Name: Isolamento del Vampiro di liquido extracellulare da Caenorhabditis elegans (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Impara a isolare il liquido extracellulare da Caenorhabditis elegans per studiare la composizione del fluido pseudocelomico e i meccanismi di segnalazione RNAi. Questa tecnica innovativa permette analisi dirette dello spazio extracellulare.

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Vorremmo riconoscere la natura collaborativa del laboratorio Hunter, e li ringrazio per la discussione è stata utile e l&#39;assistenza che ha reso lo sviluppo di questa tecnica possibile e divertente. Vorremmo ringraziare Nigel Delaney e il Caenorhabditis Genetica Centro per la vite senza fine e ceppi batterici. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health GM089795 sovvenzione CPH.

<ol><li>Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Stable+Transgenic+C.+elegans+Using+Microinjection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection.</a> J. Vis. Exp. (18), e833-e833 (2008).</li>
<li>Hirose, T., Nakano, Y., Nagamatsu, Y., Misumi, T., Ohta, H., Ohshima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+GMP-dependent+protein+kinase+EGL-4+controls+body+size+and+lifespan+in+C+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cyclic GMP-dependent protein kinase EGL-4 controls body size and lifespan in C elegans.</a> Development. 130, 1089-1099 (2003).</li>
<li>Kimble, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+cell+lineage+following+laser+ablation+of+cells+in+the+somatic+gonad+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Alterations in cell lineage following laser ablation of cells in the somatic gonad of Caenorhabditis elegans.</a> Dev. Biol. 87, 286-300 (1981).</li>
<li>Hegreness, M., Shoresh, N., Hartl, D., Kishony, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+equivalence+principle+for+the+incorporation+of+favorable+mutations+in+asexual+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">An equivalence principle for the incorporation of favorable mutations in asexual populations.</a> Science. 311, 1615-1617 (2006).</li>
<li>Labrousse, A., Chauvet, S., Couillault, C., Kurz, C. L., Ewbank, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+is+a+model+host+for+Salmonella+typhimurium%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans is a model host for Salmonella typhimurium.</a> Curr. Biol. 10, 1543-1545 (2000).</li>
<li>Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effectiveness+of+specific+RNA-mediated+interference+through+ingested+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genome.+Biol%22%5BJournal%5D)">Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Genome. Biol. 2, (2001).</li>
<li>Min, K., Kang, J., Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+feeding+RNAi+method+for+simultaneous+knock-down+of+more+than+one+gene+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">A modified feeding RNAi method for simultaneous knock-down of more than one gene in Caenorhabditis elegans.</a> Biotechniques. 48, 229-232 (2010).</li>
<li>Zhuang, J. J., Hunter, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specificity+of+Caenorhabditis+elegans+Enhanced+RNAi+Mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Tissue-specificity of Caenorhabditis elegans Enhanced RNAi Mutants.</a> Genetics. 188 (1), 235-237 (2011).</li>
<li>Way, J. C., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mec-3%2C+a+homeobox-containing+gene+that+specifies+differentiation+of+the+touch+receptor+neurons+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">mec-3, a homeobox-containing gene that specifies differentiation of the touch receptor neurons in C. elegans.</a> Cell. 54, 5-16 (1988).</li>
<li>Kamath, R. S., Fraser, A. G., Dong, Y., Poulin, G., Durbin, R., Gotta, M., Kanapin, A., Bot, N. L. e, Moreno, S., Sohrmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+functional+analysis+of+the+Caenorhabditis+elegans+genome+using+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi.</a> Nature. 421, 231-237 (2003).</li>
<li>Winston, W. M., Molodowitch, C., Hunter, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+RNAi+in+C.+elegans+requires+the+putative+transmembrane+protein+SID-1%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Systemic RNAi in C. elegans requires the putative transmembrane protein SID-1.</a> Science. 295, 2456-2459 (2002).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Abbiamo qui presentato un nuovo metodo che permette l&#39;isolamento e la caratterizzazione di liquido extracellulare dal modello dell&#39;organismo C. elegans. La tecnica inizia con la manipolazione genetica o fisica di vermi donatori di aumentare il volume totale di fluido extracellulare. Liquido extracellulare è quindi isolato utilizzando una tecnica di microiniezione modificato. I vermi sono montati a secco per microiniezione utilizzando tamponi agarosio per tenere i vermi ancora durante la procedura. L&#39...

