Name: Indagare infiammazione intestinale in DSS-indotta Modello di IBD (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: Impara a valutare la risposta immunitaria intestinale nella colite indotta da DSS nei topi, misurando l'attività della mieloperossidasi e le citochine pro-infiammatorie. Questo metodo fornisce informazioni chiave sui meccanismi dell'IBD.

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Questo lavoro è supportato anche da finanziamenti Canadian Institutes of Health Research (CIHR) e da morbo di Crohn e Colite Foundation of Canada (CCFC).

1. Modello murino di DSS-indotta colite acuta <ol><li> Aggiungi destrano sodio solfato (DSS) per l&#39;acqua potabile sterilizzati in autoclave per la concentrazione finale desiderata (1-5%) (peso / volume) (cioè per ottenere una soluzione DSS 5%, aggiungere 25 mg di polvere di DSS a 500 ml di acqua autoclavato) . Soluzione madre può essere lasciato a temperatura ambiente per un massimo di una settimana a 4 ° C fino all&#39;utilizzo. </li><li> In una cappa di biosicurezza, versare DSS soluzione madre in 50 ml provette Falcon (una necessaria per gabbia). Mantenere la soluzione stock di tubi ricarica quando necessario. </li><li> Sostituire l&#39;acqua potabile in ogni gabbia del mouse con la soluzione DSS (in provette Falcon da 50 ml) (La durata dipende dal regime DSS che viene utilizzato. Ad esempio, utilizzando 6-8 C57BL vecchio settimana maschio / 6 topi, abbiamo amministrare un DSS soluzione al 5% per un totale di cinque giorni). I topi non dovrebbero avere accesso a qualsiasi altra fonte d&#39;acqua. Topi di controllo sono forniti di acqua potabile senza autoclave DSS. </li><li> Pesare topi quotidiano e registrare la quantità di DSS consumata al giorno. Top ognibottiglia da 50 ml dopo la registrazione dei livelli DSS. Questo è quello di misurare il volume approssimativo di DSS consumata per gabbia del mouse per tutta la durata dell&#39;esperimento. Nei nostri studi, si usa una soluzione DSS 5% per 5 giorni con C57BL maschio / 6 topi. Significativa perdita di peso, la consistenza delle feci alterata e segni di sangue fecale sono visti fin dal giorno 3 utilizzando questo particolare regime DSS. Durante l&#39;amministrazione DSS, i topi mostrano notevole perdita di peso (circa 5-10% del loro peso iniziale il giorno 5) con la perdita di peso superiore al 20% del peso iniziale con disidratazione e diarrea essere l&#39;indicatore significativo fisiologico che un animale è pari o vicino endpoint. Se l&#39;animale abbia accesso ad acqua normale, dopo i 5 giorni del 5% di DSS, si recupererà entro 7 giorni. Tutti gli esperimenti devono essere approvati dalla dell&#39;istituzione animale comitato etico ed essere in conformità del protocollo approvato utilizzo degli animali (AUP). </li><li> Per tutta la durata dell&#39;esperimento, un indice di attività della malattia (DAI)punteggio può essere valutato per valutare la progressione clinica della colite. Il DAI è il punteggio combinato della perdita di peso rispetto al peso iniziale, la consistenza delle feci, e sanguinamento. I punteggi sono definiti come segue: perdita di peso: 0 (nessuna perdita), 1 (1-5%), 2 (5-10%), 3 (10-20%), e 4 (&gt; 20%), la consistenza delle feci: 0 (normale), 2 (feci molli), e 4 (diarrea), e sanguinamento: 0 (assenza di sangue), 1 (Hemoccult positivo), 2 (Hemoccult sanguinamento positivo e visivo pellet), e 4 (sanguinamento grave, il sangue intorno ano). DAI può essere segnato ogni giorno per tutta la durata del trattamento DSS. </li><li> Nel punto in tempo di scelta, peso e sacrificio topi. I topi possono essere eutanasia da dislocazione cervicale a seguito di inalazione di isoflurano o altro metodo riconosciuto da stabulario dell&#39;istituto. </li></ol> 2. Raccogliere campioni di tessuto del colon <ol><li> Esporre il lato ventrale dell&#39;animale e bagnare la zona addominale con una soluzione di etanolo al 70%. A questo punto, fare riferimento alla Tabella 1 e fare atto di unany segni di sanguinamento rettale (sangue presente al orifizio anale) o prolasso rettale in ogni animale. </li><li> Uso standard forbici dissezione di incidere l&#39;addome facendo una incisione ventrale linea mediana. </li><li> Individuare i due punti e transetto i due punti più vicino possibile al margine del colon-retto più possibile per liberare il colon distale. </li><li> Attentamente e lentamente tirare fuori tutto il colon, distogliendolo dalle mesentere circostante. </li><li> Transetto i due punti al margine colonocecal per liberare l&#39;estremità prossimale del colon. Feci può essere rimossa risciacquando colon con PBS sterile utilizzando un ago sonda