Name: Il Ex vivo Preparazione isolato microvasi scheletrico per le Indagini di reattività vascolare (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min
Description: Impara a isolare e cannulare arteriole di resistenza ex vivo per studiare la reattività vascolare. Questo metodo permette di valutare le risposte a stimoli farmacologici e le proprietà strutturali dei vasi.

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Questo lavoro è stato sostenuto dalla American Heart Association (EIA 0740129N) e NIH T32 HL90610.

<ol><li>Goodwill, A. G., Frisbee, S. J., Stapleton, P. A., James, M. E., Frisbee, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+Chronic+Anticholesterol+Therapy+on+Development+of+Microvascular+Rarefaction+in+the+Metabolic+Syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Impact of Chronic Anticholesterol Therapy on Development of Microvascular Rarefaction in the Metabolic Syndrome.</a> Microcirculation. , 1-18 (2009).</li>
<li>Goodwill, A. G., James, M. E., Frisbee, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+vascular+thromboxane+generation+impairs+dilation+of+skeletal+muscle+arterioles+of+obese+Zucker+rats+with+reduced+oxygen+tension%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Increased vascular thromboxane generation impairs dilation of skeletal muscle arterioles of obese Zucker rats with reduced oxygen tension.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 295, H1522-H1528 (2008).</li>
<li>Samora, J. B., Frisbee, J. C., Boegehold, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth-dependent+changes+in+endothelial+factors+regulating+arteriolar+tone%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Growth-dependent changes in endothelial factors regulating arteriolar tone.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 292, H207-H214 (2007).</li>
<li>Samora, J. B., Frisbee, J. C., Boegehold, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen+peroxide+emerges+as+a+regulator+of+tone+in+skeletal+muscle+arterioles+during+juvenile+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Hydrogen peroxide emerges as a regulator of tone in skeletal muscle arterioles during juvenile growth.</a> Microcirculation. 15, 151-161 (2008).</li>
<li>Samora, J. B., Frisbee, J. C., Boegehold, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+myogenic+responsiveness+of+skeletal+muscle+arterioles+with+juvenile+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Increased myogenic responsiveness of skeletal muscle arterioles with juvenile growth.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 294, 2344-2351 (2008).</li>
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<li>Fredricks, K. T., Liu, Y., Lombard, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+of+extraparenchymal+resistance+arteries+of+rat+skeletal+muscle+to+reduce+PO2%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Response of extraparenchymal resistance arteries of rat skeletal muscle to reduce PO2.</a> Am. J. Physiol. 267, H706-H715 (1994).</li>
<li>Durand, M. J., Raffai, G., Weinberg, B. D., Lombard, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiotensin-%281-7%29+and+low-dose+angiotensin+II+infusion+reverse+salt-induced+endothelial+dysfunction+via+different+mechanisms+in+rat+middle+cerebral+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Angiotensin-(1-7) and low-dose angiotensin II infusion reverse salt-induced endothelial dysfunction via different mechanisms in rat middle cerebral arteries.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 299, H1024-H1033 (2010).</li>