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; Giorno</strong</td&gt;<td<strong&gt; Worm Prep</strong</td&gt;<td<strong&gt; Materiale Prep</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; -7 O prima</td&gt;<td&gt; Mantenere pulito, ben nutrito<em&gt; Clr-1 (e1745)</em&gt; E N2 vermi</td&gt;<td&gt; Accertarsi che gli elettrodi di iniezione, piatti, NGM NGM + Carb / piastre di IPTG, OP50 magazzino LB</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; -6</td&gt;<td</td&gt;<tdStreak&gt; out RNAi cibo su LB + Carb</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; -5</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; Inoculare 3 mL durante la notte con RNAi cibo</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; -4</td&gt;<td&gt; Sposta embrioni per RNAi piastra</td&gt;<td&gt; Seed RNAi piastra</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; -3</td&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; -2</td&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; -1</td&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 0</td&gt;<td&gt; Spostare vermi a 25 per 4 ore</td&gt;<td&gt; Crea piastre di saggio</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td</td&gt;<td&gt; Sposta worm per pulire le piastre NGM</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td</td&gt;<td&gt; Vampiric trasferimento</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td</td&gt;<td&gt; Recupera destinatario</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; +1</td&gt;<td&gt; Rimuovi destinatario del trasferimento</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; +2</td&gt;<td&gt; Risultato Progeny</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table&gt;<p class="jove_content"<strong&gt; Tabella 1.</strong&gt; Timeline Preparazione del materiale.</p&gt;<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; Attrezzatura</strong</td&gt;<td<strong&gt; Azienda</strong</td&gt;<td<strong&gt; Numero di catalogo</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Picolitri pressione Iniettore</td&gt;<td&gt; Warner Instruments</td&gt;<td&gt; 65-0001 (PLI-100)</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Flaming / Brown micropipetta estrattore</td&gt;<td&gt; Sutter Instruments</td&gt;<td&gt; P97</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Axiovert 200</td&gt;<td&gt; Zeiss</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td colspan="3"<strong&gt; Reagenti</strong&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Olio minerale</td&gt;<td&gt; EM Scienza</td&gt;<td&gt; MX1560-1</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 22x50 n ° 1 ½ vetro di copertura</td&gt;<td&gt; Corning</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; SeaKem LE agarosio</td&gt;<td&gt; Lonza</td&gt;<td&gt; 50004</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Vetro borosilicato Capillari</td&gt;<td&gt; Mondo Precisazioni Instruments</td&gt;<td&gt; 1B100F-4</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Soluzione di ipoclorito di sodio (5% di cloro attivo)</td&gt;<td&gt; JT Baker</td&gt;<td&gt; 9416-01</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td colspan="3"<strong<em&gt; C. elegans</em&gt; E ceppi batterici</strong&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td<em&gt; Clr-1 (e1745) II</em&gt;<sup&gt; 9</sup</td&gt;<td&gt; Il Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td&gt;<td&gt; CB3241</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td<em&gt; GLP-1</em&gt; RNAi vettore<sup&gt; 10</sup&gt;</td&gt;<td&gt; Fonte Bioscience (Biblioteca Alimentazione Ahringer)</td&gt;<td&gt; F02A9.6</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td<em&gt; Pal-1</em&gt; RNAi vettore<sup&gt; 11</sup&gt;</td&gt;<td&gt;</td&gt;<td&gt; PHC187</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; OP50-GFP<sup&gt; 5</sup&gt;</td&gt;<td&gt; Il Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td&gt;<td&gt; OP50-GFP</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; YFP<em&gt; E. coli</em&gt;<sup&gt; 4</sup&gt;</td&gt;<td&gt;</td&gt;<td&gt; MC4100-YFP</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table&gt;<p class="jove_content"<strong&gt; Tabella 2.</strong&gt; Reagenti e attrezzature specifiche.</p

isolamento del vampiro di liquido extracellulare da<em&gt; caenorhabditis elegans</em

