Luce Correlativo e Microscopia Elettronica (CLEM) come strumento per visualizzare molecole microiniezione e dei loro sub-cellulari eucariotiche Obiettivi

L'obiettivo generale del seguente esperimento è introdurre piccole molecole o proteine marcate con un fluorocromo nel citoplasma di una cellula mammifera in coltura e osservare i cambiamenti morfologici indotti con una risoluzione che va da alcuni micrometri fino a diversi nanometri. Questo risultato si ottiene coltivando prima cellule mammifere su coprioggetti di vetro con griglia e microiniettando al loro interno una piccola molecola o una proteina di interesse marcate con un fluorocromo. Successivamente, le cellule vengono fissate con formaldeide e osservate e immaginate mediante microscopia a fluorescenza.

Successivamente, le cellule vengono fissate con glutaraldeide, sezionate, colorate e analizzate mediante microscopia elettronica. Infine, le immagini ottenute mediante microscopia fluorescente in campo chiaro e microscopia elettronica vengono combinate e allineate. In definitiva, la correlazione di queste immagini consente al ricercatore di visualizzare con alta risoluzione le perturbazioni indotte dalla piccola molecola o dalla proteina di interesse.

Ciao, sono il dottor Evan Reddick nel laboratorio del dottor Neil Alto del dipartimento di microbiologia presso il centro medico dell'Università del Texas Southwestern a Dallas. Oggi vi parlerò della procedura M Clem, ovvero la microscopia correlative di luce ed elettronica con microiniezione. Il principale vantaggio di questa procedura rispetto a tecniche isolate come la microiniezione o la microscopia è che qui esse vengono eseguite in combinazione e facilitate dall'uso di un coprivetro in vetro grigliato.

È questo vetrino con griglia che consente ai ricercatori di tornare alla stessa cellula durante diverse fasi del protocollo. Inoltre, questa tecnica permette al ricercatore di osservare cambiamenti architetturali subcellulari indotti da una vasta gamma di piccole molecole o proteine di interesse inoculabili, e di farlo con risoluzione che va dal micrometro a diversi nanometri. Per prepararsi all'iniezione microscopica, coltivare cellule come cellule renali di ratto normali o cellule di carcinoma cervicale immortalizzate su vetrini coprioggetto in vetro con griglia fotoincisa, fissati su piatti per cellule vive, e incubare le cellule a 37 gradi Celsius e 5%CO2.

A seconda della tempistica sperimentale da utilizzare, regolare la confluenza delle cellule. Una piastra completamente confluenziale renderà molto difficile l'identificazione delle cellule microiniettate al microscopio elettronico. Pertanto, seminare le cellule in modo che raggiungano circa il 50% di confluenza nel giorno di un esperimento breve e circa il 25% di confluenza per esperimenti più lunghi.

Nel giorno di un esperimento più lungo, preparare proteine marcate con fluorescenza, DNA o piccole molecole nel tampone appropriato fino a un volume finale di 50 microlitri. A seconda del fluorocromo scelto, aggiungere un colorante di tracciamento come rosso Texas o azzurro cascade. Aggiungere una concentrazione compresa tra 0,5 e 1 milligrammo per millilitro.

Filtrare la soluzione attraverso un filtro centrifugo da 0,22 micron. Dopo aver preparato le micropipette secondo le indicazioni del produttore, pipettare con attenzione alcuni microlitri di soluzione nell’estremità posteriore di una micropipetta. Inserire la micropipetta nel braccio del micromanipolatore di un dispositivo commerciale per microiniezioni collegato a un microscopio invertito.

Posizionare una piastra di cellule coltivate nel supporto della piastra del microscopio invertito. Individuare le cellule che crescono all'interno di una griglia fotoincisa e annotare l'identificatore alfanumerico della griglia. Questo verrà utilizzato in tutti i passaggi successivi.

È importante scegliere cellule per la microiniezione che siano aderenti vicino al centro del vetrino e evitare quelle situate in prossimità della periferia. Questo aspetto è fondamentale poiché garantisce un trasferimento efficiente delle cellule di interesse al centro in resina epon utilizzato successivamente per la microscopia elettronica. Abbassare manualmente il braccio di iniezione sopra il vetrino e utilizzare il micromanipolatore per abbassare l'ago fino a quando la punta tocca delicatamente la superficie delle cellule. Microiniettare una cellula sì e una no all'interno della griglia selezionata; per cellule coltivate a una confluenza di circa il 50%, ci si aspetta circa 80 cellule per una griglia di 600 micrometri quadrati, ottenendo così un valore N di circa 30-40 cellule sperimentali e controllate.