collegata ad una siringa da 3 o 5 ml o da spremere accuratamente con l&#39;ausilio di un paio di pinzette piegato / pinze. Utilizzando l&#39;intero colon, per valutare i danni (vedi Sezione 3.1) </li><li> Campionamento per l&#39;analisi istologica dei tessuti ed altri test può essere fatto tagliando 0,5 centimetri per 1,0 centimetri lunghi frammenti del colon prendendo nota di quale area campione è di (cioè prossimale, medio o distale). </li><li> Campioni di tessutoda utilizzare per i test possono essere singolarmente posto in 1,5 ml provette Eppendorf e congelato in azoto liquido e conservati fino al momento dell&#39;uso a -70 ° C. </li></ol> 3. Valutazione della gravità colite <ol><li> Punteggio di gravità macroscopica o malattia terminale è valutata da un osservatore imparziale utilizzando un sistema di punteggio precedentemente pubblicato (Tabella 1). 9 La consistenza delle feci può essere valutata utilizzando una pinza e premendo verso il basso le feci per determinare la consistenza. Per determinare il punteggio di sangue nelle feci, si noti il ​​colore delle feci (feci cioè nero contro la luce feci marrone) e convalidare ulteriormente con un test Hemoccult. Utilizzando il sistema di punteggio, determinano un punteggio per ciascuna delle condizioni. Il punteggio finale macroscopico per ogni animale è la somma di ogni punteggio individuale. </li><li> Per valutare i danni istologici di gravità colite, tagliare un piccolo frammento (0,5 cm) del colon, posto in una cassetta tessuto e immergerlo in soluzione tamponata formalina al 10%. Preparare 5paraffina micron incorporato sezioni trasversali e sezioni macchia con ematossilina / eoxin (H &amp; E) utilizzando le procedure appropriate. Frammenti del colon può essere preso dal prossimale, a metà del colon, o parte distale del colon. </li><li> H &amp; E sezioni colorate di tessuto del colon sono segnati da un osservatore cieco utilizzando un sistema precedentemente pubblicato per le seguenti misure: architettura cripta (normale, 0 - grave distorsione cripta con perdita di cripte intero, 3), grado di infiltrazione di cellule infiammatorie (normale, 0 - denso infiltrato infiammatorio, 3), l&#39;ispessimento del muscolo (base della cripta si trova sulla muscolaris mucosae, 0 - segnata presenti ispessimento del muscolo, 3), deplezione delle cellule caliciformi (assente, 0 - oggi, 1) e ascesso cripta (assente, 0 - presente , 1). 7 Il punteggio danno istologico è la somma di ogni punteggio individuale. Va notato che a differenza dell&#39;uomo UC, ascessi cripta non sono caratteristici di questo modello e si vedono raramente; ulcerazioni microscopiche sono anche rari. Se le sezioni più due punti sono statimacchiato, punteggi tra sezioni istologiche simili dovrebbero essere usati per determinare il punteggio finale per ogni area (cioè punteggio istologico nel colon prossimale rispetto al punteggio istologico nel colon distale). </li></ol> 4. Preparare soluzioni di reagenti per le analisi <ol><li> Preparare una soluzione 50 mM di tampone fosfato di potassio con l&#39;aggiunta di soluzione B (K 2 HPO 4, 8,7 g di fosfato di potassio bibasico in 1 L di dH 2 O) per la soluzione A (KH 2 PO 4, 6,8 g di fosfato monobasico di potassio in 1L di dH 2 O) fino a pH di 6,0 è raggiunto. Le soluzioni rimanente può essere conservato in frigorifero (2-8 ° C) fino a un uso futuro. </li><li> Preparare bromuro esadeciltrimetilammonio (HTAB) tampone con l&#39;aggiunta di 5 g HTAB in 1 L di tampone fosfato di potassio (50 mM, pH = 6,0). Delicatamente il calore per sciogliere e conservare a 2-8 ° C fino al momento dell&#39;uso. Quando richiesto, il calore di ri-sciogliere. </li><li> Preparare tampone di lisi per la omogeneizzazione dei tessuti per l&#39;analisi delle proteine ​​da parteaggiungendo 10 mL di 1M tris-acido cloridrico (pH = 8,0), 6 ml di cloruro di sodio 5 M e 2 ml di Triton X-100-182 ml di acqua distillata sterilizzata. Triton X-100 è molto viscoso a temperatura ambiente e, quindi, dovrebbe essere riscaldato delicatamente prima dell&#39;uso. Il tampone di lisi preparata possono essere conservati a -20 ° C fino al momento dell&#39;uso. </li></ol> 5. Preparazione dei campioni per le analisi <ol><li> La preparazione del campione per l&#39;analisi MPO. <ol><li> Rimuovere i campioni da -70 ° C e il luogo in ghiaccio. Registrare il peso di ciascun campione dopo aver rimosso le feci visibili o grasso utilizzando un pinza piegata / pinzetta e il luogo in 2 ml Eppendorf Safe-Lock provetta (o qualsiasi altro tubo che può essere utilizzato con un omogeneizzatore). I campioni devono essere conservati in ghiaccio in ogni momento. E &#39;importante notare