Name: Schermi throughput elevato e basso con Nematodi galligeni Meloidogyne spp. /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-12T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 46 s
Description: Scopri metodi di screening ad alto e basso throughput per valutare l'infestazione da nematodi galligeni Meloidogyne spp. nelle piante. Queste tecniche facilitano programmi di miglioramento genetico per varietà resistenti.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

La ricerca in Kaloshian laboratorio è finanziato da una sovvenzione da parte degli Stati Uniti National Institute of Food and Agriculture (2007-35607-17765). La ricerca in laboratorio Roberts è finanziata da sovvenzioni da Stati Uniti Agency for International Development (GDG-G-00-02-00012-00 e EDH-A-00-07-00005) e la California a secco Bean Advisory Board.

1. Pomodoro crescita delle piantine in vasi e vassoi <ol><li> Per i saggi vaso, semi di piante di pomodoro in un piatto unico in un organico ricco di suolo, come mix sole. Mantenere in una serra a 22-28 ° C. Dopo la germinazione, concimare una volta alla settimana con Miracle-Gro. </li><li> Circa due settimane dopo la germinazione, la vera foglia in due fasi, singolarmente trapiantare le piantine in vasi (10 cm di diametro e 17 cm di profondità) riempiti con terreno sabbioso sterile contenente il 90% sabbia e 10% di mix organico. Aggiungi Osmocote concime a lenta cessione e di mantenere in una serra a 22-28 ° C per due settimane. Continuare a concimare le piante una volta alla settimana con Miracle-Gro. </li><li> Per high-throughput schermi, semi di piante direttamente in vassoi in terreno sabbioso, coprire il vassoio con pellicola trasparente fino alla germinazione e mantenere come sopra. Dopo la germinazione, aggiungere Osmocote concime a lenta cessione e concimare una volta alla settimana con Miracle-Gro. </li></ol> 2. La crescita Cowpea in buste Seedling <ol><li> SI responsabili politici sono sia germogliato in una capsula di Petri, rivestito con diversi strati di carta Kimwipe, e trasferiti singolarmente ai sacchetti o inserito direttamente nella scanalatura di carta del sacchetto e germinato. </li><li> Mettere i sacchetti di plastica in una cartella di file di sospensione, due per ogni cartella, e organizzare le cartelle in un rack in posizione verticale. Inserire la griglia in un ambiente controllato camera mantenuta ad una temperatura di 25-28 ° C e 16 h di luce / 8 ore buio ciclo. Rack può anche essere mantenuto in una serra, ma richiedono un foglio di carta rigida o coperchio posizionato sulla cremagliera su entrambi i lati dei gambi delle piante, per ridurre il potenziale di contaminazione fungina. </li><li> Le buste d&#39;acqua una o due volte al giorno con acqua ad osmosi inversa. Circa 10 a 14 giorni dopo la semina, quando un apparato radicale adeguato con punte delle radici terziarie si è sviluppata (Figura 1), le piante sono pronte per l&#39;inoculo. </li></ol> 3. Estrazione di uova dei nematodi Estrazione eGGS da radici infette è stato modificato da un protocollo sviluppato da Hussey e Barker (1973). <ol><li> Tre o quattro giorni prima dell&#39;inoculazione nematode, estrarre galligeni uova di nematodi dalle radici di pomodoro infetti. Prima di iniziare l&#39;estrazione delle uova, lavare l&#39;area di lavoro accuratamente con acqua calda per evitare la contaminazione. Anche lavare in acqua bollente un frullatore, due secchi, uno di sostegno rete metallica, un martello di gomma, tre setacci di 425, 90 e 25 micron di apertura, un cilindro graduato e le forbici. </li><li> Stack dei setacci dall&#39;alto verso il basso nel seguente ordine: 425, 90 e 25 micron di apertura. Le uova vengono raccolte sul setaccio da 25 micron in basso. Mettere i setacci su una rete metallica supportato in un lavandino. Mettere un secchio sotto la rete metallica per raccogliere il run-through soluzione. </li><li> Tagliare le cime della pianta infetta (s), utilizzati come fonte di inoculo, e scartare. Rimuovere delicatamente la pianta dal vaso. Lavare le radici mediante immersione in un secchio di plastica pieno d&#39;acqua. Lavare le radici di età inferiore a correreacqua corrente fino a quando le particelle di terreno vengono lavate via dalle radici. </li><li> Tagliare le radici con le forbici in piccoli pezzi. Smaltire il fittone. </li><li> Mettere le radici tagliate da un unico stabilimento in un grande vaso di plastica con un coperchio, basta aggiungere solo una soluzione di candeggina al 10% per coprire le radici e chiudere il coperchio. </li><li> Scuotere il vaso contenente le radici per 2 min. </li><li> Aprire il vaso e versare le radici sulle setaccio superiore e lavare con un tubo collegato a un ugello di appannamento. Lavare bene fino a quando tutto l&#39;odore di candeggina è andato. Usare un martello per toccare i lati dei setacci per evitare di intasare i pori setaccio. </li><li> Rimuovere il setaccio superiore e sciacquare i detriti sul setaccio secondi. </li><li> Rimuovere il setaccio secondo e raccogliere i detriti sottile, che comprende le uova, dal setaccio ultimo. Con un flusso delicato da una bottiglia d&#39;acqua, spostare i detriti di un lato del setaccio. Raccogliere i detriti e le uova in un becher pulito con una quantità minima di acqua. </li><li> Sieve ancora una volta l&#39;acqua raccolta nellasecchio attraverso il setaccio da 25 micron di raccogliere tutte le uova che possono essere sfuggiti. Sciacquare bene con acqua e raccogliere nel bicchiere stesso. </li><li> Eliminare i detriti pianta dal setaccio superiore provvedendo a lavare accuratamente tutti e tre i vagli con acqua in pressione. Non toccare la parte maglie dei setacci in quanto può alterare la dimensione dei pori. </li></ol> 4. Nematodi uova da cova <ol><li> Linea un cestino di metallo pulito, con pochi strati di carta Kimwipe e stare su un piatto di vetro Petri. Consentire un 1-cm di distanza tra il fondo del cestello e il piatto. </li><li> Versare le uova nematodi estratti sulla carta nel cestello. Aggiungere abbastanza liquido in modo che il fondo del cestello tocca la superficie dell&#39;acqua, ma non è immerso in acqua. Coprire la parte superiore con un coperchio di plastica. </li><li> Ogni giorno controllare l&#39;evaporazione dell&#39;acqua ed aggiunge dell&#39;acqua nella scatola di Petri in