Chiuso flusso degli acidi nucleici Citometria fluorescenza In situ Ibridazione (LNA flow-FISH): un metodo per la rilevazione dei batteri piccoli RNA

L'obiettivo generale di questa procedura è rilevare l'espressione dell'RNA batterico in singole cellule batteriche. Questo viene ottenuto innanzitutto progettando una sonda con acido nucleico bloccato, o LNA, modificata con biotina TEG all'estremità cinque prime. Dopo aver fissato le cellule batteriche, trattarle con dathyl, percarbonato o dsy e quindi renderle permeabili, si denatura l'RNA e si ibridizza la sonda LNA.

In terza fase, le cellule vengono lavate, bloccate e colorate. Infine, la fluorescenza cellulare viene misurata mediante citometria a flusso. In ultima analisi, è possibile valutare le variazioni nell'espressione dell'RNA nel tempo e all'interno delle popolazioni.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali riguardo la presenza relativa e l'abbondanza di specie di RNA all'interno di una singola cellula, e il grado in cui questa espressione varia all'interno di popolazioni omogenee o eterogenee. Sebbene questo metodo venga attualmente utilizzato per monitorare l'espressione di RNA batterici di piccole dimensioni, in teoria può essere impiegato per rilevare RNA in potenzialmente qualsiasi tipo cellulare. Dopo aver progettato la sequenza della sonda LNA, utilizzare blast per verificare che la sonda sia specifica soltanto per l'sRNA o l'mRNA di interesse.

Quando si ordina la sonda, aggiungere una modifica biotina TEG all'estremità cinque primi dell'oligonucleotide LNA. La biotinilazione è necessaria per la colorazione post ibridazione con un coniugato streptavidina-ei. Nel metodo devono essere inclusi tre controlli negativi: uno A, controllo senza LNA, in cui la sonda LNA non viene aggiunta durante l'ibridazione.

Passaggio due, un controllo senza colorante in cui la sonda LNA viene ibridata all'SRNA bersaglio, ma l'evento di ibridazione non viene rilevato a causa dell'assenza del colorante fluorescente. E tre, un controllo per SRNA o mRNA non espresso che utilizza una sonda LNA rivolta a un SRNA inesistente o non espresso, al fine di monitorare l'ibridazione non specifica. Iniziare raccogliendo 1 × 10⁸ cellule del batterio di interesse e trasferendole in un tubo microcentrifuga da 1,5 millilitri. Quindi, pellettare le cellule batteriche a 2300 × g per cinque minuti dopo la centrifugazione.

Rimuovere il sovranatante mediante pipettaggio e non per decantazione. Successivamente, risospendere il pellet in 400 microlitri di PBS, aggiungere 400 microlitri di soluzione fissante A PFA acido acetico PBS e mescolare bene le cellule. Incubare quindi la sospensione per 10 minuti a 25 gradi Celsius.

Vortexare una volta dopo cinque minuti, dopo aver centrifugato nuovamente le cellule. Questa volta a 4.500 ×g per due minuti. Lavare il pellet due volte con 400 µL di PBS.

Infine, risospendere il pellet in 400 microlitri di PBS e conservare le cellule ormai fissate a quattro gradi per un massimo di sette giorni. Iniziare aggiungendo 400 microlitri di una soluzione di paraformaldeide appena preparata allo 0,1% a ciascun campione di cellule batteriche fissate, quindi mescolare accuratamente le sospensioni cellulari mediante pipettaggio.

Incubare questa miscela per 12 minuti a 25 gradi Celsius, quindi dopo aver lavato le cellule due volte con 400 microlitri di PBS, aggiungere 800 microlitri di una soluzione di lisozima appena preparata alle cellule. Mescolare accuratamente la soluzione di cellule e lisozima mediante vortex e incubare le cellule per 30 minuti a 25 gradi Celsius con mescolamento occasionale. Dopo aver centrifugato le cellule, aggiungere 800 microlitri di una soluzione di proteinasi K appena preparata al pellet e mescolare accuratamente la soluzione di cellule risospese mediante pipettaggio.

Incubare le cellule per 15 minuti a 25 gradi Celsius, eseguendo una vortexazione a metà del periodo di incubazione dopo aver centrifugato e lavato le cellule con 400 microlitri di PBS; quindi risospendere le cellule in altri 400 microlitri di PBS e aggiungere 100 microlitri della sospensione in quattro tubi microcentrifughi separati da 1,5 millilitro, poi raccogliere le cellule e scartare i soprannatanti. A questo punto, incubare tutti e quattro i campioni in 100 microlitri ciascuno di buffer di ibridazione a 60 gradi Celsius per 60 minuti. Al termine dell'ibridazione, aggiungere un millilitro di SSC più tween 20 o SSCT alla miscela di ibridazione per consentire la rimozione delle cellule dalla soluzione viscosa di ibridazione.