<li>LeBlanc, A. J., Cumpston, J. L., Chen, B. T., Frazer, D., Castranova, V., Nurkiewicz, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoparticle+inhalation+impairs+endothelium-dependent+vasodilation+in+subepicardial+arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Toxicol.+Environ.+Health+A%22%5BJournal%5D)">Nanoparticle inhalation impairs endothelium-dependent vasodilation in subepicardial arterioles.</a> J. Toxicol. Environ. Health A. 72, 1576-1584 (2009).</li>
<li>Jernigan, N. L., LaMarca, B., Speed, J., Galmiche, L., Granger, J. P., Drummond, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dietary+salt+enhances+benzamil-sensitive+component+of+myogenic+constriction+in+mesenteric+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Dietary salt enhances benzamil-sensitive component of myogenic constriction in mesenteric arteries.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 294, H409-H420 (2008).</li>
<li>Stapleton, P. A., Goodwill, A. G., James, M. E., Frisbee, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+mechanisms+of+endothelium-dependent+dilation+in+skeletal+muscle+arterioles+with+genetic+hypercholesterolemia%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Regul.+Integr.+Comp.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Altered mechanisms of endothelium-dependent dilation in skeletal muscle arterioles with genetic hypercholesterolemia.</a> Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 293, R1110-R1119 (2007).</li>
<li>Goodwill, A. G., Stapleton, P. A., James, M. E., d'Audiffret, A. C., Frisbee, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+arachidonic+acid-induced+thromboxane+generation+impairs+skeletal+muscle+arteriolar+dilation+with+genetic+dyslipidemia%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Increased arachidonic acid-induced thromboxane generation impairs skeletal muscle arteriolar dilation with genetic dyslipidemia.</a> Microcirculation. 15, 621-631 (2008).</li>
<li>Baumbach, G. L., Hadju, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanics+and+composition+of+cerebral+arterioles+in+renal+and+spontaneously+hypertensive+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Mechanics and composition of cerebral arterioles in renal and spontaneously hypertensive rats.</a> Hypertension. 21, 816-826 (1993).</li>
<li>Uchida, E., Bohr, D. F., Hoobler, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+studying+isolated+resistance+vessel+from+rabbit+mesentery+and+brain+and+their+responses+to+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">A method for studying isolated resistance vessel from rabbit mesentery and brain and their responses to drugs.</a> Circ. Res. 4, 525-536 (1967).</li>
<li>Davis, M. J., Kuo, L., Chilian, W. M., Muller, J. M. I. solated Chapter 23. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDavis%2C+MJ+%22Isolated%2C+perfused+microvessels.+In%3A+Clinically+Applied+Microcirculation+Research%22">Isolated, perfused microvessels. In: Clinically Applied Microcirculation Research</a>. Barker, J. H., Anderson, G. L., Menger, M. D. 32, CRC Press, Inc. 435-456 (1995).</li>
<li>Lombard, J. H., Liu, Y., Fredricks, K. T., Bizub, D. M., Roman, R. J., Rusch, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+and+mechanical+responses+of+rat+middle+cerebral+arterieal+to+reduced+PO2+and+prostacyclin%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Electrical and mechanical responses of rat middle cerebral arterieal to reduced PO2 and prostacyclin.</a> Am. J. Physiol. 276, H509-H516 (1994).</li>
</ol>

Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

Il protocollo presentato descrive la cannulazione isolamento, rimozione e di un doppio microvasi muscolo scheletrico, sebbene questa tecnica generale può essere facilmente applicato alla maggior parte dei tessuti. Per il manoscritto attuale, il termine &quot;arteriole&quot; è stato utilizzato dagli autori per descrivere una nave resistenza compresa tra 70-120 micron di diametro a riposo sotto tono attivo, che è anche un importante contributo alla regolazione della resistenza perfusione ad un organo o tessuto. <p cla...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagenti e materiale </td><td> Azienda </td><td> Commenti / Catalogo # </td></tr><tr><td> Vessel Camera </td><td> Costume </td><td> Dave Eick (MCW) </td></tr><tr><td> Riscaldato bagno di acqua circolante </td><td> PolyScience e Haake </td><td> Haake DC 10 </td></tr><tr><td> Pipette </td><td> Frederick Haer &amp; Co. </td><td> Tubo capillare 2,0 millimetri OD x 1.0 mm ID (27-33-1) </td></tr><tr><td> Pressure Monitor </td><td> Mondo Strumenti di precisione </td><td></td></tr><tr><td> Water Reservoir camicia </td><td> Costume </td><td></td></tr><tr><td> Sorgente di luce esterna </td><td> Mondo Strumenti di precisione </td><td> Novaflex </td></tr><tr><td> Pipettare Puller </td><td> Microdata Instruments </td><td> PMP102 Micropipette Puller </td></tr><tr><td> Comple completozione di strumenti chirurgici </td><td> Strumenti di Scienze Belle </td><td> Dumont </td></tr><tr><td> Ultra Pinze Belle </td><td> Strumenti di Scienze Belle </td><td> Inox # 5 </td></tr><tr><td> Silk sutura Discussione </td><td> Ethilon </td><td> # 10-0 o 9-0 </td></tr><tr><td> Microscopio Stereo </td><td> Olimpo </td><td> Olympus SZ-11 </td></tr><tr><td> Calibri video analogici </td><td> BOECKELER </td><td> Via Controller (Via-100) </td></tr><tr><td> Analogica ad alta risoluzione della fotocamera </td><td> Panasonic </td><td> GP-MF 602 </td></tr><tr><td> Serbatoio di ossigeno </td><td> Regionale </td><td> L&#39;equilibrio di azoto 21% e il 5% di CO 2 di azoto equilibrio </td></tr><tr><td> Tubi </td><td> Tygon </td><td></td></tr><tr><td> Pompa di scarico </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td></td></tr><tr><td> PSS Rat modificati </td><td> Vedi ricetta qui sotto </td><td></td&gt; </tr><tr><td> Van Breemen del PSS rilassanti </td><td> Vedi ricetta qui sotto </td><td></td></tr></tbody></table> Tabella 1. Un elenco delle principali componenti della configurazione isolata stazione di microvasi presentato nelle figure. <table border="1"><tbody><tr><td> Modificato Rat Ricetta PSS </td><td> Per fare due litri di PSS </td><td> 20X magazzino Salt (2L) </td><td> 20X scorta (2L) </td></tr><tr><td> NaCl </td><td></td><td> 278,0 g </td><td></td></tr><tr><td> KCl </td><td></td><td> 14,0 g </td><td></td></tr><tr><td> MgSO 4-7H 2 O </td><td></td><td> 11,5 g </td><td></td></tr><tr><td> CaCl 2-H 2 O </td><td></td><td> 9,4 g </td><td></td></tr><tr> &lt;td&gt; NaHCO 3 </td><td></td><td></td><td> 80,8 g </td></tr><tr><td> EDTA </td><td></td><td></td><td> 0,4 g </td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4 </td><td> 0,28 g </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Glucosio </td><td> 1,98 g </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 20x Salt magazzino </td><td> 100 mL </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 20x della scorta </td><td> 100 mL </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Acqua distillata </td><td> 1800 mL </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabella 2. Ricetta per standard di soluzione salina fisiologica (PSS) utilizzato nei protocolli microvasali isolati. Commenti a Ricetta: Fai 2 L di Stock sale e 2 litri di scorta. Questi cuno in frigorifero quando non viene utilizzato, ma scuoterli bene e spesso prima di preparare PSS. Gli ingredienti aggiuntivi vengono aggiunti al momento della preparazione della PSS finali. <table border="1"><tbody><tr><td> Van Breemen del PSS rilassanti </td><td> Per fare 2 litri di PSS </td><td> 20X magazzino Salt (1L) </td><td> 20X scorta (1L) </td></tr><tr><td> NaCl </td><td></td><td> 107,4 g </td><td></td></tr><tr><td> KCl </td><td></td><td> 7,0 g </td><td></td></tr><tr><td> MgSO 4-7H 2 O </td><td></td><td> 5,76 g </td><td></td></tr><tr><td> MgCl 2-6H 2 O </td><td></td><td> 81,32 g </td><td></td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td></td><td></td><td> 40,4 g </td></tr><tr><td> EDTA </td><td></td><td></td><td> 0,2 g </td></tr><tr><td> EGTA </td><td></td><td></td><td> 15,22 </td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4 </td><td> 0,28 g </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Glucosio </td><td> 1,98 g </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 20x Salt magazzino </td><td> 100 mL </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 20x della scorta </td><td> 100 mL </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Acqua distillata </td><td> 1800 mL </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabella 3. Ricetta per una soluzione rilassante Van Breemen di sale fisiologica (PSS) utilizzato nei protocolli microvasali isolate in condizioni di tono attivo pari a zero. Commenti a Ricetta: Fai 1 litro di brodo sale alnd 1 L di scorta. Questi possono essere refrigerato quando non viene utilizzato, ma scuoterli bene e spesso prima di preparare PSS. Gli ingredienti aggiuntivi vengono aggiunti al momento della preparazione della finali PSS rilassanti.