modo che il fondo del cestello tocca l&#39;acqua. Questo consentirà di evitare le uova si asciughi. </li><li> Ogni altro giorno, raccogliere il WAter che contiene i J2S dai piatti Petri in un becher. Se non utilizzato immediatamente, aerare l&#39;inoculo raccolti a temperatura ambiente utilizzando una fornitura dell&#39;aria di laboratorio o aria generata da una pompa acquario. Utilizzare l &#39;inoculo aerato entro 2 giorni. J2S possono essere raccolte dalla schiusa istituito per un periodo di 6-8 giorni. </li></ol> 5. Pomodoro infezione Root in vasi o vassoi e valutazione di infezione <ol><li> Utilizzare tre aliquote dei nematodi raccolti per contare il numero di J2S in una diapositiva di conteggio o un piatto, calcolare la media e determinare il volume desiderato per l&#39;inoculo. Tipicamente 3000 J2S vengono utilizzati per pianta in vaso e 500 J2S per le piante coltivate in vassoi piantine. </li><li> Mescolare il inoculo su una piastra di agitazione magnetica a bassa velocità. </li><li> Prima di inoculare le piante, assicurarsi che il terreno è umido ma non troppo bagnato. Per l&#39;inoculazione pot, fare tre fori di circa mezzo piatto di profondità sotto la sabbia attorno ad ogni sistema di radici di pomodoro con una matita (figura 2 </strong&gt;). Inoculare ogni pianta fornendo i J2S nei tre fori con una pipetta. Successivamente, coprire i buchi. </li><li> Per gli high-throughput schermi in vassoi, utilizzare un ago modificato punta sigillata con fori sui lati incollati a 5 ml punta della pipetta lungo una pipettatura (Figura 3) di consegnare i J2S nel terreno. In alternativa, nematodi possono essere forniti come nel passaggio 5,3. </li><li> Mantenere le piante in una serra a 24-27 ° C per sei-otto settimane. Continuare a concimare due volte al mese con Miracle-Gro. </li><li> Per la valutazione di infezione, rimuovere con attenzione le piante dai vasi e lavare le radici (come descritto al punto 3.3). </li><li> Colorare le masse di uova azzurre immergendo le radici in 1 mg / L erioglaucine, per 15 min. </li><li> Lavare le radici in acqua e valutare contando le masse di uova colorate sul sistema radicale individuale. Una lente di ingrandimento scrivania illuminata può essere usato per aiutare a visualizzare le masse di uova. </li><li> Se le piante schermati sono necessarie per g ulteriorestudi enetic, non tagliare le cime prima di lavare le radici per la valutazione. Dopo la colorazione, e contando le masse di uova, trapiantare le piantine in organico del suolo, potare le cime pesantemente per ridurre la traspirazione, e mantenere in una serra. </li></ol> 6. Cowpea infezione Root in sacchetti e valutazione di infezione <ol><li> Contare il nematode inoculo e mescolare in un piatto di agitazione magnetica come descritto in precedenza. </li><li> Rimuovere le buste delle cartelle sospese e posto su una superficie orizzontale. Inoculare ogni busta con 1500 J2S in 5 ml. Sollevare il coperchio di plastica del sacchetto e distribuire i nematodi uniformemente sulla superficie delle radici. </li><li> Tenete i sacchetti in posizione orizzontale per 24 h dopo l&#39;inoculazione, coperto con carta scura per escludere la luce, per poi tornare alle cartelle sospese nella camera di crescita. </li><li> Annaffiare le piante, se necessario, una volta o due volte al giorno, con trattamento di mezza forza la soluzione di Hoagland (Hoagland e Arnon, 1950; Tabella 1 </strong&gt;) fino a una risposta al fertilizzante si osserva, più verde fogliame in genere una maggiore ripresa e la crescita più vigorosa. Di solito le piante vengono annaffiate con trattamento di mezza forza Hoagland 3 giorni di fila. Successivamente, tenere i sacchetti umido con acqua. </li><li> Circa 30 giorni (range 28-35 giorni) dopo l&#39;inoculazione, infondere ogni busta con circa 10-20 ml di 75 mg / L erioglaucine. Mantenere i sacchetti inondati con il colorante in posizione orizzontale durante la notte. </li><li> Scolate i sacchetti e valutare i sistemi di root contando le masse di uova sotto una lente d&#39;ingrandimento scrivania illuminata. </li><li> Se le piante schermati sono necessari per ulteriori studi genetici o di lavoro di allevamento, estrarre delicatamente le radici dal trapianto carta, in organica del suolo in vaso e di mantenere in una serra. </li></ol> 7. Risultati rappresentativi Le fasi appropriate di piante di pomodoro e cowpea per vaccinazioni nematodi per i due sistemi descritti sono mostrati nelle Figure1 e 2. Inoltre, esempi di ben-infette radici di pomodoro e cowpea sono mostrate nelle figure 4 e 5. Come nella maggior parte degli schermi resistenza alle malattie, è consigliabile utilizzare almeno 6-10 piante per genotipo per l&#39;inoculazione nematode per calcolare la media del tasso di infezione. Variazione infezione nematodi tra piante, dello stesso genotipo, può essere ridotto utilizzando impianti e dimensioni uniformi quantità precisa e di consegna di inoculo. L&#39;uso di vassoi e sacchetti di crescita consente lo screening di centinaia di migliaia di piante in uno spazio di crescita di piccole dimensioni. Sacchetti crescita consentono anche veloce ed efficiente valutazione non distruttiva di galligeni infezioni da nematodi senza necessità di radici di lavaggio (Figura 4). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3629/3629fig1.jpg" /> Figura 1. Una settimana-vecchio impianto di due fagiolo cresciuto in un sacchetto e pronte per root-knot NEMAtode inoculazione. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3629/3629fig2.jpg" /> Figura 2. A tre week-vecchia pianta di pomodori pronti per la root-knot inoculazione nematode. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3629/3629fig3.jpg" /> Figura 3. Un ago modificato e puntale usato per high-throughput inoculazione di nematodi. Il fondo di un ago è stato sigillato e tre serie di fori sono stati perforati nella ago utilizzando un fascio laser. Poi, l&#39;ago modificata è stata incollata a 5 ml punta della pipetta. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3629/3629fig4.jpg" /> Figura 4. Un sistema di radici di pomodoro infettato da nematodi galligeni. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3629/3629fig5.jpg" /> Figura 5. Un apparato radicale cowpea con masse di uova colorate con erioglaucine 30 giorni post-inoculazione cresciuta a28 ° C.