Vampiric Isolation of Extracellular Fluid from Caenorhabditis elegans

Il modello di organismo geneticamente trattabili C. elegans ha fornito dei chiarimenti in una miriade di questioni biologiche, attivata per il suo tempo di generazione breve, la facilità di crescita e di piccole dimensioni. Questa piccola dimensione, però, è non riconosciute una serie di approcci tecnici che si trovano in altri sistemi modello. Ad esempio, le trasfusioni di sangue nei sistemi di mammiferi e le tecniche di innesto delle piante consentono domande di composizione del sistema circolatorio e di segnalazione. Il sistema circolatorio del worm, il pseudoceloma, finora è stato impossibile per il dosaggio direttamente. Per rispondere alle domande di segnalazione intercellulare e circolatorio sistema di composizione C. elegans ricercatori hanno tradizionalmente rivolto a un&#39;analisi genetica, cellule / tessuti soccorso specifico e analisi mosaico. Queste tecniche forniscono un mezzo per inferire ciò che avviene tra le cellule, ma non sono universalmente applicabili identificazione e caratterizzazione di molecole extracellulari. Qui vi presentiamo una newly tecnica sviluppata per dosaggio direttamente il fluido pseudocoelomic di C. elegans. La tecnica inizia con uno manipolazione genetica o fisica per aumentare il volume di fluido extracellulare. Successivamente gli animali sono sottoposti ad una tecnica di microiniezione vampirica inversa usando un&#39;attrezzatura microiniezione che permette il controllo della pressione ammenda equilibrio. Dopo l&#39;isolamento del fluido extracellulare, il fluido raccolto può essere saggiata mediante trasferimento in altri animali o per mezzo molecolari. Per dimostrare l&#39;efficacia di questa tecnica presentiamo un approccio dettagliato per analizzare un esempio specifico di molecole segnale extracellulari, dsRNA lungo durante una risposta sistemica RNAi. Anche se la caratterizzazione di RNAi sistemica è una prova di principio esempio, vediamo come questa tecnica adattabile a rispondere a una serie di domande di composizione del sistema circolatorio e di segnalazione.

Il modello di organismo<em&gt; C. elegans</em&gt; Utilizza fluido pseudocoelomic come sistema circolatorio passiva. Saggio diretto di questo fluido non è stato possibile in precedenza. Qui presentiamo una nuova tecnica per direttamente dosaggio spazio extracellulare, e utilizzare segnali silenziamento sistemici durante una risposta RNAi come prova di principio esempio.

Isolamento del Vampiro di liquido extracellulare da<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

L'organismo modello geneticamente trattabile C. elegans ha permesso di approfondire una moltitudine di quesiti biologici, grazie al suo breve tempo di generazione, ...

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare il liquido extracellulare per rispondere a domande riguardanti la composizione, la natura e la funzione di un fluido apparente, come ad esempio quelle relative alla segnalazione mediata da RNA nell'occhio. Questo viene ottenuto innanzitutto nutrendo i vermi con batteri che esprimono RNA a doppio filamento (DS RNA), il che determina un fenotipo di interferenza dell'RNA (RNAi) facilmente osservabile. Successivamente, si permette ai vermi di diffondere segnali di silenziamento mediati da RNAi in tutto l'organismo.Successivamente, il volume totale del liquido extracellulare disponibile viene aumentato. Infine, un ago da microiniezione viene utilizzato per prelevare il liquido extracellulare e iniettarlo in un verme naive per l'RNAi. In definitiva, la presenza di segnali di silenziamento dell'RNAi può essere dimostrata analizzando la prole dei vermi iniettati.Attraverso questo metodo, possiamo analizzare la composizione del fluido extracellulare per ottenere informazioni non solo sull'RNAi sistemico, ma anche su una varietà di vie di segnalazione intercellulare. In generale, le persone alle prime armi con questa tecnica incontreranno di

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Questo video descrive un metodo per dissociare vermi interi in una sospensione a singola cellula adatta per FACS o immunoprecipitazione di cellule intatte.

Dissociazione a singola cellula di Caenorhabditis elegans: un metodo per isolare le cellule vive

Fonte: Petersen, C. et al., Isolamento e caratterizzazione del microbiota naturale del nematode modello Caenorhabditis elegans. J. Vis. Esp. (2022)Questo video dimostra l'isolamento e la coltivazione di specie batteriche associate a Caenorhabditis elegans. Una lisi a perla di C. elegans, seguita da una coltura selettiva, consente l'isolamento di diversi ceppi microbici per ulteriori analisi.