che i frammenti del colon simili dovrebbero essere usati da ogni replica biologici (ad esempio sezioni sezioni distale o prossimale solo solo). </li><li> Aggiungi omogeneizzatore tallone ad ogni provetta. </li><li> Aggiungere la quantità appropriata di buf HTABFer in base al peso del tessuto. Se il peso del tessuto è inferiore a 25 mg, aggiungere la soluzione tampone con un rapporto di 12.5mg/mL, se il peso del tessuto è compresa tra 25-50, aggiungere con un rapporto di 25mg/ml. Se il peso del tessuto è superiore a 50, aggiungere tampone con un rapporto di 50mg/ml. </li><li> Omogeneizzare con un omogeneizzatore tessuto per 4 min a 30 Hz.. Ripetere se il tessuto non è completamente omogeneizzato. </li><li> Rimuovere omogeneizzatore tallone e la soluzione di centrifuga per 6 min (13.400, xga 4 ° C). </li><li> Raccogliere ed eliminare il surnatante risultante pellet. Supernatent possono essere conservati a -70 ° C fino al momento dell&#39;uso. </li></ol></li><li> La preparazione del campione per l&#39;analisi delle citochine. <ol><li> Ripetere i passaggi 5.1.1. a 5.1.2. </li><li> Aggiungere 50 ml di cocktail di inibitori delle proteasi (PIC) a 10 mL di tampone di lisi preparata. </li><li> Aggiungere 1 ml del PIC e di soluzione tampone di lisi per ogni campione a prescindere dal peso. </li><li> Omogeneizzare per 5 min a 30 Hz.. Ripetere se il tessuto non è completamente omogeneizzato. </li><li> Rimuovere omogeneizzatore tallone e centrifugare SOLUZIOper 5 min a 3300 x g. </li><li> Raccogliere ed eliminare il surnatante risultante pellet. Surnatante può essere conservato a -70 ° C fino al momento dell&#39;uso. </li></ol></li></ol> 6. Quantificazione di marker infiammatori <ol><li> Attività di test MPO <ol><li> Preparare o-dianisidina dicloridrato (o-dianisidina) soluzione combinando 16,7 mg di o-dianisidina dicloridrato, 90 ml di dH 2 O e 10 ml di tampone fosfato di potassio. Questa soluzione deve essere preparato fresco per ogni test. </li><li> Aggiungere 7 ml di tessuto omogenato (preparato in paragrafo 5.1) in triplice copia in una piastra a 96 pozzetti. </li><li> Aggiungere 50 ml di diluito H 2 O 2 (4 ml di 30% di H 2 O 2 diluita in 96 ml di dH 2 O) per l&#39;o-dianisidina miscela. </li><li> Utilizzare una pipetta multicanale per aggiungere 200 microlitri della o-dianisidina miscela contenente H 2 O 2 a ciascuno dei pozzi. </li><li> Misurare l&#39;assorbanza a 450 nm usando uno spettrofotometrotometer. Prendere tre letture ad intervalli di 30 secondi. </li><li> Calcolare l&#39;attività MPO. Attività MPO è misurata in unità (U) di MPO / mg di tessuto, in cui è definito un&#39;unità di MPO come l&#39;importo necessario per degradare 1 mmol di H 2 O 2 al minuto a temperatura ambiente. Considerando che una sola unità (U) di MPO = 1 mol di H 2 O 2 diviso e che 1 mol di H 2 O 2 dà un cambiamento di assorbanza di 1,13 x 10 -2 nm / min, unità di MPO in ogni campione è determinato come variazione di assorbanza [ΔA (t 2-t 1)] / Δmin x (1,13 x 10 -2). Per ottenere unità per mg di tessuto, uso del tessuto: rapporto di buffer. Per esempio, se un tessuto: il rapporto di buffer di 50 mg / ml è stato usato, in 7 ml di omogenato, non vi è 0,35 mg di tessuto. Pertanto, per ottenere unità per mg di tessuto, dividere le unità di MPO da 0,35. Un esempio di calcolo utilizzando i valori di assorbanza (nm) è riportato qui di seguito (assumendo che il campione è stato aggiunto in triplice copia): </li></ol></li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> Campione </td><td colspan="3"> Tempo 0 sec </td><td colspan="3"> Tempo di 30 sec </td><td colspan="3"> Tempo di 60 sec </td></tr><tr><td> A </td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 1 &#39; </td><td> 2 &#39; </td><td> 3 &#39; </td><td> 1 &quot; </td><td> 2&#39;&#39; </td><td> 3 &quot; </td></tr><tr><td></td><td> 0,048 </td><td> 0,048 </td><td> 0,051 </td><td> 0,061 </td><td> 0,061 </td><td> 0,065 </td><td> 0,074 </td><td> 0,073 </td><td> 0,078 </td></tr></tbody></table><ol class="lroman"><li> Media al tempo 0 sec = (0,048 + 0,048 + 0,051) / 3 = 0,049 nm </li><li> Media in fase di 30 sec = 0,0623 nm </li><li> Media in fase di 60 sec = 0,075 nm </li><li> Variazione di assorbanza (ΔA) da 0 a 30 sec / mg di tessuto (assumendo 50 mg / ml di tessuto: rapporto di buffer) = [(0,0623-0,049) / (1,13 x 10 -2)] / 0,35 = 3,363 </li><li> Cambiamento di assorbireANCE (ΔA) da 30 a 60 sec / mg di tessuto = 3,211 </li><li> * Attività di MPO (U / mg di tessuto) = media di ΔA (0-30) e ΔA (30-60) = 3,287 </li></ol><ol start="2"><li> Quantificazione dei citochine pro-infiammatorie da ELISA <ol><li> Citochine (IL-1β, IL-6 e TNF-α) i livelli sono