<ol><li>Bhattarai, K. K., Xie, Q. G., Mantelin, S., Bishnoi, U., Girke, T., Navarre, D. A., Kaloshian, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tomato+susceptibility+to+root-knot+nematodes+requires+an+intact+jasmonic+acid+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant+Microbe+Interact%22%5BJournal%5D)">Tomato susceptibility to root-knot nematodes requires an intact jasmonic acid signaling pathway.</a> Mol. Plant Microbe Interact. 21, 1205-1214 (2008).</li>
<li>Ehlers, J. D., Matthews, W. C., Hall, A. E., Roberts, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inheritance+of+a+broad-based+form+of+root-knot+nematode+resistance+in+cowpea%5BTitle%5D)+AND+%22Crop+Sci%22%5BJournal%5D)">Inheritance of a broad-based form of root-knot nematode resistance in cowpea.</a> Crop Sci. 40, 611-618 (2000).</li>
<li>Hoagland, D. R., Arnon, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+water-culture+method+for+growing+plants+without+soil%5BTitle%5D)+AND+%22Calif.+Agric.+Exp.+Stn.+Circ%22%5BJournal%5D)">The water-culture method for growing plants without soil.</a> Calif. Agric. Exp. Stn. Circ. 347, (1950).</li>
<li>Hussey, R. S., Barker, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+methods+of+collecting+inocula+of+Meloidogyne+spp.%2C+including+a+new+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Dis.+Rep%22%5BJournal%5D)">A comparison of methods of collecting inocula of Meloidogyne spp., including a new technique.</a> Plant Dis. Rep. 57, 1025-1028 (1973).</li>
<li>Martinez de Ilarduya, O., Moore, A. E., Kaloshian, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tomato+Rme1+locus+is+required+for+Mi-1-mediated+resistance+to+root-knot+nematodes+and+the+potato+aphid%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">The tomato Rme1 locus is required for Mi-1-mediated resistance to root-knot nematodes and the potato aphid.</a> Plant J. 27, 417-425 (2001).</li>
<li>Matkin, O. A., Chandler, P. A. The U.C.-type soil mixes. In: The U.C. system for producing healthy container-grown plants. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMatkin%2C+OA+%22Calif.+Agric.+Exp.+Stn.+Manual%22">Calif. Agric. Exp. Stn. Manual</a>. Baker, K. F. 23, 68-85 (1957).</li>
<li>Omwega, C. O., Roberts, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inheritance+of+resistance+to+Meloidogyne+spp.+in+common+bean+and+the+genetic+basis+of+its+sensitivity+to+temperature%5BTitle%5D)+AND+%22Theor.+Appl.+Genet%22%5BJournal%5D)">Inheritance of resistance to Meloidogyne spp. in common bean and the genetic basis of its sensitivity to temperature.</a> Theor. Appl. Genet. 83, 720-726 (1992).</li>
<li>Omwega, C. O., Thomason, I. J., Roberts, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nondestructive+technique+for+screening+bean+germplasm+for+resistance+to+Meloidogyne+incognita%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Dis%22%5BJournal%5D)">A nondestructive technique for screening bean germplasm for resistance to Meloidogyne incognita.</a> Plant Dis. 72, 970-972 (1988).</li>
<li>Perry, R. N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPerry%2C+RN+%22Root-Knot+Nematodes%22">Root-Knot Nematodes</a>. Moens, M., Starr, J. L. , CABI Publishing. Wallingford. (2009).</li>
<li>Starr, J. L., Cook, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStarr%2C+JL+%22Resistance+to+Parasitic+Nematodes%22">Resistance to Parasitic Nematodes</a>. Bridge, J. , CABI Publishing. Wallingford. (2002).</li>
</ol>

