Schermi throughput elevato e basso con Nematodi galligeni Meloidogyne spp.

L'obiettivo generale di questa procedura è lo screening di piante infestate da nematodi galligeni. Per prima cosa, coltivare piantine sane in terreno sabbioso o in buste per la crescita. Successivamente, produrre un inocolo costituito da giovani in stadio secondario fortemente infetti di nematodi galligeni.

Quindi inoculare e infettare correttamente le piantine. Valutare infine lo sviluppo delle masse di uova di nematodi sul sistema radicale dell'ospite. Dimostreremo schermate ad alta e bassa produttività di piante con radici, non di nematodi.

E i principali vantaggi del sistema ad alta capacità sono la limitata superficie necessaria per la crescita delle piante e la facilità di valutazione dell'infezione. Questi approcci permetteranno quindi di ottenere un'infezione riproducibile e uniforme, nonché un'infezione delle radici delle piante da parte dei nematodi, consentendo così una migliore valutazione dello stato di ospite della pianta. In generale, chi si approccia per la prima volta alla valutazione delle piante con nematodi radicali potrebbe incontrare difficoltà a causa dell'utilizzo di uno stadio di sviluppo non appropriato per infettare le radici con i nematodi.

E inoltre utilizzando giovani stadi infettivi di diversi giorni, che tipicamente hanno una bassa infettività. Il procedimento sarà dimostrato da Hug Up Atian, studente laureando. Nel mio laboratorio, mostrerò il procedimento per lo screening nelle buste di crescita per saggi in vaso. Piantare semi di pomodoro in un singolo vaso riempito con terreno ricco di sostanza organica, come il Sunshine Mix, mantenendo la serra a una temperatura compresa tra 22 e 28 gradi Celsius dopo la germinazione.

Annaffiare una volta alla settimana con Miracle Grow circa due settimane dopo la germinazione, al momento del trapianto delle singole piantine in vasi contenenti terreno sabbioso sterile, composto da 90% di sabbia e 10% di materia organica. Aggiungere fertilizzante a rilascio lento Osmocote e mantenere in serra a una temperatura compresa tra 22 e 28 gradi Celsius per due settimane. Continuare a fertilizzare una volta alla settimana con Miracle Grow.

Per schermate ad alto rendimento, seminare direttamente le piante in vassoi con terreno sabbioso. Coprire con pellicola di plastica fino alla germinazione e mantenere come descritto in precedenza. Dopo la germinazione, aggiungere fertilizzante a rilascio lento Osmocote e fertilizzare una volta alla settimana con Miracle-Gro. Germinare i semi in una piastra di Petri foderata con diversi strati di carta Kimwipe, mantenuta in un incubatore a 25-28 gradi Celsius, quindi trasferire le piantine in sacchetti individuali.

In alternativa, posizionare i semi nella scanalatura della carta per farli germinare direttamente in sacchetti individuali. Collocare i sacchetti in una cartelletta appendiabiti in plastica per ogni cartelletta e disporre le cartellette su una rastrelliera, in posizione verticale.

Posizionare il rack in una camera ambientale controllata mantenuta a una temperatura compresa tra 25 e 28 gradi Celsius e con un fotoperiodo di 16 ore di luce e 8 ore di buio. Innaffiare i sacchetti una o due volte al giorno con acqua di osmosi inversa, circa 10-14 giorni dopo la semina. Quando si è sviluppato un sistema radicale adeguato con apici di radici terziarie, le piantine sono pronte per l'inoculazione. Prima di iniziare l'estrazione delle uova, lavare accuratamente l'area di lavoro e tutti gli strumenti con acqua calda per evitare contaminazioni.

Posizionare un secchio in un lavandino per raccogliere la soluzione, quindi far scorrere la soluzione attraverso un supporto a rete metallica posizionato sulla parte superiore. Impilare tre setacci dall'alto verso il basso in ordine decrescente di dimensione delle aperture, in modo che le uova si accumulino nel setaccio da 25 micron. Tagliare le sommità delle piante infette e scartarle con cura.

Rimuovere la pianta dal vaso e lavare le radici immergendole in un secchio di plastica pieno d'acqua. Sciacquare ulteriormente le radici sotto acqua corrente finché non vengono eliminate le particelle di terreno. Successivamente, estrarre le uova dei nematodi galligeni dalle radici infette del pomodoro.

Per prima cosa, tagliare le radici in piccoli pezzi utilizzando delle forbici, eliminando la radice principale. Mettere le radici tritate di una singola pianta in un barattolo di plastica grande con coperchio e aggiungere una quantità sufficiente di soluzione di candeggina al 10% per coprire completamente le radici. Chiudere il coperchio e agitare il barattolo per due minuti.

Aprire il barattolo e versare le radici sul setaccio superiore, quindi lavarle con un tubo collegato a un ugello nebulizzatore. Lavare bene fino a quando non scompare completamente l'odore della candeggina. Utilizzare un martello per battere sui lati dei setacci ed evitare che si intasino.

Fermarsi, rimuovere il setaccio superiore e sciacquare i detriti. E il secondo setaccio. Rimuovere il secondo setaccio e raccogliere i detriti fini, che includono le uova, dall'ultimo setaccio utilizzando un flusso delicato proveniente da una bottiglia d'acqua.

Spostare i detriti su un lato del setaccio. Raccogliere i detriti e le uova in un becher pulito con la minima quantità di acqua. Far passare l'acqua raccolta nel secchio attraverso il setaccio da 25 micron per raccogliere eventuali uova sfuggite.