determinati utilizzando disponibili in commercio enzyme-linked test immunoenzimatico (ELISA) Kit (Quantikine murini; R &amp; D Systems). </li><li> Valori di assorbanza di ogni ELISA è normalizzata usando un test proteina Bradford rispettivi ad ogni campione e viene espresso in unità di pg / mg di proteina. </li></ol></li></ol> 7. Rappresentante Risultati Amministrazione del regime DSS appropriato indurre colite acuta nei topi. Durante la durata del trattamento DSS, DAI possono essere utilizzati per valutare e valutare la progressione clinica della malattia. Gli animali trattati con DSS mostrerà significativa perdita di peso rispetto al loro peso iniziale, perdita di feci e fecisanguinamento (Figura 1). Sul sacrificio e l&#39;esame del colon, la gravità della colite è macroscopicamente punteggio sulla base di un accorciamento della lunghezza del colon, sanguinamento intestinale, sanguinamento nelle feci, perdita di consistenza delle feci, e segni di sanguinamento rettale, rispetto ai controlli trattati con sola acqua (Figura 2 e Tabella 1). Le sezioni trasversali dei campioni di tessuto del colon colorate con H &amp; E avrà punteggi più alti istologici per DSS trattati con i due punti contro l&#39;acqua trattata controlli (Figura 3). Per caratterizzare ulteriormente il grado di infiammazione nei topi trattati con DSS, attività MPO può essere valutata da omogeneizzato campioni di tessuto del colon. DSS trattati con i due punti che hanno una maggiore attività MPO rispetto ai controlli (Figura 4). Inoltre, questo è associato ad aumento dei livelli di citochine pro-infiammatorie (IL-1β, IL-6, TNF-α) (Figura 5). <img alt="Figura 1." src="/files/ftp_upload/3678/3678fig1.jpg" /><br/&gt; Figura 1. Maschio, topi C57BL / 6 è stata data al 5% DSS nel bere acqua per 5 giorni. DAI punteggi sono stati valutati al giorno per ogni animale e sono stati in media al giorno per ciascun gruppo (media ± SEM, n = 4 topi / gruppo). <img alt="Figura 2." src="/files/ftp_upload/3678/3678fig2.jpg" /> Figura 2. Topi C57BL / 6 è stata data al 5% DSS in acqua potabile per 5 giorni. Topi di controllo hanno ricevuto acqua senza DSS. Macroscopico danno punteggio / malattia punteggi di gravità sono stati valutati alla cieca il giorno 5 dopo DSS-indotta colite. I due punti isolati da topi che avevano ricevuto DSS hanno punteggi più elevati danni macroscopici (sanguinamento rettale, prolasso rettale, diarrea, sanguinamento del colon) che indica una maggiore gravità della malattia (media ± SEM, n = 4 topi / gruppo). <img src="/files/ftp_upload/3678/3678fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Topi C57BL / 6 è stata data soluzione DSS 5% in acqua potabile al fine di indurre colite. Topi di controllo<html> ricevuto acqua senza DSS. (A) i punteggi istologici sono stati ciecamente valutato con H &amp; E sezioni colorate di tessuto del colon raccolto il 5 ° giorno post-DSS amministrazione. (B), DSS-campioni trattati mostrano più danni istologici (infiltrazione di più cellulari, più deplezione delle cellule caliciformi, maggiore distorsione / danni alla cripta architettura) rispetto a (C) controlli (media ± SEM, n = 4 topi / gruppo). In (B) e (C), asterisco (*) indica un&#39;area di deplezione delle cellule caliciformi e la distorsione di architettura cripta; cancelletto (#) indica infiltrazione cellulare. <img alt="Figura 4." src="/files/ftp_upload/3678/3678fig4.jpg" /> Figura 4. Tutti i topi sono stati sacrificati il giorno 5 l&#39;amministrazione postale di DSS e campioni di tessuto del colon sono stati raccolti per valutare l&#39;attività MPO. La gravità della colite indotta da DSS è associata a più alti livelli di attività MPO rispetto ai controlli (media ± SEM, n = 4 topi / gruppo). _upload/3678/3678fig5.jpg &quot;/&gt; Figura 5. Oltre ai livelli più alti MPO, la gravità della colite indotta da DSS è anche associata ad un aumento del livello di pro-infiammazione citochine come IL-1β, IL-6, TNF-α (media ± SEM, n = 4 topi / gruppo). <table border="1"><tbody><tr><td> Punteggio </td><td> Sanguinamento rettale </td><td> Prolasso rettale </td><td> Sgabello Coerenza </td><td> Sangue </td></tr><tr><td> 0 </td><td> Nessuno </td><td> Nessuno </td><td> Normale </td><td> Normale </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Rosso </td><td> I segni di prolasso </td><td> Morbido </td><td> Rosso </td></tr><tr><td> 2 </td><td> Rosso Scuro </td><td> Prolasso chiaro </td><td> Molto morbido </td><td> Rosso scuro </td></tr><tr><td> 3 </td><td> Lordo Bleeding </td><td> Prolasso ampia </td><td> Diarrea </td><td> Nero </td></tr></tbody></t&gt; in grado Tabella 1. Macroscopica punteggio di gravità / Malattia