Non abbiamo nulla da rivelare.

Ci sono due passaggi critici per uno schermo nematode successo: la preparazione di un inoculo altamente infettivo e utilizzando gli impianti in fase di sviluppo adeguato. Tasso di schiusa delle uova galligeni nematodi è altamente variabile e spazia tra il 5 - 50%. Quindi, per ottenere livelli ottimali di portello e J2S altamente infettivi, particolare attenzione deve essere posta l&#39;estrazione delle uova da cova e le procedure. Le uova dovrebbero essere esposti alla candeggina per un periodo di tempo minimo e candeggina devono essere risciacquati bene dalla miscela di root. Quando cova le uova, l&#39;impasto che contiene le uova non devono essere immerso in acqua. Inoltre, evitare di versare le uova nel piatto sottostante Petri dove sono raccolti i giovani nati. Un modo per evitare di versare le uova durante il processo di cova, non è quello di aggiungere l&#39;acqua direttamente al Kimwipe della carta potrebbe rompersi. Invece aggiungere l&#39;acqua direttamente alla piastra di Petri. Per ottenere i migliori risultati, utilizzare J2S appena nati. Se il hatch tasso è basso e più inoculo è necessario, J2S può essere conservato a 15 ° C per un periodo più lungo. Scaldare l&#39;inoculo conservato a temperatura ambiente per rivivere i nematodi prima inoculazione. Tuttavia, non conservare i J2S per periodi prolungati anche a 15 ° C come J2S affamati non in grado di infettare in modo efficiente. Piantine giovani sono il miglior stadio di sviluppo per l&#39;utente root-knot inoculazione nematode. Tuttavia, questo deve essere equilibrata con la formazione di un apparato radicale adeguato fornire un numero sufficiente di apici radicali come punti di entrata per i J2S. Il mantenimento di ottimali condizioni di crescita delle piante è essenziale anche per gli schermi. Evitare di venire l&#39;acquolina in impianti appositamente quelli coltivati ​​in sacchetti. Over-irrigazione dei sacchetti, come indicato da acqua stagnante nel fondo della sacca, può promuovere la crescita fungina e diminuire salute radice. Con entrambi i dosaggi di valutazione ulteriore infestazione da nematodi e calcolo del numero di uova / sistema di radici e uova / grammo di freradice sh può essere eseguita. Per i saggi di pomodoro, le radici individuali vengono pesati e uova estratte come descritto per la preparazione inoculo (sezione 3). Durante l&#39;elaborazione numero elevato di campioni di piante, sistemi radicali singoli potevano essere macerata usando un miscelatore per l&#39;estrazione delle uova. Il numero di uova deve essere contato in almeno tre aliquote e le uova / grammo di sistema radice fresca calcolato. Per i saggi sacchetto, il sistema della radice viene tirato fuori il foglietto di carta, pesati, e uova estratte.

