Valutare alterazioni metaboliche epatiche durante la colonizzazione progressiva di Germe senza mouse da ¹ H spettroscopia NMR

Lo scopo di questa procedura è valutare l'impatto di una colonizzazione progressiva sul metabolismo epatico dell'ospite. Questo viene ottenuto innanzitutto colonizzando progressivamente topi privi di germi. Il processo di colonizzazione viene monitorato valutando l'escrezione urinaria di co-metaboliti microbici mediante spettroscopia NMR.

Dopo il monitoraggio del processo di colonizzazione, viene prelevata una biopsia epatica dal topo e preparata per il profilo metabolico. Il profilo metabolico epatico può quindi essere ottenuto dalla biopsia integra mediante spettroscopia NMR ad alta risoluzione con rotazione dell'angolo magico non distruttiva. In definitiva, l'uso della spettroscopia NMR del protone rivela vari metaboliti coinvolti in vie metaboliche come quelle dell'energia e dello stress ossidativo.

Questo esperimento può fornire informazioni sulle funzioni epatiche durante la colonizzazione. Può inoltre essere applicato ad altri sistemi, come il rene. Per colonizzare gli animali, rimuovere i topi germ-free dagli isolatori e allevarli in una stanza convenzionale per l'allevamento, all'interno di gabbie dotate di filtro, posizionate davanti agli animali convenzionali che fungono da controllo.

Quindi mescolare metà di una lettiera di tre giorni prelevata dalla gabbia convenzionale di controllo con la lettiera degli animali privi di germi. Raccogliere l'urina in una microprovetta da 1,5 millilitri manipolando il topo sopra la provetta e aiutando con un leggero massaggio intestinale. È richiesto un minimo di 20 microlitri per l'acquisizione con una sonda NMR da cinque millimetri, ma si consiglia di utilizzare 30 microlitri per migliorare la qualità del profilo metabolico. Congelare immediatamente l'urina in azoto liquido e conservarla ad almeno meno 40 gradi Celsius fino all'analisi NMR.

Prima dell'acquisizione NMR, preparare una soluzione tampone di fosfato di sodio 0,2 molare in acqua pesante. pH 7,4 contenente TSP 1 millimolare; mescolare 30 microlitri di urina con 30 microlitri di tampone fosfato di sodio. Trasferire 50 microlitri della soluzione mescolata in un tubo capillare NMR da 1,7 millimetri utilizzando una siringa di vetro da 50 microlitri dotata di ago metallico.

Prestare attenzione a evitare bolle d'aria. Applicare l'adattatore capillare sulla sommità del capillare contenente il campione di urina e inserirlo in una provetta micro NMR da 2,5 millimetri per una sonda NMR da cinque millimetri. Questa combinazione di provette può essere utilizzata come una normale provetta NMR da cinque millimetri per l'acquisizione degli spettri.

In questa dimostrazione, viene utilizzato uno spettrometro NMR Bruer avanzato a 700 megahertz per acquisire i dati. Acquisire spettri NMR monodimensionali del protone utilizzando i parametri descritti nel protocollo scritto. Dopo l'acquisizione NMR, utilizzare l'asta di estrazione per rimuovere la capillare dal tubo NMR da 2,5 millimetri avvitando delicatamente l'adattatore capillare per estrarla, dopo l'eutanasia degli animali come descritto nel protocollo scritto.

Prepararsi per la biopsia epatica. Non utilizzare alcun prodotto contenente alcol per evitare contaminazioni e lavare gli strumenti con acqua o soluzione salina. Eseguire le biopsie epatiche dal lobo sinistro per ottenere campioni riproducibili.

Raccogliere sempre nel centro del lobo sinistro, evitando le aree periferiche dove il tessuto è più sottile. Prestare attenzione a non perforare la colecisti in caso di fuoriuscita di bile. Lavare immediatamente il tessuto con acqua o soluzione salina.

Congelare rapidamente i campioni in azoto liquido immediatamente dopo il prelievo e conservarli a meno 80 gradi Celsius fino all'analisi mediante NMR. Per preparare l'H-R-M-A-S-N-M-R, inserire il terzo campione in un rotore in zirconio e riempire il volume rimanente con acqua pesante pura per il blocco NMR. Prestare attenzione a non formare bolle d'aria, poiché potrebbero alterare la qualità del successivo shim e dell'acquisizione dei dati. Inserire un distanziale in Teflon da 50 microlitri utilizzando la vite cilindrica.

Svitare e calibrare utilizzando il misuratore di profondità sul lato corto. Posizionare il perno filettato sul distanziale e avvitare delicatamente con il cacciavite. Asciugare l'abitacolo, rimuovendo qualsiasi residuo d'acqua con un pezzo di carta da laboratorio.

Successivamente, posizionare il cappuccio sulla sommità del rotore e inserirlo nel compattatore del rotore. Premere con fermezza fino a quando il cappuccio non è ben posizionato. Non deve rimanere alcuno spazio tra il rotore e il suo cappuccio. Contrassegnare con una penna marcata nera metà della parte inferiore del rotore per consentire il rilevamento ottico della velocità di rotazione.

Una volta che il rotore è stato sufficientemente riempito, posizionarlo all'interno dello spettrometro NMR e avviare la rotazione a cinque kilohertz. Qui viene utilizzato uno spettrometro Bruker Avance III da 500 megahertz. Acquisire lo spettro NMR del protone utilizzando una sequenza d'impulsi CP MG.

Secondo le indicazioni del produttore, l'intenso picco doppietto del glucosio alfa e numerico a 5,22 parti per milione può essere utilizzato per calibrare gli spettri NMR risultanti. Per aprire il rotore, procedere rimuovendo il cappuccio con l'apposito strumento, svitare il perno filettato ed estrarre lo spaziatore in teflon. Utilizzando la vite cilindrica, l'apparecchio può essere lavato accuratamente con acqua e detergente.

L'apparizione dei co-metaboliti microbici intestinali durante il processo di colonizzazione è chiaramente illustrata in questo spettro protonico di un profilo metabolico urinario per un animale colonizzato da 20 giorni. Questo animale non escretava alcun solfato indolico e quantità molto ridotte di fenilacetilglicina, abbreviata PAG, e solfato di quecella allo stato privo di germi. Man mano che la colonizzazione progredisce, questi tre marcatori del metabolismo proteico da parte della microbiota intestinale aumentano notevolmente e raggiungono un equilibrio al giorno 20.

Integrando il picco specifico del tripletto PAG, è stato possibile quantificare l'aumento di questo particolare marcatore nel tempo. Questo diagramma rappresenta la concentrazione media di PAG durante la colonizzazione in un gruppo di sette animali mediante spettroscopia protonica H-R-M-A-S-N-M-R; il profilo metabolico epatico di due topi prima e dopo la colonizzazione è stato ottenuto. Questa figura illustra chiaramente le informazioni che possono essere ricavate da un profilo metabolico basato su A-M-A-S-N-M-R.

È possibile visualizzare numerosi aminoacidi e metaboliti derivati dal metabolismo energetico. Questi profili contengono anche informazioni relative allo stress ossidativo, al metabolismo dei nucleotidi e al metabolismo delle metilammine. In questo esempio, è molto evidente che il topo privo di germi mostra quasi nessun glicogeno e quantità molto basse di glucosio e trigliceridi.

Seguendo questa procedura, è possibile applicare diversi strumenti statistici, come ad esempio chemo, al fine di raggruppare campioni omogenei in base al profilo metabolico ed evidenziare i biomarcatori associati allo stato metabolico.