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<li>Elson, C. O., Beagley, K. W., Sharmanov, A. T., Fujihashi, K., Kiyono, H., Tennyson, G. S., Cong, Y., Black, C. A., Ridwan, B. W., McGhee, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hapten-induced+model+of+murine+inflammatory+bowel+disease%3A+mucosa+immune+responses+and+protection+by+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Hapten-induced model of murine inflammatory bowel disease: mucosa immune responses and protection by tolerance.</a> J. Immunol. 157, 2174-2185 (1996).</li>
<li>Dieleman, L. A., Ridwan, B. U., Tennyson, G. S., Beagley, K. W., Bucy, R. P., Elson, C. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dextran+sulfate+sodium-induced+colitis+occurs+in+severe+combined+immunodeficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Dextran sulfate sodium-induced colitis occurs in severe combined immunodeficient mice.</a> Gastroenterology. 107, 1643-1652 (1994).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

DSS colite è un modello ampiamente utilizzato indotto chimicamente di infiammazione intestinale. In questo modello, i topi sono fornite di acqua potabile integrato con DSS, che è pensato per essere tossico per le cellule epiteliali intestinali e danneggiare l&#39;integrità della barriera mucosale. 10 La somministrazione di DSS induce una colite acuta, che è caratterizzata da feci molli, sanguinamento fecale, e infiltrazione con granulociti. DSS 10 Durante l&#39;amministrazione, la colite è di solit...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente / apparecchiatura: </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> Eppendorf Safe-Lock provetta (2 ml) </td><td> eppendorf </td><td> 0030 120.094 </td><td></td></tr><tr><td> Biotek EL808 Assorbanza lettore di piastre </td><td> Biotek </td><td> EL808 </td><td></td></tr><tr><td> Destrano solfato di sodio per reagenti sale (peso molecolare 36,000-50,000 Da) </td><td> MP Biomedicals </td><td> 160110 </td><td></td></tr><tr><td> Gen 5 (software) </td><td> Biotek </td><td> Versione 1.10.8 </td><td></td></tr><tr><td> Esadeciltrimetilammonio bromuro (HTAB) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H5882-100G </td><td></td></tr><tr><td> Perossido di idrogeno, il 30 wt.% Soluzione in acqua </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 216763 </td><td> Conservare a 2-8 ° C </td></tr><tr><td> Microtest plmangiava da 96 pozzetti fondo piatto </td><td> Sarstedt </td><td> 82,1581 </td><td> Da utilizzare una sola </td></tr><tr><td> o-dianisidina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D-3252 </td><td> Sensibile alla luce. Conservare a 2-8 ° C </td></tr><tr><td> Fosfato di potassio dibasico </td><td> Caledon </td><td> 6620-1 </td><td></td></tr><tr><td> Fosfato di potassio, monobasico </td><td> EMD chimici </td><td> PX1565-1 </td><td></td></tr><tr><td> Inibitori della proteasi cocktail </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P8340 </td><td> Conservare a -20 ° C </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T8787 </td><td></td></tr><tr><td> Tungsteno perline in metallo duro per Tissue Lyser II </td><td> QUIAGEN </td><td> 69997 </td><td></td></tr></tbody></table>