schermi throughput elevato e basso con nematodi galligeni meloidogyne spp.</em

High and Low Throughput Screens with Root-knot Nematodes Meloidogyne spp.

Nematodi galligeni (Meloidogyne genere) sono parassiti obbligati delle piante. Sono estremamente polifago e considerato uno dei nematodi parassiti economicamente più importanti. Il microscopico seconda fase giovanile (J2), una volta mutate nell&#39;uovo, è la fase infettiva. I J2S schiudono dalle uova, muoversi liberamente nel terreno all&#39;interno di una pellicola d&#39;acqua, e individuare punte delle radici delle specie di piante adatte. Dopo aver oltrepassato la radice, la loro migrazione verso il cilindro vascolare, dove creare un sito di alimentazione e avviare l&#39;alimentazione usando i loro stiletti. Il sito di alimentazione multicellulare è formato da diverse cellule ingrandite multinucleari chiamate &#39;cellule giganti&#39;, che sono formate da cellule che sottoposti a cariocinesi (ripetuto mitosi) senza citochinesi. Le cellule si dividono e si pericycle vicini allargare dimensioni dando origine ad una fiele tipico o nodo radice, il sintomo caratteristico di root-nodo infezione nematode. Una volta che l&#39;alimentazione è iniziato, J2S diventano sedentari e delle Nazioni Unitedergo tre mute supplementari per diventare adulti. La femmina adulta depone 150-250 uova in una matrice gelatinosa sopra o sotto la superficie della radice. Dalle uova si schiudono nuovi J2S infettive e iniziare un nuovo ciclo. La radice-nodo ciclo di vita del nematode si completa in 4-6 settimane a 26-28 ° C. Qui vi presentiamo il protocollo tradizionale per infettare piante, coltivate in vaso, con nematodi galligeni e due metodi di analisi high-throughput. Il primo high-throughput metodo viene utilizzato per le piante con semi di piccole dimensioni come pomodoro, mentre il secondo è per le piante con semi grandi come fagioli fagiolo e comune. Semi di grandi dimensioni sostenere la crescita estesa piantina con un minimo supplemento nutrizionale. Il primo test un&#39;elevata utilizza piantine coltivate in sabbia in vassoi, mentre negli impianti secondo saggio sono coltivate in bustine in assenza di terreno. Il sacchetto crescita delle piantine è fatto di un 15,5 x 12,5 centimetri stoppino di carta, piegata in alto per formare un 2-cm profondità trogolo in cui è posto il seme o piantina. Ilstoppino di carta è contenuto all&#39;interno di un sacchetto di plastica trasparente. Questi sacchetti di crescita permettono l&#39;osservazione diretta dei sintomi di infezione, i nematodi irritanti di radici e di massa produzione di uova, sotto la superficie di un sacchetto trasparente. Entrambi i metodi consentono l&#39;utilizzo degli impianti schermati, dopo fenotipo, per attraversare o semi produzione. Un ulteriore vantaggio dell&#39;uso di sacche di crescita è l&#39;ingombro ridotto perché buste vengono memorizzati in plastica cartelle sospese disposti in rack.

Due metodi diversi per le piante schermo con nematodi galligeni sono descritti. Gli approcci descritti includono high-throughput schermi con nematodi in modo non distruttivo facilitare l&#39;uso di queste piante in programmi di allevamento.

Schermi throughput elevato e basso con Nematodi galligeni Meloidogyne spp.</em

I nematodi galligeni (genere Meloidogyne) sono parassiti vegetali obbligati. Sono estremamente polifagi e considerati tra i più economicamente importanti...

