Valutare alterazioni metaboliche epatiche durante la colonizzazione progressiva di Germe senza mouse da ¹ H spettroscopia NMR

Lo scopo di questa procedura è quello di valutare l'impatto di una progressiva colonizzazione sul metabolismo epatico dell'ospite. Ciò si ottiene colonizzando progressivamente i topi privi di germi. Il processo di colonizzazione viene monitorato valutando l'escrezione urinaria dei cometaboliti microbici attraverso la spettroscopia NMR.

Successivamente al monitoraggio del processo di colonizzazione, viene raccolta una biopsia epatica dal topo e preparata per il profilo metabolico. Il profilo metabolico epatico può quindi essere acquisito dalla biopsia intatta utilizzando la spettroscopia NMR non distruttiva ad angolo magico ad alta risoluzione. In definitiva, questo uso della spettroscopia NMR protonica rivela vari metaboliti coinvolti nelle vie metaboliche come le vie dell'energia e dello stress ossidativo.

Quindi questo esperimento può fornire informazioni sulle funzioni epatiche durante la colonizzazione. Può anche essere applicato attraverso il sistema come il rene. Per colonizzare gli animali, rimuovere i topi privi di germi dagli isolatori e ospitarli in una stanza di allevamento convenzionale in gabbie, dotate di un filtro davanti agli animali convenzionali che fungono da controlli.

Quindi mescolare metà di una cucciolata di tre giorni prelevata dalla gabbia convenzionale di controllo con la lettiera degli animali privi di germi, raccogliere l'urina in una microprovetta da 1,5 millilitri maneggiando il mouse sopra la provetta e massaggiare delicatamente l'intestino. Per l'acquisizione con una sonda NMR da cinque millimetri è richiesto un minimo di 20 microlitri, ma si consiglia di utilizzare 30 microlitri per migliorare la qualità del profilo metabolico. Congelare immediatamente l'urina in una riserva di azoto liquido ad almeno meno 40 gradi Celsius fino all'analisi NMR.

Prima dell'acquisizione NMR, preparare una soluzione tampone di fosfato di sodio 0,2 molare in acqua pesante. pH 7,4 contenente un millimolare TSP miscela 30 microlitri di urina con 30 microlitri di tampone fosfato di sodio. Trasferire 50 microlitri della soluzione miscelata in un tubo capillare NMR da 1,7 millimetri utilizzando una siringa di vetro da 50 microlitri dotata di ago metallico.

Fare attenzione a evitare bolle. Inserire l'adattatore capillare sopra il capillare contenente il campione di urina e inserirlo in un microtubo NMR da 2,5 millimetri per una sonda NMR da cinque millimetri. Questa combinazione di tubi può essere utilizzata come un tubo NMR standard da cinque millimetri per l'acquisizione spettrale.

In questa dimostrazione, per raccogliere i dati viene utilizzato uno spettrometro NMR da 700 megahertz avanzato. Acquisire spettri NMR protonici unidimensionali utilizzando i parametri discussi nel protocollo scritto. Dopo l'acquisizione della risonanza magnetica mobile, utilizzare l'asta di estrazione per rimuovere il capillare dal tubo NMR da 2,5 millimetri avvitando delicatamente l'adattatore capillare per estrarlo dopo l'eutanasia degli animali, come discusso nel protocollo scritto.

Prepararsi per la biopsia epatica. Non utilizzare prodotti contenenti alcol per evitare contaminazioni e lavare gli strumenti utilizzando acqua o soluzione salina. Raccogliere le biopsie epatiche dal lobo sinistro per biopsie riproducibili.

Raccogliere costantemente al centro del lobo sinistro, evitando le zone periferiche dove il tessuto è più sottile. Fare attenzione a non perforare la cistifellea in caso di perdita di bile. Lavare immediatamente il fazzoletto con acqua o soluzione salina.

Congelare immediatamente le biopsie in azoto liquido e conservarle a meno 80 gradi Celsius fino all'analisi NMR Per impostare l'H-R-M-A-S-N-M-R, inserire la terza biopsia in un rotore di zirconio e riempire il resto del volume con acqua pesante pura per il blocco NMR. Fare attenzione a non formare bolle in quanto potrebbero alterare la qualità del successivo spessoramento e acquisizione dei dati. Inserire un distanziale in teflon da 50 microlitri utilizzando la vite cilindrica.

Svitarlo e calibrarlo utilizzando il profondimetro sul lato corto. Posizionare il perno filettato sul distanziatore e avvitarlo delicatamente con il cacciavite. Dry house, eventuale acqua residua con un pezzo di tessuto.

Quindi, posizionare il tappo nella parte superiore del rotore e inserirlo nel rotore packer. Premere con decisione fino a quando il tappo non è in posizione. Non dovrebbe esserci spazio tra il rotore e il suo cappuccio, segnare metà della parte inferiore del rotore utilizzando un pennarello nero per consentire il rilevamento ottico della velocità di rotazione.

Una volta che il rotore è stato sufficientemente imballato, posizionarlo all'interno dello spettrometro NMR e iniziare a girare fino a cinque kilohertz. Qui. Viene utilizzato uno spettrometro a tre da 500 megahertz. Acquisire lo spettro NMR del protone utilizzando una sequenza di impulsi CP MG.

Secondo le linee guida del produttore, l'abbondante picco di doppietto alfa e numerico del glucosio a 5,22 parti per milione potrebbe essere utilizzato per calibrare gli spettri NMR risultanti. Per disimballare il rotore, procedere rimuovendo il tappo, utilizzando il rimuovi tappo, svitare il perno filettato e rimuovere il distanziale in teflon. Utilizzando la vite cilindrica, l'apparecchio può essere lavato accuratamente con acqua e detersivo.

La comparsa di cometaboliti microbici intestinali durante il processo di colonizzazione è chiaramente illustrata in questo spettro protonico di un profilo metabolico urinario per un animale colonizzato da 20 giorni. Questo animale non ha espulso solfato docile e quantità molto piccole di fenil acetil glicina, PAG abbreviato e solfato di cellule que allo stato privo di germi. Con il progredire della colonizzazione, questi tre marcatori del metabolismo proteico da parte del microbiota intestinale aumentano considerevolmente e raggiungono un equilibrio al giorno 20

Integrando il picco specifico della tripletta PAG, è stato possibile quantificare l'aumento di questo particolare marcatore nel tempo. Questo diagramma rappresenta la concentrazione media di PAG durante la colonizzazione per un gruppo di sette animali utilizzando la spettroscopia protonica H-R-M-A-S-N-M-R, il profilo metabolico epatico di due topi prima e dopo la colonizzazione. Questa figura illustra bene le informazioni che possono essere derivate dal profilo metabolico basato su A-M-A-S-N-M-R.

È possibile visualizzare numerosi aminoacidi e metaboliti derivati dal metabolismo energetico. Questi profili contengono anche informazioni rilevanti per lo stress ossidativo, il metabolismo dei nucleotidi e il metabolismo delle metilammine. In questo esempio, è molto chiaro che il topo privo di germi non mostra quasi nessun glicogeno e quantità molto basse di glucosio e trigliceridi.

Quindi, seguendo questa procedura, è possibile applicare più strumenti statistici come la chemioterapia per raggruppare campioni logici in base al profilo metabolico ed evidenziare i biomarcatori associati allo stato metabolico.