indagare infiammazione intestinale in dss-indotta modello di ibd

Investigating Intestinal Inflammation in DSS-induced Model of IBD

La malattia infiammatoria intestinale (IBD) comprende una vasta gamma di patologie intestinali, le più comuni delle quali sono la colite ulcerosa (UC) e la malattia di Crohn (CD). Entrambe le UC e CD, quando presenti nel colon, generare un profilo simile sintomo che può comprendere diarrea, sanguinamento rettale, dolore addominale e perdita di peso. 1 Sebbene la patogenesi della malattia infiammatoria intestinale rimane sconosciuta, è descritto come una malattia multifattoriale che coinvolge sia componenti genetiche e ambientali 2. Ci sono modelli animali numerosi e variabili di infiammazione del colon che assomigliano a diverse caratteristiche di IBD. Modelli animali di colite gamma da quelli che nascono spontaneamente in ceppi sensibili di alcune specie a quelli che richiedono la somministrazione di concentrazioni specifiche di colite che inducono prodotti chimici, come il sodio destrano solfato (DSS). Chimica indotta modelli di infiammazione dell&#39;intestino sono i modelli più comunemente utilizzati e meglio descritta di IBD. ADMINIdimostrazione di DSS in acqua potabile produce colite acuta o cronica a seconda del protocollo di amministrazione 3. Animali dato DSS perdita di peso e mostrano segni di feci molli o diarrea, a volte con evidenza di sanguinamento rettale. 4,5 Qui si descrivono le modalità con cui sviluppo colite e la risposta infiammatoria risultante può essere definita dopo la somministrazione di DSS. Questi metodi includono l&#39;analisi istologica di ematossilina / eosina sezioni del colon macchiato, la misurazione di citochine pro-infiammatorie, e la determinazione della mieloperossidasi (MPO) attività, che può essere utilizzato come marker surrogato di infiammazione 6. L&#39;entità della risposta infiammatoria in stato di malattia può essere valutata la presenza di sintomi clinici o alterazioni istologiche nel tessuto della mucosa. Colon danno istologico viene valutata utilizzando un sistema di punteggio che considera la perdita di architettura cripta, infiltrazione di cellule infiammatorie, muscolari tascesso hickening, deplezione delle cellule caliciformi, e la cripta. 7 Quantitativamente, i livelli di citochine pro-infiammatorie acute con proprietà antinfiammatorie, come l&#39;interleuchina (IL)-1β, IL-6 e fattore di necrosi tumorale (TNF)-α, si può determinare con ELISA metodi convenzionali. Inoltre, l&#39;attività MPO può essere misurata mediante un saggio colorimetrico e utilizzato come un indice di infiammazione 8. Nella colite sperimentale, la gravità della malattia è spesso correlato con un aumento dell&#39;attività MPO e più elevati livelli di citochine pro-infiammatorie. Gravità colite e l&#39;infiammazione associati danno può essere valutata esaminando la consistenza delle feci e sanguinamento, oltre a valutare lo stato istopatologici dell&#39;intestino con ematossilina / eosina sezioni colorate di tessuto del colon. Frammenti di tessuto del colon può essere utilizzato per determinare l&#39;attività MPO e produzione di citochine. Nel loro insieme, queste misure possono essere utilizzate per valutare la risposta infiammatoria intestinalemodelli animali di colite sperimentale.

Modelli sperimentali di malattia infiammatoria intestinale, ci hanno permesso di esaminare il complesso di risposte innate e adattative immunitario associate con patogenesi. Utilizzando il punteggio istologico, la quantificazione di citochine pro-infiammatorie e di attività mieloperossidasi, si può cominciare a valutare queste risposte visto nella malattia infiammatoria intestinale.