L'obiettivo generale di questa procedura è lo screening di piante infestate da nematodi galligeni. Per prima cosa, coltivare piantine sane in terreno sabbioso o in buste per la crescita. Successivamente, produrre un inocolo costituito da giovani in stadio secondario fortemente infetti di nematodi galligeni.Quindi inoculare e infettare correttamente le piantine. Valutare infine lo sviluppo delle masse di uova di nematodi sul sistema radicale dell'ospite. Dimostreremo schermate ad alta e bassa produttività di piante con radici, non di nematodi.E i principali vantaggi del sistema ad alta capacità sono la limitata superficie necessaria per la crescita delle piante e la facilità di valutazione dell'infezione. Questi approcci permetteranno quindi di ottenere un'infezione riproducibile e uniforme, nonché un'infezione delle radici delle piante da parte dei nematodi, consentendo così una migliore valutazione dello stato di ospite della pianta. In generale, chi si approccia per la prima volta alla valutazione delle piante con nematodi radicali potrebbe incontrare difficoltà a causa dell'utilizzo di uno stadio di sviluppo non appropriato per infettare le radici con i nematodi.E inoltre utilizzando giovani stadi infettivi di diversi giorni, che tipicamente hanno una bassa infettività. Il procedimento sarà dimostrato da Hug Up Atian, studente laureando. Nel mio laboratorio, mostrerò il procedimento per lo screening nelle buste di crescita per saggi in vaso. Piantare semi di pomodoro in un singolo vaso riempito con terreno ricco di sostanza organica, come il Sunshine Mix, mantenendo la serra a una temperatura compresa tra 22 e 28 gradi Celsius dopo la germinazione.Annaffiare una volta alla settimana con Miracle Grow circa due settimane dopo la germinazione, al momento del trapianto delle singole piantine in vasi contenenti terreno sabbioso sterile, composto da 90% di sabbia e 10% di materia organica. Aggiungere fertilizzante a rilascio lento Osmocote e mantenere in serra a una temperatura compresa tra 22 e 28 gradi Celsius per due settimane. Continuare a fertilizzare una volta alla settimana con Miracle Grow.Per schermate ad alto rendimento, seminare direttamente le piante in vassoi con terreno sabbioso. Coprire con pellicola di plastica fino alla germinazione e mantenere come descritto in precedenza. Dopo la germinazione, aggiungere fertilizzante a rilascio lento Osmocote e fertilizzare una volta alla settimana con Miracle-Gro. Germinare i semi in una piastra di Petri foderata con diversi strati di carta Kimwipe, mantenuta in un incubatore a 25-28 gradi Celsius, quindi trasferire le piantine in sacchetti individuali.In alternativa, posizionare i semi nella scanalatura della carta per farli germinare direttamente in sacchetti individuali. Collocare i sacchetti in una cartelletta appendiabiti in plastica per ogni cartelletta e disporre le cartellette su una rastrelliera, in posizione verticale.Posizionare il rack in una camera ambientale controllata mantenuta a una temperatura compresa tra 25 e 28 gradi Celsius e con un fotoperiodo di 16 ore di luce e 8 ore di buio. Innaffiare i sacchetti una o due volte al giorno con acqua di osmosi inversa, circa 10-14 giorni dopo la semina. Quando si è sviluppato un sistema radicale adeguato con apici di radici terziarie, le piantine sono pronte per l'inoculazione. Prima di iniziare l'estrazione delle uova, lavare accuratamente l'area di lavoro e tutti gli strumenti con acqua calda per evitare contaminazioni.Posizionare un secchio in un lavandino per raccogliere la soluzione, quindi far scorrere la soluzione attraverso un supporto a rete metallica posizionato sulla parte superiore. Impilare tre setacci dall'alto verso il basso in ordine decrescente di dimensione delle aperture, in modo che le uova si accumulino nel setaccio da 25 micron. Tagliare le sommità delle piante infette e scartarle con cura.Rimuovere la pianta dal vaso e lavare le radici immergendole in un secchio di plastica pieno d'acqua. Sciacquare ulteriormente le radici sotto acqua corrente finché non vengono eliminate le particelle di terreno. Successivamente, estrarre le uova dei nematodi galligeni dalle radici infette del pomodoro.Per prima cosa, tagliare le radici in piccoli pezzi utilizzando delle forbici, eliminando la radice principale. Mettere le radici tritate di una singola pianta in un barattolo di plastica grande con coperchio e aggiungere una quantità sufficiente di soluzione di candeggina al 10% per coprire completamente le radici. Chiudere il coperchio e agitare il barattolo per due minuti.Aprire il barattolo e versare le radici sul setaccio superiore, quindi lavarle con un tubo collegato a un ugello nebulizzatore. Lavare bene fino a quando non scompare completamente l'odore della candeggina. Utilizzare un martello per battere sui lati dei setacci ed evitare che si intasino.Fermarsi, rimuovere il setaccio superiore e sciacquare i detriti. E il secondo setaccio. Rimuovere il secondo setaccio e raccogliere i detriti fini, che includono le uova, dall'ultimo setaccio utilizzando un flusso delicato proveniente da una bottiglia d'acqua.Spostare i detriti su un lato del setaccio. Raccogliere i detriti e le uova in un becher pulito con la minima quantità di acqua. Far passare l'acqua raccolta nel secchio attraverso il setaccio da 25 micron per raccogliere eventuali uova sfuggite.Risciacquare accuratamente con acqua e raccogliere