Risciacquare accuratamente con acqua e raccogliere nello stesso becher. Rivestire un cestello metallico pulito con alcuni strati di carta Kim. Asciugare con carta e posizionare su una piastra di Petri di vetro, lasciando una distanza di un centimetro tra il fondo del cestello e la piastra.

Versare le uova di nematodi estratte sulla carta nel cestello metallico. Aggiungere abbastanza liquido in modo che la base del cestello tocchi la superficie dell'acqua senza essere immersa.

Coprire la parte superiore con un coperchio di plastica ogni giorno. Controllare l'evaporazione dell'acqua e aggiungere dell'acqua nella piastra di Petri in modo che la base del cestello tocchi l'acqua. Al fine di prevenire l'essiccamento delle uova ogni due giorni per un periodo di sei-otto giorni, raccogliere l'acqua contenente i giovani del secondo stadio o J2 dalla piastra di Petri in un becher.

Se non utilizzato immediatamente, aerare il campione raccolto a temperatura ambiente utilizzando una fonte di aria di laboratorio o l'aria prodotta da una pompa per acquari. Iniziare il passaggio successivo mescolando il campione su un agitatore magnetico a bassa velocità. Utilizzare tre aliquote dei nematodi raccolti.

Per contare il numero di J twos in ambito contabile. Scorrere o versare in una capsula, calcolare la media e determinare il volume desiderato per l'inoculazione. Questi sono J twos osservati al microscopio.

Normalmente, si utilizzano 3000 J twos per pianta nei vasi e 500 J twos per le piante coltivate in contenitori per semine. Prima di inoculare le piante, assicurarsi che il terreno sia umido ma non troppo bagnato. Per l'inoculazione in vaso, praticare tre fori di circa metà della profondità del vaso nella sabbia intorno a ciascun apparato radicale del pomodoro.

Utilizzando una matita, inoculare ogni pianta introducendo i J twos nei tre fori mediante una pipetta. Successivamente, coprire i fori per gli schermi ad alto rendimento posizionandoli nei vassoi. Utilizzare un ago con punta modificata e sigillata, provvisto di fori laterali incollati a una pipetta da cinque millilitri.

Aggiungere delicatamente con la pipetta il J twos nel terreno. Mantenere le piante in serra a una temperatura compresa tra 24 e 27 gradi Celsius per un periodo di sei a otto settimane. Continuare a fertilizzare due volte al mese con miracle grow.

Per la valutazione dell'infezione. Tagliare le parti aeree ed estrarre con attenzione le piante dai vasi, quindi lavare le radici. Successivamente, colorare di blu le masse di uova immergendo le radici in una soluzione di un milligrammo per litro.

Incubare in aerazione per 15 minuti. Sciacquare le radici in acqua e valutare contando le masse uovo colorate sui singoli apparati radicali. Per visualizzare le masse uovo, contare il nematode, l'inoculo e agitare su una piastra magnetica di agitazione, come descritto in precedenza, si può utilizzare una lente d'ingrandimento illuminata.

Rimuovere le buste dalle cartelle sospese e posizionarle su una superficie orizzontale. Inoculare ogni busta con 1.500 J2 in cinque millilitri. Sollevare il coperchio di plastica della busta e distribuire i nematodi uniformemente sulla superficie delle radici.

Mantenere le buste in posizione orizzontale per 24 ore dopo l'inoculazione, coperte con carta scura per escludere la luce. Successivamente, riposizionare le buste nei raccoglitori sospesi nella camera di crescita con acqua. Le piante devono essere innaffiate una o due volte al giorno per circa tre giorni con soluzione di Hoagland a mezza concentrazione, fino a quando non si osserva una risposta al fertilizzante.

Tipicamente si osserva un ingrigimento fogliare potenziato e una crescita più vigorosa dei getti. Dopo tre giorni, mantenere le borse umide con acqua. Circa 30 giorni dopo l'inoculazione, infondere ogni borsa con circa da 10 a 20 millilitri di 75 milligrammi al litro.

Lucidatura aerea. Mantenere i sacchetti in posizione orizzontale, completamente immersi nel colorante, per tutta la notte. Il giorno successivo, svuotare i sacchetti e valutare i sistemi radicali contando le masse di uova su una scrivania illuminata.

L'ingrandimento mostra le radici di una pianta di pomodoro fortemente infettata, con ampie masse di uova colorate in blu. L'uso di vassoi consente lo screening di centinaia di piante in uno spazio ridotto. Le buste per la crescita permettono anche una rapida e accurata valutazione non distruttiva delle radici, senza necessità di lavare le radici, per rilevare infezioni da nematodi.

Questo metodo consente inoltre lo screening ad alto rendimento di migliaia di piante in uno spazio ridotto di crescita. Qui il sistema radicale di una pianta di cow P coltivata in una busta mostra masse di uova colorate in blu a seguito dell'inoculazione. Il momento dell'infezione è molto critico per i saggi su piante con nematodi.

Pertanto, anche ritardare l'infezione di pochi giorni può portare a livelli di infezione molto elevati. Dopo aver visto questo video, ora dovreste avere una buona comprensione di come infettare e valutare le piante con nematodi galligeni. Non dimenticate che le radici infette da nematodi devono essere maneggiate correttamente.

Autoclavare le radici prima di smaltirle ridurrà la diffusione del nematode. Inoltre, prestare attenzione nell'uso della glicina aerea a dosi elevate. È cancerogena.

Pertanto, è necessario utilizzare guanti quando si manipolano radici infette con questa sostanza chimica e durante la preparazione di tale sostanza.