Indagare infiammazione intestinale in DSS-indotta Modello di IBD

Le malattie infiammatorie intestinali (IBD) comprendono una serie di patologie intestinali, tra le quali le più comuni sono la colite ulcerosa (UC) e la malattia di Crohn...

L'obiettivo generale di questa procedura è valutare la risposta immunitaria intestinale indotta dal sodio dextran solfato determinando le quantità di attività della mieloperossidasi e delle citochine pro-infiammatorie prodotte in risposta all'infiammazione. In primo luogo, la colite da DSS viene indotta nei topi mediante l'introduzione di una soluzione di sale DSS nell'acqua da bere. Successivamente, la gravità della malattia viene valutata mediante punteggio macroscopico e il colon viene asportato per ulteriori analisi.Il colon isolato viene quindi sezionato in tre frammenti per l'analisi istologica, la quantificazione delle citochine e l'attività NPO. Infine, il tessuto del colon viene omogeneizzato e il soprannatante viene utilizzato per determinare l'attività della MPO. In ultima analisi, le variazioni dell'attività della MPO possono essere determinate dai dati di assorbanza raccolti mediante uno spettrofotometro.Questo metodo può fornire informazioni dettagliate sullo stato cronico di diversi modelli di malattia infiammatoria intestinale, come la colite indotta da DSS e da TNBS. Inoltre, è possibile utilizzare questo metodo anche in altri organi, come polmone e fegato. Prima di iniziare la procedura, sostituire l'acqua da bere in ogni gabbia dei topi con una soluzione di DSS per indurre l'infiammazione.Somministrare ai topi di controllo acqua potabile sterilizzata in autoclave senza DSS. Quindi, nel giorno dell'esperimento, dissezionare il colon come precedentemente dimostrato nell'articolo di JoVE di Whitham Williams e Williams. Espellere delicatamente le feci da tutto il colon utilizzando una pinzetta piegata, raccogliendole su un foglio per pesatura mediante risciacquo del tessuto con PBS sterile.Valutare le feci utilizzando una pinza per premere sulle feci e determinarne la consistenza al fine di assegnare un punteggio alla presenza di sangue nelle feci. Notare il colore delle feci e confermare ulteriormente la valutazione mediante un test emoccult, che prevede l’applicazione di feci su carta emoccult, l’aggiunta del reagente sviluppatore e l’osservazione del colore blu, indicativo di un test positivo per sangue occulto nelle feci. Utilizzare quindi questa tabella per determinare un valore per ciascuna delle condizioni.Successivamente, mantenendo l'orientamento prossimale-distale del colon, tagliare il colon in tre sezioni uguali. Prelevare quindi frammenti campione dalle sezioni prossimale e mediale del colon, e posizionare i campioni in singole provette eppendorf da 1,5 millilitri. Per valutare il danno istologico della gravità della colite, utilizzare la sezione tissutale più distale del colon e tagliare un piccolo frammento lungo da mezzo a un centimetro.Posizionare il frammento in una cassetta per tessuti e immergere la cassetta in soluzione di formalina al 10% tamponata. Successivamente, dopo aver preparato sezioni trasversali in paraffina dei frammenti di tessuto, colorare le sezioni con ematossilina ed eosina per la valutazione da parte di un osservatore in cieco. Infine, congelare i campioni provenienti dalle sezioni prossimali e medie del colon in azoto liquido e conservarli fino all'uso a meno 70 gradi Celsius.Dopo aver prelevato i campioni di colon dal congelatore a meno 70 gradi Celsius, posizionarli sul ghiaccio. Quindi, utilizzando pinze piegate, rimuovere eventuali feci o grasso visibili e inserire i campioni in provette individuali da due millilitri adatte all'uso in un omogeneizzatore. Successivamente, determinare e registrare il peso di ciascun campione.Successivamente, aggiungere le perle del disomogeneizzatore a ciascuna provetta campione e quindi aggiungere la quantità appropriata di buffer H tab alla provetta in base al peso del tessuto appena determinato; dissociare i frammenti con un disomogeneizzatore tissutale per quattro minuti a 30 hertz. Infine, centrifugare la soluzione cellulare per sei minuti a 13.400 ×g e a quattro gradi Celsius. Raccogliere il soprannatante in una provetta pulita e, assicurandosi di mantenere le perle del disomogeneizzatore, scartare il pellet risultante.Il soprannatante può quindi essere conservato a meno 70 fino all'uso. Iniziare questo passaggio aggiungendo sette microlitri dell'omogenato tissutale precedentemente preparato in triplice replicato in una piastra a 96 pozzetti. Quindi aggiungere 50 microlitri di perossido di idrogeno diluito all'iodio OD Dion appena preparato.Utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere 200 microlitri della miscela di perossido di idrogeno in ciascun pozzetto. Successivamente, misurare l'assorbanza a 550 nanometri mediante uno spettrofotometro, effettuando tre letture a intervalli di 32 secondi. Poi, utilizzando i dati di assorbanza, il peso del tessuto e il volume del tampone, calcolare l'attività di NPO negli omogenati come illustrato in questo esempio di calcolo.Per tutta la durata del trattamento con DSS, l'indice di attività della malattia può essere utilizzato per valutare e monitorare l'evoluzione clinica della patologia. Gli animali trattati con DSS mostrano una significativa perdita di peso rispetto ai loro pesi iniziali, feci molli e sanguinamento fecale. Maggiore è il danno rispetto ai sistemi macroscopici, più elevato sarà l'indice di attività della malattia.Dopo l'eutanasia e l'esame dei colon di topi a cui era stato somministrato il 5% di DSS nell'acqua da bere per cinque giorni, la gravità della colite, valutata in base al punteggio macroscopico derivante dall'accorciamento della lunghezza del colon, al sanguinamento colico, al sangue nelle feci, alla riduzione della consistenza delle feci e ai segni di sanguinamento rettale, è risultata in questo esperimento rappresentativo circa cinque volte maggiore rispetto ai controlli trattati solo con acqua, come dimostrano queste sezioni trasversali dei campioni di tessuto colico trattati con DSS. Analogamente, le sezioni colorate con ematossilina ed eosina (h&e) presentano punteggi istologici più elevati rispetto ai controlli trattati con acqua. Qui, nell'area indicata dall'asterisco in questa sezione trasversale colorata con h&e, prelevata da un animale controllo che aveva ricevuto solo acqua, si osserva l'architettura normale e l'assenza di infiltrato cellulare. Confrontare ora la colorazione h&e di un campione proveniente da un animale trattato con DSS con la figura precedente.Il colon di questo animale mostra un danno istologico maggiore, evidenziato da un aumento dell'infiltrazione cellulare indicato dal simbolo di cancelletto, da una maggiore deplezione delle cellule caliciformi e da una distorsione più accentuata. Danno all'architettura delle cripte K indicato dall'asterisco. Per caratterizzare ulteriormente l'entità della gravità della malattia nei topi trattati con DSS, l'attività di NPO, un marcatore surrogato dell'infiammazione, può essere valutata da campioni di tessuto colonnare omogeneizzato.Come previsto, i colon trattati con DSS presentano un'attività NPO maggiore rispetto ai controlli. Inoltre, la gravità della colite indotta da DSS è associata a livelli aumentati di citochine pro-infiammatorie, come IL-1β, IL-6 e TNF-α. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare che l'attività MPO può diminuire nel tempo.Pertanto, il saggio MPO dovrebbe essere uno dei primi saggi da eseguire per determinare la gravità dell'infiammazione intestinale.