nello stesso becher. Rivestire un cestello metallico pulito con alcuni strati di carta Kim. Asciugare con carta e posizionare su una piastra di Petri di vetro, lasciando una distanza di un centimetro tra il fondo del cestello e la piastra.Versare le uova di nematodi estratte sulla carta nel cestello metallico. Aggiungere abbastanza liquido in modo che la base del cestello tocchi la superficie dell'acqua senza essere immersa.Coprire la parte superiore con un coperchio di plastica ogni giorno. Controllare l'evaporazione dell'acqua e aggiungere dell'acqua nella piastra di Petri in modo che la base del cestello tocchi l'acqua. Al fine di prevenire l'essiccamento delle uova ogni due giorni per un periodo di sei-otto giorni, raccogliere l'acqua contenente i giovani del secondo stadio o J2 dalla piastra di Petri in un becher.Se non utilizzato immediatamente, aerare il campione raccolto a temperatura ambiente utilizzando una fonte di aria di laboratorio o l'aria prodotta da una pompa per acquari. Iniziare il passaggio successivo mescolando il campione su un agitatore magnetico a bassa velocità. Utilizzare tre aliquote dei nematodi raccolti.Per contare il numero di J twos in ambito contabile. Scorrere o versare in una capsula, calcolare la media e determinare il volume desiderato per l'inoculazione. Questi sono J twos osservati al microscopio.Normalmente, si utilizzano 3000 J twos per pianta nei vasi e 500 J twos per le piante coltivate in contenitori per semine. Prima di inoculare le piante, assicurarsi che il terreno sia umido ma non troppo bagnato. Per l'inoculazione in vaso, praticare tre fori di circa metà della profondità del vaso nella sabbia intorno a ciascun apparato radicale del pomodoro.Utilizzando una matita, inoculare ogni pianta introducendo i J twos nei tre fori mediante una pipetta. Successivamente, coprire i fori per gli schermi ad alto rendimento posizionandoli nei vassoi. Utilizzare un ago con punta modificata e sigillata, provvisto di fori laterali incollati a una pipetta da cinque millilitri.Aggiungere delicatamente con la pipetta il J twos nel terreno. Mantenere le piante in serra a una temperatura compresa tra 24 e 27 gradi Celsius per un periodo di sei a otto settimane. Continuare a fertilizzare due volte al mese con miracle grow.Per la valutazione dell'infezione. Tagliare le parti aeree ed estrarre con attenzione le piante dai vasi, quindi lavare le radici. Successivamente, colorare di blu le masse di uova immergendo le radici in una soluzione di un milligrammo per litro.Incubare in aerazione per 15 minuti. Sciacquare le radici in acqua e valutare contando le masse uovo colorate sui singoli apparati radicali. Per visualizzare le masse uovo, contare il nematode, l'inoculo e agitare su una piastra magnetica di agitazione, come descritto in precedenza, si può utilizzare una lente d'ingrandimento illuminata.Rimuovere le buste dalle cartelle sospese e posizionarle su una superficie orizzontale. Inoculare ogni busta con 1.500 J2 in cinque millilitri. Sollevare il coperchio di plastica della busta e distribuire i nematodi uniformemente sulla superficie delle radici.Mantenere le buste in posizione orizzontale per 24 ore dopo l'inoculazione, coperte con carta scura per escludere la luce. Successivamente, riposizionare le buste nei raccoglitori sospesi nella camera di crescita con acqua. Le piante devono essere innaffiate una o due volte al giorno per circa tre giorni con soluzione di Hoagland a mezza concentrazione, fino a quando non si osserva una risposta al fertilizzante.Tipicamente si osserva un ingrigimento fogliare potenziato e una crescita più vigorosa dei getti. Dopo tre giorni, mantenere le borse umide con acqua. Circa 30 giorni dopo l'inoculazione, infondere ogni borsa con circa da 10 a 20 millilitri di 75 milligrammi al litro.Lucidatura aerea. Mantenere i sacchetti in posizione orizzontale, completamente immersi nel colorante, per tutta la notte. Il giorno successivo, svuotare i sacchetti e valutare i sistemi radicali contando le masse di uova su una scrivania illuminata.L'ingrandimento mostra le radici di una pianta di pomodoro fortemente infettata, con ampie masse di uova colorate in blu. L'uso di vassoi consente lo screening di centinaia di piante in uno spazio ridotto. Le buste per la crescita permettono anche una rapida e accurata valutazione non distruttiva delle radici, senza necessità di lavare le radici, per rilevare infezioni da nematodi.Questo metodo consente inoltre lo screening ad alto rendimento di migliaia di piante in uno spazio ridotto di crescita. Qui il sistema radicale di una pianta di cow P coltivata in una busta mostra masse di uova colorate in blu a seguito dell'inoculazione. Il momento dell'infezione è molto critico per i saggi su piante con nematodi.Pertanto, anche ritardare l'infezione di pochi giorni può portare a livelli di infezione molto elevati. Dopo aver visto questo video, ora dovreste avere una buona comprensione di come infettare e valutare le piante con nematodi galligeni. Non dimenticate che le radici infette da nematodi devono essere maneggiate correttamente.Autoclavare le radici prima di smaltirle ridurrà la diffusione del nematode. Inoltre, prestare attenzione nell'uso della glicina aerea a dosi elevate. È cancerogena.Pertanto, è necessario utilizzare guanti quando si manipolano radici infette con questa sostanza chimica e durante la preparazione di tale sostanza.

