Indagare infiammazione intestinale in DSS-indotta Modello di IBD

L'obiettivo generale di questa procedura è valutare la risposta immunitaria intestinale indotta dal destrane solfato di sodio determinando le quantità di attività della mielo perossidasi e le citochine pro-infiammatorie prodotte in risposta all'infiammazione. La prima colite DSS viene indotta nei topi attraverso l'introduzione della soluzione DSS SALT nell'acqua potabile. Successivamente, la gravità della colite viene valutata mediante punteggio macroscopico e il colon viene rimosso per ulteriori analisi.

Il colon sezionato viene quindi sezionato in tre parti per l'istologia, la quantificazione delle citochine e l'attività NPO. Infine, il tessuto del colon viene omogeneizzato e il surnatante viene utilizzato per determinare l'attività dell'MPO. In definitiva, i cambiamenti nell'attività dell'MPO possono essere determinati attraverso i dati di assorbanza raccolti utilizzando uno spettrofotometro.

Questo metodo può fornire informazioni sulle informazioni croniche di vari modelli di malattia infiammatoria intestinale, come la colite indotta da DSS e TNBS. Inoltre, è possibile utilizzare questo metodo in altri organi come il polmone e il fegato Prima di iniziare la procedura. Sostituire l'acqua potabile in ogni gabbia per topi con una soluzione DSS per indurre l'infiammazione.

Dare ai topi di controllo in autoclave acqua potabile senza DSS. Quindi, il giorno dell'esperimento, sezionare il colon come precedentemente dimostrato nell'articolo JoVE di Whitham Williams e Williams. Spremere con cura le feci dall'intero colon usando un paio di pinzette piegate, raccogliendole in una carta da pesare risciacquando il fazzoletto con PBS sterile.

Valuta le feci usando un paio di pinze per premere sulle feci per determinarne la consistenza per determinare un punteggio per il sangue nelle feci. Annotare il colore delle feci e convalidare ulteriormente la valutazione utilizzando un test emoocculto, che prevede lo spalmamento delle feci su carta emoocculta, l'aggiunta di sviluppatore e quindi l'annotazione del colore blu che denota un test delle feci positivo per il sangue. Utilizzare quindi questa tabella per determinare un valore per ciascuna delle condizioni.

Successivamente, mantenendo l'orientamento prossimale a distale del colon, tagliare il colon in tre sezioni uguali. Quindi prelevare frammenti di campione dalle sezioni del colon prossimale e medio del colon e posizionare i campioni in singole provette eph da 1,5 millilitri. Per valutare il danno istologico della gravità della colite, utilizzare la sezione di tessuto più distale del colon e tagliare un piccolo frammento di lunghezza da mezzo a un centimetro.

Posizionare il frammento in una cassetta di fazzoletti e immergere la cassetta in una soluzione tamponata di formalina al 10%. Quindi, dopo aver preparato le sezioni trasversali dei frammenti di tessuto incorporate in paraffina, colorare le sezioni con ematina eoin per il punteggio da parte di un osservatore in cieco. Infine, congelare i campioni dalle sezioni prossimale e media del collone in azoto liquido e conservarli fino all'uso a meno 70 gradi Celsius.

Dopo aver rimosso i campioni di colon dalla conservazione a meno 70 gradi Celsius, posizionarli sul ghiaccio. Quindi utilizzare una pinza piegata per rimuovere eventuali feci o grasso visibili e metterli in singoli tubi da due millilitri adatti per l'uso in un omogeneizzatore. Quindi determinare e registrare il peso di ciascun campione.

Quindi, aggiungere le perle dell'omogeneizzatore a ciascuna provetta del campione, quindi aggiungere la quantità appropriata di tampone con linguetta H alla provetta in base al peso del tessuto appena determinato, dissociare i frammenti con un omogeneizzatore tissutale per quattro minuti a 30 hertz. Infine, centrifugare la soluzione cellulare per sei minuti a 13, 400 volte G e quattro gradi Celsius. Raccogliere il surnatante in una provetta nuova, quindi assicurandosi di conservare il cordone di omogeneizzazione, scartare il pellet risultante.

Il surnatante può quindi essere conservato a meno 70 fino all'uso. Iniziare questa fase aggiungendo sette microlitri di omogeneizzato di tessuto precedentemente preparato in triplicato in una piastra a 96 pozzetti. Quindi aggiungere 50 microlitri di perossido di idrogeno diluito allo iodio OD Dion appena preparato.

Utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere 200 microlitri della miscela di perossido di idrogeno a ciascuno dei pozzetti. Ora, misura l'assorbanza di 550 nanometri utilizzando uno spettrofotometro, effettuando tre letture a intervalli di 32. Quindi, utilizzando i dati di assorbanza, il peso del tessuto e il volume del tampone, calcolare l'attività NPO negli omogeneizzati come dimostrato in questo calcolo del campione.

Durante la durata del trattamento con DSS, l'indice di attività della malattia può essere utilizzato per valutare e valutare la progressione clinica della malattia. Gli animali trattati con DSS mostrano una significativa perdita di peso rispetto al loro peso iniziale, feci molli e sanguinamento fecale. Più sono consistenti i sistemi macroscopici, più alto è l'indice di attività della malattia.

Dopo il sacrificio e l'esame del colon dei topi a cui è stato somministrato il 5% di DSS in acqua potabile per cinque giorni, la gravità della colite basata sul punteggio macroscopico dell'accorciamento della lunghezza del colon, del sanguinamento del colon, del sanguinamento fecale, dell'allentamento della consistenza delle feci e dei segni di sanguinamento rettale per questo esperimento rappresentativo è stata determinata essere circa cinque volte peggiore rispetto ai controlli trattati solo con acqua, come dimostrato da queste sezioni trasversali di dati di DSS trattati I campioni di tessuto del colon, come per H ed E, hanno punteggi istologici più elevati rispetto ai controlli trattati con acqua. Qui, l'architettura normale e la mancanza di infiltrato cellulare potrebbero essere notate nell'area indicata dall'asterisco in questa sezione trasversale colorata h ed e raccolta da un animale di controllo che ha ricevuto solo acqua. Ora confronta questa colorazione h ed e di un campione di un animale trattato con A DSS con la figura precedente.

Il colon di questo animale mostra più danni istologici, come evidenziato da una maggiore infiltrazione cellulare come indicato dal segno del libretto e da una maggiore deplezione delle cellule caliciformi e da una maggiore distorsione. Danni all'architettura della cripta K come indicato dall'asterisco. Per caratterizzare ulteriormente l'entità della gravità della malattia nei topi trattati con DSS, l'attività di NPO, un marcatore surrogato per l'infiammazione, può essere valutata da campioni di tessuto del colon omogeneizzati.

Come previsto, i colon trattati con DSS hanno un'attività NPO più elevata rispetto ai controlli. Inoltre, la gravità della colite indotta da DSS è associata ad un aumento dei livelli di citochine pro-infiammatorie, come IL uno, beta, IL sei e TNF alfa. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che l'attività dell'MPO può diminuire nel tempo.

Pertanto, il test MPO dovrebbe essere uno dei primi test eseguiti per determinare la gravità dell'infiammazione intestinale.