il ex vivo preparazione isolato microvasi scheletrico per le indagini di reattività vascolare

The ex vivo Isolated Skeletal Microvessel Preparation for Investigation of Vascular Reactivity

La preparazione dei microvasi isolato è un preparato ex vivo che consente l&#39;esame dei contributi di diversi fattori che diametro natante di controllo, e quindi, la resistenza perfusione 1-5. Questa è una preparazione classica sperimentale che è stato, in larga misura, inizialmente descritto da Uchida et al 15. Diversi decenni fa. Questa descrizione iniziale fornito la base per le tecniche che è stato ampiamente modificato e ampliato, principalmente nel laboratorio del Dr. Brian Duling presso la University of Virginia 6-8, e presentiamo un approccio corrente nelle pagine seguenti. Questo preparato in modo specifico riferimento alla arteriola gracilis in un topo come microvasi di scelta, ma la preparazione di base può essere facilmente applicata alle navi isolati da quasi qualsiasi altro tessuto o organo tra le specie 9-13. Meccanica (cioè, dimensionale) cambiamenti nel isolato microvasi può essere facilmente valutatain risposta ad una vasta gamma di fisiologico (ad esempio, ipossia, pressione intravascolare, o taglio) o sfide farmacologici, e può fornire informazioni sul elementi meccanici comprendenti risposte integrati in uno intatto, sebbene ex vivo, tessuto. Il significato di questo metodo è che permette la manipolazione facile delle influenze sulla regolazione integrata del diametro microvasi, consentendo anche per il controllo di molti dei contributi provenienti da altre fonti, compresa la pressione intravascolare (miogenico), innervazione autonomica, emodinamica ( ad esempio, sforzo di taglio), stimoli endoteliali dipendenti o indipendenti, e le influenze ormonali, parenchimali, per fornire una lista parziale. Sotto opportune condizioni sperimentali e con obiettivi adeguati, questo può servire come un vantaggio rispetto in vivo o in situ di tessuti / organi preparati, che non consentono facilmente per il controllo di facile ampie variabili sistemiche. La maJor limitazione di questa preparazione è essenzialmente la conseguenza delle sue forze. Per definizione, il comportamento di questi vasi è stata studiata in condizioni in cui molti dei contributi più significativi alla regolamentazione della resistenza vascolare sono state rimosse, compresa neurale, umorale, metabolica, ecc Come tale, l&#39;investigatore è avvertiti di evitare un eccesso di interpretazione e estrapolazione dei dati raccolti utilizzando questa preparazione. L&#39;altro significativo di preoccupazione per questa preparazione è che può essere molto facile danneggiare componenti cellulari come il rivestimento endoteliale o al muscolo liscio vascolare, tale fonte variabile di errore può essere introdotto. Si raccomanda vivamente che il singolo ricercatore utilizzare misure appropriate per garantire la qualità della preparazione, sia durante la fase iniziale dell&#39;esperimento e periodicamente nel corso di un protocollo.

Un<em&gt; Ex vivo</emPreparazione&gt; è descritto per l&#39;isolamento delle arteriole muscolari più grandi di resistenza gracile per l&#39;interrogatorio di entrambe le risposte vascolari a stimoli vasoattivi e la valutazione delle proprietà strutturali di base attraverso la meccanica della parete passivi.

Il Ex vivo Preparazione isolato microvasi scheletrico per le Indagini di reattività vascolare

La preparazione di microvasi isolati è una preparazione ex vivo che consente l'esame dei diversi contributi dei fattori che controllano il vaso...