high-low-throughput-screens-with-root-knot-nematodes-meloidogyne

Research

Ricerca

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Visualizzare batteri nei nematodi usando la microscopia a fluorescenza

In questo video, dimostriamo un test di screening per identificare l'efficacia dei nematocidi a piccole molecole contro i nematodi. I nematocidi sono considerati efficaci se causano una diminuzione del numero di nematodi mobili nel campione dopo l'esposizione.

Saggio di screening dei nematocidi di piccole molecole: un metodo a medio rendimento per lo screening di potenziali nematocidi contro Ditylenchus dipsaci

Nematodi entomopatogeni sono nematodi del suolo abitare che parassitano una vasta gamma di insetti. Dimostriamo metodi di campionamento utilizzati per l'isolamento di questi nematodi dal terreno utilizzando due tecniche: l'adescamento insetto e la trappola bianco modificato, per il recupero dei nematodi dai campioni di suolo e cadaveri insetti infetti, rispettivamente.

Campionamento e Isolamento di Nematodi entomopatogeni Suolo (Steinernematidae, Heterorhabditidae)

Qui viene presentato un protocollo per il rapido screening non distruttivo dei genotipi di cotone per la resistenza ai nematodi reniformi. Il protocollo prevede l'esame visivo delle radici delle piantine di cotone infettate dal nematode per determinare la risposta all'infezione. Il germoglio vegetativo di ogni pianta viene quindi propagato per recuperare gli impianti per la produzione di semi.

Screening dei genotipi del cotone per la Resistenza ai Nematode Reniforme

Questo protocollo delinea un metodo per estrarre in modo efficiente nematodi vivi da substrati naturali sul campo.

Rapido isolamento dei nematodi selvatici di Baermann Funnel

Il presente protocollo descrive un metodo affidabile e diretto per la coltivazione, la raccolta e lo screening di Ditylenchus dipsaci.

Coltivazione e screening del nematode parassita vegetale Ditylenchus dipsaci

Qui, introduciamo un metodo dettagliato di ammollo dell'interferenza dell'RNA in Bursaphelenchus xylophilus per facilitare lo studio delle funzioni geniche.

Applicazione dell'interferenza dell'RNA nel nematode del pino, Bursaphelenchus xylophilus

Il protocollo descrive l'infezione delle radici di Solanum tuberosum con nematodi parassiti delle piante in condizioni di serra in vivo e radici transgeniche in vitro di patate per l'analisi istochimica della struttura radicale attraverso la microscopia ottica.

Infezione in vivo e in vitro delle radici della patata con nematodi parassiti delle piante per la valutazione dei cambiamenti strutturali indotti

Presentiamo due metodi per gli agricoltori per propagare in massa nematodi entomopatogeni come bio-insetticidi. Il primo metodo utilizza gel di poliacrilammide come substrato per la coltura del nematode, mentre il secondo utilizza il filone rivestito di polimero come substrato di coltura. Entrambi i metodi si basano sulla propagazione in vivo dei nematodi all'interno di cadaveri di insetti.

Propagazione in vivo basata sul coltivatore di nematodi entomopatogeni

Questo metodo descrive l'utilizzo di Infrared sistema colorante di imaging based per il rilevamento di H1N1 in bronchioalveolar lavaggio (BAL) fluido di topi infettati ad una sensibilità elevata. Questa metodologia può essere eseguita in uno 96 - o 384-bene piastra, richiede &lt;10 volume pl di materiale di prova e ha il potenziale per lo screening concomitante di agenti patogeni multipli.

High-throughput Metodo di rilevazione per il virus dell&#39;influenza

Scopri metodi di screening ad alto e basso throughput per valutare l'infestazione da nematodi galligeni Meloidogyne spp. nelle piante. Queste tecniche facilitano programmi di miglioramento genetico per varietà resistenti.

Schermi throughput elevato e basso con Nematodi galligeni Meloidogyne spp.

Esplora altri video