L'analisi di morfologia dendritica delle cellule di Purkinje in Culture Slice organotipiche

L'obiettivo generale di questa procedura è analizzare lo sviluppo dell'albero dendritico della cellula burkini in diverse condizioni sperimentali. Questo viene raggiunto innanzitutto preparando colture organotipiche di fettine del cervelletto di topo postnatale. Successivamente, coltivare le colture di fettine in diverse condizioni sperimentali.

Ad esempio, si può testare l'effetto di agonisti del recettore MGL R1, quindi fissare le colture e rivelare la morfologia delle singole cellule bikini, degli alberi dendritici mediante immunoistochimica con anticorpi anti-Calbindina. L'ultimo passaggio consiste nell'analizzare gli alberi dendritici delle cellule di Perkin. L'analisi di cellule di Perkin coltivate in condizioni di controllo o sperimentali, ottenuta mediante microscopia a fluorescenza dopo colorazione immunoistochimica, e la valutazione quantitativa delle dimensioni e della ramificazione dei loro alberi dendritici mostrano che l'attivazione del recettore per il neurotrasmettitore, in particolare del recettore MGL R1, influenza profondamente lo sviluppo dell'albero dendritico delle cellule perkinji.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che quasi tutta la fuoriuscita dall'estremità della cellula di Perkin avviene durante il periodo di coltura, consentendo così di studiare in vitro un processo complesso come lo sviluppo di un albero dendritico. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della neurobiologia dello sviluppo, ad esempio in che modo l'attività influisce sulla crescita e sullo sviluppo dei processi neuronali. Per iniziare questa procedura, dissezionare il cervelletto dal cervello di un topo PA neonato in un mezzo di preparazione freddo sotto un microscopio stereoscopico.

Successivamente, tagliare il cervelletto in fette spesse 350 micron in orientamento sagittale utilizzando un taglia tessuti McIlwain. Dopo aver separato le fette, posizionarle su inserti per coltura cellulare Millipore, con circa sei fette per inserto. Quindi incubarle in piastre a sei pozzetti precedentemente riempite con 0,75 millilitri di mezzo di incubazione per pozzetto, in un'atmosfera umidificata con il 5% di anidride carbonica a 37 gradi Celsius.

Iniziare i trattamenti farmacologici al terzo giorno in vitro aggiungendo la PMA o il DHPG alla concentrazione desiderata nel mezzo di coltura. Rinnovare i farmaci insieme al cambio del mezzo di coltura ogni due o tre giorni. Per la fissazione della coltura.

Prima di tutto, rimuovere il mezzo di coltura, quindi aggiungere con attenzione tre millilitri di paraformaldeide in ogni pozzetto contenente le fette cerebellari attaccate alla membrana dell'Insert MilliCell. Dopo la fissazione delle colture in overnight, rimuovere il fissativo. Successivamente, sciacquare le colture con tampone fosfato.

Successivamente, aggiungere l'anticorpo di coniglio anti bovino, diluito nella soluzione di blocco, alla coltura. Diluire l'anticorpo anti calbindina di coniglio a uno a 1000 per visualizzare selettivamente le cellule per kinji e l'anticorpo monoclonale anti new N a uno a 500 per visualizzare selettivamente le cellule granulari nella soluzione di blocco.

Incubare le colture con questo composto tutta la notte a quattro gradi Celsius sotto agitazione lenta. Il giorno successivo, lavare le colture tre volte con tampone fosfato 0,1 M, diluire gli anticorpi secondari. Capra anti coniglio, Alexa 5 68 e capra anti topo Alexa 4 88 in rapporto 1:500 in tampone fosfato 0,1 M, più 0,1% di Triton X 100.

Incubare le colture con questo reagente per due ore a temperatura ambiente. Dopo aver sciacquato le colture tre volte in tampone fosfato, rimuovere le sezioni colorate dal pozzetto della coltura con un pennello e montarle su vetrini super frosts plus. Applicare i coverslip utilizzando un adeguato mezzo di montaggio.

Quindi osservare le colture al microscopio ordinario dotato di attrezzatura per epifluorescenza o al microscopio confocale con la marcatura fluorescente delle cellule bikini. La dimensione dell'albero dendritico di una determinata cellula può essere facilmente misurata se l'albero non si sovrappone ad altre cellule. Una volta identificata una cellula bikini con un albero dendritico non sovrapposto, essa viene osservata con l'obiettivo 20x.

Un'immagine viene acquisita con una fotocamera digitale e successivamente analizzata mediante un programma di analisi delle immagini. Nel nostro laboratorio si utilizza Image Pro Plus. Questo software permette di delineare l'albero dendritico della cellula con un singolo clic del mouse.

Utilizzando lo strumento bacchetta magica in modalità misurazione, il programma calcola successivamente l'area coperta dall'albero dendritico ed esporta il dato in Ms.Xl. L'analisi statistica dei dati viene quindi eseguita con il software GraphPad Prism per il numero di punti di biforcazione. A causa della morfologia altamente ramificata e finemente dettagliata dell'albero dendritico delle cellule kinji, queste ultime devono essere contate manualmente. Il file dell'immagine a 20 x delle cellule kinji viene ingrandito in modo da coprire la maggior parte dello schermo utilizzando Adobe Photoshop.

Quindi ogni punto di ramificazione viene contato e contrassegnato con un punto rosso. Le cellule bikini identificate erano state fotografate ripetutamente per monitorare la crescita dell'albero dendritico. Dal div due al div sette, si è verificata una crescita continua delle ramificazioni dei dendriti.

Dalla div 4 alla div 11, l'albero dendritico si era notevolmente espanso. Illustrati qui sono esempi dell'inibizione dello sviluppo dell'albero dendritico della cellula bikini indotta da p KC o mgl R uno. I pannelli A e D mostrano le cellule di controllo non trattate con un albero dendritico ben sviluppato. Dopo nove giorni di trattamento con PMA, i dendri appaiono ispessiti e l'albero dendritico è fortemente ridotto di dimensioni, come mostrato in BNE.

D'altra parte, le CNF mostrano che dopo nove giorni di trattamento con DHPG, l'albero dendritico era notevolmente ridotto nelle dimensioni. A differenza del trattamento con PMA, molti ramificazioni laterali molto fini e corte erano presenti sui dendriti primari e secondari.

Le misurazioni quantitative mostrano che sia la dimensione dell'albero dendritico nel grafico a barre superiore sia il numero di punti di biforcazione nel grafico a barre inferiore sono notevolmente ridotti dopo il trattamento con PMA o DHPG; le differenze tra gli alberi dendritici di controllo e gli alberi dendritici delle cellule bikini provenienti da colture trattate erano significative. Dopo questa procedura, possono essere eseguiti ulteriori metodi, come l'elettrofisiologia, per rispondere ad altre domande, ad esempio sulle implicazioni funzionali di una morfologia alterata dell'albero dendritico. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come allestire colture di fette cerebellari organotipiche e di come analizzare le cellule kinia e la mitologia.