Luce Correlativo e Microscopia Elettronica (CLEM) come strumento per visualizzare molecole microiniezione e dei loro sub-cellulari eucariotiche Obiettivi

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di introdurre piccole molecole o proteine marcate in fluorescenza nel citoplasma di una cellula di mammifero in coltura e di osservare i cambiamenti morfologici indotti da una risoluzione micrometrica a multinanometrica. Ciò si ottiene coltivando prima cellule di mammifero su vetrini di vetro grigliati e microiniettandole con una piccola molecola o proteina di interesse marcata in fluorescenza. Successivamente, le cellule vengono fissate in formaldeide e osservate e visualizzate utilizzando la microscopia a fluorescenza.

Quindi le cellule vengono fissate con glutaraldeide, sezionate, colorate e visualizzate utilizzando la microscopia elettronica. Infine, le immagini scattate durante la microscopia fluorescente in campo chiaro e la microscopia elettronica vengono combinate e allineate. In definitiva, la correlazione di queste immagini consente al ricercatore di visualizzare ad alta risoluzione le perturbazioni indotte dalla piccola molecola o proteina di interesse.

Ciao, sono il Dr.Evan Reddick nel laboratorio del Dr.Neil Alto nel dipartimento di microbiologia presso l'Università del Texas Southwestern Medical Center di Dallas. Oggi vi parlerò della procedura M Clem o della microscopia correlativa alla luce e all'elettronica con microiniezione. Il vantaggio principale di questa procedura rispetto alle tecniche autonome come la microiniezione o la microscopia, è che qui vengono eseguite di concerto e aiutate dall'uso di un vetrino di vetro a griglia.

È questo vetrino coprioggetto a griglia che consente ai ricercatori di tornare alla stessa cella durante diverse parti del protocollo. Inoltre, questa tecnica offre al ricercatore la capacità di osservare indurre cambiamenti architettonici subcellulari da un'ampia varietà di piccole molecole iniettabili o proteine di interesse, e di farlo da una risoluzione micrometrica a multi nanometrica. Per prepararsi alla microiniezione, le cellule di coltura come il rene di ratto normale o le cellule tumorali cervicali immortalizzate su vetrini a griglia fotoincisi apposti su due piastre di cellule vive, incubare le cellule a 37 gradi Celsius e al 5% di CO2.

A seconda della sequenza temporale sperimentale da utilizzare, regolare la cofluenza delle cellule. Una piastra completamente confluente renderà molto difficile l'identificazione delle micro cellule iniettate nel microscopio elettronico. Pertanto, le cellule del seme raggiungono circa il 50% di fluenza co il giorno di un breve esperimento e circa il 25% di fluenza.

Il giorno di un esperimento più lungo, preparare il DNA proteico marcato in fluorescenza o piccole molecole nel tampone appropriato fino a un volume finale di 50 microlitri. A seconda del colore Fluor scelto, aggiungi un colorante tracciante come il rosso Texas o il blu a cascata. Aggiungere una concentrazione da 0,5 a un milligrammo per millilitro.

Filtrare la soluzione attraverso un filtro centrifugo da 0,22 micron. Dopo aver estratto gli aghi per microiniezione seguendo le linee guida del produttore, pipettare con cura i microlitri di soluzione nella parte posteriore di un ago. Caricare l'ago nel braccio del micromanipolatore di un dispositivo di microiniezione commerciale collegato a un microscopio invertito.

Posizionare una capsula di cellule coltivate nel supporto per piastre del microscopio invertito. Trova le celle che crescono all'interno di una griglia fotoincisa e annota l'identificatore alfanumerico delle griglie. Questo verrà utilizzato in tutti i passaggi successivi.

È importante scegliere cellule per microiniezione che aderiscano vicino al centro del vetrino coprioggetto ed evitare quelle vicino alla periferia. Questo è importante in quanto garantirà un trasferimento efficiente delle cellule di interesse al centrotavola in resina epon utilizzato in seguito per la microscopia elettronica Manuale, abbassare manualmente il braccio di iniezione sopra il vetrino coprioggetti e utilizzare il micromanipolatore per abbassare l'ago fino a quando la punta tocca delicatamente la superficie delle cellule. Micro iniettare ogni altra cellula all'interno della griglia scelta per le cellule cresciute a circa il 50% di fluenza del Co ci si aspetta circa 80 cellule per griglia di 600 micrometri quadrati, che darà un N di circa 30-40 cellule sperimentali e controllate.