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare chirurgicamente, rimuovere e cannuolare doppia­mente singoli arterioli di resistenza. Per lo studio in un contesto ex vivo, ciò viene ottenuto innanzitutto identificando e isolando chirurgicamente un microvaso in un animale anestetizzato. Dopo il trasferimento del microvaso in una camera per vasi, le estremità prossimale e distale del microvaso vengono entrambe cannuolate. Infine, i microvasi vengono esposti a sfide farmacologiche o fisiologiche e a interventi sperimentali per valutare i meccanismi alla base della funzione o disfunzione intrinseci al vaso stesso. In definitiva, i risultati mostrano i modelli e i meccanismi coinvolti nella reattività vascolare in un contesto isolato, mediante stimoli e interventi opportunamente mirati. Generalmente, le persone alle prime esperienze con questo metodo incontrano difficoltà, poiché questa preparazione richiede non solo un'elevata abilità chirurgica da eseguire al microscopio, ma anche pazienza e un controllo fine della motricità necessari per effettuare una doppia cannullazione di microvasi isolati con un diametro spesso molto inferiore a cento micron.Questa operazione deve essere eseg

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Isolamento della embrionali ventricolari cellule endoteliali

Vi presentiamo una preparazione per la visualizzazione e la manipolazione di segnalazione del calcio in nativo, intatto microvascolari. Tubi endoteliali appena isolate da arterie di resistenza topo che forniscono muscolo scheletrico mantenere in vivo la morfologia e la segnalazione dinamica all'interno e tra le cellule vicine. Tubi endoteliali possono essere preparati da microvasi di altri tessuti e organi.

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I vasi sanguigni all'interno del porto muscolo scheletrico diverse popolazioni precursori multi-lignaggio umane che sono ideali per applicazioni rigenerative. Questo metodo di isolamento permette la purificazione simultanea di tre popolazioni di cellule precursori multipotenti rispettivamente da tre strati strutturali dei vasi sanguigni: cellule endoteliali da miogenici intima, periciti dai media, e le cellule avventiziali da avventizia.

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Molte malattie oculare visione-minacciose sono associata con disfunzionali microvasi retinici. Pertanto, la misura delle risposte arteriola retinica è importante approfondire i meccanismi fisiopatologici sottostanti. Questo articolo descrive un protocollo dettagliato per mouse arteriola retinica isolamento e la preparazione per valutare gli effetti di sostanze vasoattive il diametro vascolare.

Procedura di preparazione per la misura della reattività in Mouse arteriole retiniche Ex Vivo

Questo manoscritto descrive un semplice protocollo per l'isolamento delle arteriole dalla retina del ratto che può essere utilizzato in studi myography elettrofisiologici, imaging e pressione del calcio.

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Descriviamo un protocollo per isolare e coltivare cellule endoteliali della vena safena umana (hSVEC). Forniamo anche metodi dettagliati per produrre stress di taglio e allungamento per studiare lo stress meccanico nelle hSVEC.

Vena safena umana Isolamento delle cellule endoteliali ed esposizione a livelli controllati di stress da taglio e allungamento

Questo protocollo presenta la configurazione e il funzionamento di un bioreattore di nuova concezione stampato in 3D per la coltura ex vivo di vasi sanguigni in perfusione. Il sistema è progettato per essere facilmente adottato da altri utenti, pratico, economico e adattabile a diverse applicazioni sperimentali, come la biologia di base e gli studi farmacologici.

Ex Vivo Coltura di perfusione di grandi vasi sanguigni in un bioreattore stampato in 3D

Impara a isolare e cannulare arteriole di resistenza ex vivo per studiare la reattività vascolare. Questo metodo permette di valutare le risposte a stimoli farmacologici e le proprietà strutturali dei vasi.

Il Ex vivo Preparazione isolato microvasi scheletrico per le Indagini di reattività vascolare

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