Dopo l'iniezione, riposizionare la piastra nell'incubatore per un periodo di tempo desiderato per eseguire la microscopia fluorescente. Rimuovere il mezzo di crescita e fissare le cellule con formaldeide in PBS a temperatura ambiente per 10 minuti. Sostituire il fissativo con un XPBS.

Quindi documentare la disposizione delle cellule acquisendo da cinque a dieci immagini in campo chiaro della griglia scelta a ingrandimento basso e alto. Per identificare le cellule microiniettate, acquisire immagini fluorescenti alle lunghezze d'onda di eccitazione e di emissione del colorante inerte utilizzato per l'iniezione. Utilizzando un microscopio confocale, raccogliere uno Zack di immagini delle cellule microiniettate ad alto ingrandimento all'interno della stessa griglia precedentemente analizzata.

È necessaria un'elevata magnificazione per correlare le immagini fluorescenti con le strutture subcellulari che verranno identificate mediante microscopia elettronica. Dopo l'acquisizione confocale, utilizzare un liquido per la rimozione del coprioggetto per staccare il coprioggetto dalla piastra e posizionarlo con il lato delle cellule rivolto verso l'alto in una nuova piastra contenente un XPBS. Procedere quindi con la preparazione per la microscopia elettronica.

Seguire le normali procedure di microscopia elettronica. Per fissare, colorare e disidratare i campioni, preparare la resina epon e posizionare il vetrino coprioggetto, con il lato delle cellule rivolto verso il basso, sopra un tubo riempito di resina epon. Lasciare polimerizzare la resina a 60 gradi Celsius per 24 ore.

Per rimuovere il vetrino coprioggetto dalla resina epon, immergerlo rapidamente in azoto liquido. Lo shock termico da 60 gradi Celsius a meno 196 gradi Celsius.

Stacca il coprioggetto dal tubo di resina. Attendere da cinque a dieci minuti, quindi recuperare il tubo, che ora è privo del coprioggetto. Sotto una lente stereoscopica, ispezionare la superficie della resina per individuare la griglia di interesse.

Utilizzando una lametta sterile o un bisturi, ridurre il blocco di epon in modo che solo la griglia di interesse si trovi all'apice del blocco; tagliare sezioni seriali con un ultramicrotomo. Contrastare le sezioni utilizzando acetato di uranile e citrato di piombo secondo protocolli standard. Individuare nuovamente le cellule desiderate al microscopio elettronico utilizzando la posizione relativa delle cellule come guida, servendosi delle immagini fluorescenti ad alta risoluzione acquisite in precedenza.

Individuare le regioni di interesse nel micrografo elettronico che corrispondono al segnale fluorescente. Utilizzare punti di riferimento come la posizione dell'eterocromatina e dell'involucro nucleare per determinare quale immagine fluorescente di Zack corrisponde alla sezione di microscopia elettronica a trasmissione (TEM). Ridurre l'opacità dell'immagine fluorescente al 50% e sovrapporla all'immagine TEM corrispondente, utilizzando un programma di elaborazione delle immagini come ImageJ o Adobe Photoshop.

Allinea le immagini regolando la scala mostrata. Di seguito i risultati ottenuti mediante microiniezione e microscopia correlative di luce ed elettronica. Questa immagine mostra la microfotografia in campo chiaro di cellule NRK in crescita su un coprioggetto di vetro con griglia incisa al laser.

Si noti le lettere di sfondo b e m utilizzate per identificare la griglia contenente le cellule iniettate. Le frecce indicano le due cellule identificate e analizzate mediante microscopia elettronica. Qui è mostrata un'immagine fluorescente del colorante inerte cascade blue utilizzato per identificare le cellule microiniettate.

Di seguito è mostrata una sovrapposizione dei segnali in campo chiaro e fluorescenti di una piccola molecola etichettata con ammina. Questo pannello rappresenta la correlazione tra microscopia fluorescente in campo chiaro e microscopia elettronica di una cellula iniettata. La freccia indica un punto fluorescente acquisito a maggiore ingrandimento in questo pannello.

Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come microiniettare una proteina di interesse e seguirne i cambiamenti morfologici subcellulari indotti, utilizzando la procedura di microiniezione Clem o la microscopia correlative tra luce ed elettroni.