Dopo l'iniezione, riposizionare la piastra nell'incubatrice per il periodo di tempo desiderato per eseguire la microscopia a fluorescenza. Scartare il terreno di coltura e fissare le cellule con formaldeide in PBS a temperatura ambiente per 10 minuti. Sostituire il fissativo con un XPBS.

Quindi documenta la disposizione delle celle scattando da cinque a 10 immagini in campo chiaro della griglia scelta a basso e alto ingrandimento. Per identificare le micro cellule iniettate, acquisire immagini fluorescenti alle lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione dell'occhio del colorante a iniezione inerte. Utilizzando un microscopio confocale, raccogli uno Zack di immagini di micro cellule iniettate ad alto ingrandimento all'interno della stessa griglia precedentemente ripresa.

L'elevato ingrandimento è necessario per correlare le immagini fluorescenti con le strutture subcellulari che verranno identificate utilizzando la microscopia elettronica. Dopo l'imaging confocale, utilizzare un liquido per la rimozione del vetrino coprioggetto per separare il vetrino dalla piastra e posizionarlo con la cellula rivolta verso l'alto in una piastra di coltura fresca contenente un XPBS. Procedere all'elaborazione per la microscopia elettronica.

Essere dopo aver seguito i protocolli EM standard. Per fissare la macchia e disidratare i campioni, preparare la resina epon e posizionare la cella del vetrino coprioggetto con il lato rivolto verso il basso sopra una provetta riempita di resina eon. Lasciare polimerizzare la resina a 60 gradi Celsius per 24 ore.

Per rimuovere il vetrino coprioggetto dalla resina epon. Immergerlo rapidamente nell'azoto liquido. Lo shock termico da 60 gradi Celsius a 196 gradi Celsius negativi.

Rimuove il vetrino coprioggetto dal tubo resina. Attendere da cinque a 10 minuti, quindi recuperare il tubo, che ora è libero dal vetrino coprioggetto. Sotto un cannocchiale da dissezione, ispezionare la superficie della resina per individuare la griglia di interesse.

Usando una lama di rasoio sterile o un bisturi, taglia il blocco di epon in modo che solo la griglia di interesse sia all'apice del blocco con un taglio ultra microtone, le sezioni seriali del blocco tagliato usano acetato di orinatoio e citrato di piombo per contrastare le sezioni utilizzando protocolli standard. Riposizionare le cellule desiderate nel microscopio elettronico utilizzando il posizionamento relativo delle cellule come guida. Utilizzando le immagini fluorescenti ad alta risoluzione catturate in precedenza.

Identificare le regioni di interesse nella micrografia elettronica che corrispondono al segnale fluorescente. Usa punti di riferimento come la posizione dell'eterocromatina e l'inviluppo nucleare per determinare quale immagine fluorescente di Zack corrisponde alla fetta EM. Attualmente in fase di imaging con un programma di imaging come Image J o Adobe Photoshop, ridurre l'opacità dell'immagine fluorescente al 50% e sovrapporla all'immagine TEM corrispondente.

Allineare le immagini regolando la scala visualizzata. Ecco i risultati della microiniezione e della microscopia ottica ed elettronica correlata. Questa immagine mostra la micrografia in campo chiaro delle cellule NRK che crescono su un vetrino di copertura a griglia inciso al laser.

Notare le lettere di sfondo b e m utilizzate per identificare la griglia contenente le cellule iniettate. Le frecce indicano le due cellule identificate e visualizzate con la microscopia elettronica. Qui è mostrata un'immagine fluorescente della cascata di coloranti inerti di tracciamento blu utilizzata per identificare le micro cellule iniettate.

Ecco una sovrapposizione dei segnali di campo chiaro e fluorescente di una piccola molecola marcata con ammina. Questo pannello rappresenta la correlazione della microscopia fluorescente in campo chiaro e della microscopia elettronica di una cellula iniettata. La punta della freccia indica i punti fluorescenti ripresi con un ingrandimento maggiore in questo pannello.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come microiniettare una proteina di interesse e tracciare i suoi cambiamenti morfologici subcellulari che induce utilizzando la procedura di microiniezione Clem o la microscopia ottica ed elettronica correlata.