microlitri di crescita, terreno e seme sopra il CSM all'interno della piastra di coltura. Inserire, incubare per 24 ore in un incubatore umidificato al 5% di anidride carbonica a 37 gradi Celsius. Trasferire il CSM caricato con SC in una provetta sterile per microcentrifuga senza disturbare le cellule che sono migrate nella membrana dell'inserto.

Ora rimuovi il terreno residuo e aggiungi 250 microlitri di terreno di crescita fresco in ogni tubo. Aggiungere 25 microlitri di soluzione MTT da cinque milligrammi per millilitro e incubare per quattro ore. Rimuovere il terreno e aggiungere 250 microlitri di vortice di ossido di dimetilsulfo per solubilizzare la forma come centrifuga complessa, il CSM a 2, 700 G per cinque minuti.

Misurare l'assorbanza del surnatante a 570 nanometri utilizzando 630 nanometri come riferimento. Procedere a determinare il numero di cellule associato al CSM rispetto al valore di assorbanza ottenuto da numeri noti di A SC vitale. Mescolare cinque milligrammi di un CSM caricato SC con 7,5 milligrammi per millilitro. Collagene di tipo uno estratto dal ratto.

Tendine della coda, regolare il pH a 6,8 utilizzando due normali idrossido di sodio e versare in una piastra di coltura. Inserire per fibrillare, trasferire ora in una piastra a 12 pozzetti e incubare per 30 minuti. Continuare a rinfrescare il terreno per i gel di collagene A-S-C-C-S-M a giorni alterni del periodo di incubazione.

Inoltre, monitora, rilascia e migra le cellule dal CSM al gel utilizzando tecniche di microscopia standard. Questo esempio seguente descrive la strategia in vitro per fornire cellule staminali derivate dal grasso da microsfere di chitosano in un'impalcatura di gel di collagene. Le immagini SEM e TEM indicano una preparazione di CSM poroso di dimensioni uniformi.

L'incubazione delle microsfere con cellule staminali primarie di derivazione adiposa indica 4.000 cellule per milligrammo di CSM calcium am. La colorazione di una SC mostra una diffusione sul CSM con l'estensione dei filopodi nelle fessure porose della microsfera. Quando il CSM caricato con le cellule è stato mescolato con il gel di collagene, le cellule migrano nel gel e possono essere seguite nel tempo.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono immediatamente verso la terapia della perdita di tessuto massiva e cronica. Tuttavia, questo regime di trattamento ha molto più potenziale grazie alla sua versatilità nell'integrarsi con una varietà di cellule e/o biomateriali utilizzati per trattare diversi livelli di perdite di tessuti molli e cardiaci. Dubito che questo metodo possa fornire informazioni sulla consegna della cellula ospite.

Può anche essere applicato ad altri sistemi come iniettabili, somministrazione di farmaci terapeutici, sviluppo di sistemi ibridi per fornire sia cellule che farmaci terapeutici insieme.