Isolamento e coltivazione di Caenorhabditis elegans-Batteri associati

Questo video dimostra l'isolamento di neuroni marcati in fluorescenza da Caenorhabditis elegans. Una sospensione cellulare è ottenuta da vermi transgenici ingegnerizzati per esprimere trasportatori transmembrana vescicolari fusi con proteine fluorescenti nei neuroni colinergici. I neuroni marcati in fluorescenza vengono quindi isolati utilizzando la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS) e mantenuti in coltura.

Isolamento di neuroni da Caenorhabditis elegans tramite smistamento cellulare attivato da fluorescenza

Qui, presentiamo un protocollo per un semplice isolamento di specifici gruppi di cellule neuronali vive che esprimono proteine fluorescenti verdi dalle linee transgeniche di Caenorhabditis elegans . Questo metodo consente una varietà di studi ex vivo focalizzati su neuroni specifici e ha la capacità di isolare le cellule per ulteriori colture a breve termine.

Isolamento di popolazioni di neuroni specifici da nematode Caenorhabditis elegans

Questo articolo presenta metodi per generare, purificare e quantificare le vesciche extracellulari di Caenorhabditis elegans elegans.

Purificazione e analisi di Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Il protocollo descrive una semplice progettazione di chip microfluidici e una metodologia di microfabbricazione utilizzata per coltivare C. elegans in presenza di una fornitura continua di cibo fino a 36 ore. Il dispositivo di crescita e imaging consente inoltre l'imaging intermittente ad alta risoluzione a lungo termine dei processi cellulari e subcellulari durante lo sviluppo per diversi giorni.

Un semplice chip microfluidico per la crescita a lungo termine e l'imaging di Caenorhabditis elegans

L'infezione di Caenorhabditis elegans da parte del parassita microsporidiano Nematocida parisii consente ai vermi di produrre prole altamente resistente allo stesso agente patogeno. Questo è un esempio di immunità ereditaria, un fenomeno epigenetico poco compreso. Il presente protocollo descrive lo studio dell'immunità ereditaria in un modello di verme geneticamente trattabile.

Studio dell'immunità ereditaria in un modello di infezione da microsporidi di Caenorhabditis elegans

Qui viene presentata una descrizione dell'isolamento semplice e relativamente rapido del DNA genomico di Caenorhabditis elegans da uno o pochi animali utilizzando un kit di tessuti disponibile in commercio. La preparazione del gDNA risultante è un modello adatto per la PCR.

Estrazione su piccola scala di Caenorhabditis elegans DNA genomico

Caenorhabditis elegans è una delle principali specie modello in biologia, ma quasi tutte le ricerche vengono eseguite in assenza dei suoi microbi naturalmente associati. I metodi qui descritti aiuteranno a migliorare la nostra comprensione della diversità dei microbi associati come base per la futura ricerca funzionale di C. elegans.

Isolamento e caratterizzazione del microbiota naturale del nematode modello Caenorhabditis elegans

Questo protocollo descrive un test per quantificare la velocità di alimentazione di Caenorhabditis elegans basato sulla misurazione della clearance dei batteri in coltura liquida.

Quantificazione dell'assunzione di cibo in Caenorhabditis elegans misurando la clearance batterica

Qui, descriviamo le condizioni di coltura in vitro , l'isolamento e l'aumento della generazione di vescicole extracellulari (EV) da Echinococcus granulosus. Le piccole vescicole extracellulari sono state caratterizzate dalla diffusione dinamica della luce e dalla microscopia elettronica a trasmissione. L'assorbimento da parte delle cellule dendritiche derivate dal midollo osseo e la loro modulazione fenotipica sono stati studiati mediante microscopia confocale e citometria a flusso.

Isolamento e captazione delle cellule dendritiche di piccole vescicole extracellulari da Echinococcus granulosus

Impara a isolare il liquido extracellulare da Caenorhabditis elegans per studiare la composizione del fluido pseudocelomico e i meccanismi di segnalazione RNAi. Questa tecnica innovativa permette analisi dirette dello spazio extracellulare.

Isolamento del Vampiro di liquido extracellulare da

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