Dopo la centrifugazione, aggiungere 200 microlitri di soluzione di formammide SSCT ai pellet e mescolare accuratamente. Incubare quindi i campioni per 30 minuti a 65 gradi Celsius in un blocco riscaldante. Aggiungere ora un millilitro di SSCT alla miscela e, dopo aver centrifugato nuovamente le cellule, risospendere le cellule in 500 microlitri di SSCT e incubare la soluzione cellulare per 40 minuti sul blocco riscaldante.

Dopo la centrifugazione, aggiungere 200 microlitri di buffer di blocco ai pellet di cellule ibridate e quindi incubare le cellule per 30 minuti a 25 gradi Celsius. Dopo una nuova centrifugazione, aggiungere nuovamente 50 microlitri di una soluzione di avidina priva di colorante e colorante ai pellet e mescolare accuratamente per il controllo senza colorante. Aggiungere 50 microlitri di buffer di blocco.

Incubare solo tutti i campioni per altri 12 minuti a 25 gradi Celsius con mescolamento costante in un termoagitatatore, proteggendo i tubi dalla luce mediante carta d'alluminio. Successivamente, lavare le cellule una volta con 500 microlitri di tampone SSCT e una volta con 400 microlitri di PBS con tween 20 o PBST. Dopo aver rimosso i soprannatanti, aggiungere 100 microlitri di antis biotinilati, strippin e PBS per 30 minuti a 25 gradi Celsius con mescolamento occasionale; questo anticorpo si legherà al coniugato strippin DI introdotto nel passaggio precedente.

Quindi, dopo la centrifugazione e il lavaggio delle cellule due volte con 400 microlitri di PBST, colorare una seconda volta aggiungendo 50 microlitri della soluzione di avidina priva di colorante alle cellule e mescolare accuratamente. Questo passaggio aumenta il segnale emesso per sonda LNA ibridata nel controllo senza colorante. Aggiungere nuovamente solo 50 microlitri di buffer bloccante, quindi incubare tutte le provette per 12 minuti a 25 gradi Celsius con mescolamento costante in un termomixer.

Dopo l'incubazione con la soluzione colorante, lavare nuovamente le cellule con 500 microlitri di buffer SSCT e successivamente con 400 microlitri di PBST dopo il secondo lavaggio. Sospendere il pellet in 200 microlitri di PBST e conservare le cellule a quattro gradi Celsius fino al momento dell'analisi mediante citometria a flusso. Per le cellule batteriche di dimensioni ridotte, impostare la velocità di flusso del citometro al minimo per ridurre le dimensioni del flusso centrale. Inoltre, per i citometri a flusso dotati di soglia di cutoff nello scatter anteriore, impostare la soglia al valore più basso possibile per garantire il rilevamento delle cellule batteriche di piccole dimensioni.

Un esempio di cellule fissate e permeabilizzate in modo efficace è mostrato qui in questo grafico a dispersione di citometria a flusso utilizzando le condizioni appena descritte. Per la permeabilizzazione, la popolazione cellulare è piccola e omogenea, indicando la presenza di pochi aggregati cellulari. Tuttavia, quando vengono utilizzate concentrazioni più elevate di lisozima, le cellule tendono maggiormente ad aggregarsi e mostrano valori aumentati dello scattering in avanti, indicativi di particelle più grandi, come osservabile in questo grafico a dispersione.

Di seguito è riportato un esempio di dati di citometria a flusso provenienti da un esperimento di LNA flow FISH riuscito. L'istogramma mostra la rilevazione specifica di un SRNA bersaglio insieme a tre controlli negativi. Il controllo negativo senza colorante, in viola, produce la minore fluorescenza, seguito rispettivamente dai controlli negativi senza LNA e con SRNA non espresso, in blu e rosso.

Infine, il campione con la sonda LNA specifica per SRNA produce la maggiore fluorescenza in nero. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in circa sei ore se effettuata correttamente. Inoltre, questa tecnica fornisce maggiori informazioni ed è più conveniente rispetto alla R-T-P-C-R.

Seguendo questa procedura, sonde aggiuntive possono essere marcate con altri HAPS e aggiunte durante il passaggio di ibridazione per consentire la rilevazione multiplex di RNA.I.