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Destrano sodio solfato (DSS) somministrata in acqua potabile è un consolidato modello murino lesioni infiammatorie di colite acuta. Questo protocollo descrive il metodo per il trattamento DSS e la preparazione dei tessuti.

Colite Modeling murino utilizzando destrano sodio solfato (DSS)

Questo video dimostra una tecnica per generare un modello murino di colite indotta da sostanze chimiche, una malattia infiammatoria intestinale. Al topo è consentito consumare una soluzione di destrano solfato di sodio (DSS) per una durata adeguata. Dopo il consumo, il DSS danneggia il muco e la barriera dello strato epiteliale nel colon, consentendo ai microbi intestinali di entrare nel tessuto sottostante, dove vengono percepiti dalle cellule immunitarie residenti per mediare una risposta...

Una tecnica per generare un modello murino di colite indotta da destrano solfato di sodio

Questo video dimostra il metodo di colorazione con ematossilina ed eosina (H&amp;E) per valutare il danno al colon in un modello murino di colite indotta da DSS, una malattia infiammatoria intestinale. Dopo aver isolato il colon da un topo trattato con DSS e aver ottenuto sezioni del tessuto, la colorazione H&amp;E delle sezioni aiuta a identificare il danno tissutale mediato dall'infiammazione.

Colorazione con ematossilina ed eosina per valutare il danno al colon nella colite indotta da DSS

DNBS / TNBS colite indotta offre un metodo alternativo e poco costoso per studiare la pathobiology delle malattie infiammatorie intestinali. Il protocollo descritto in questo documento delinea l'applicazione di successo di DNBS per indurre colite in topi e ratti e permette di studiare a fondo le risposte intestinale ospite-mediata.

DNBS / TNBS Colite Modelli: Fornire Insights Into malattia infiammatoria intestinale e gli effetti di grassi

Una valutazione accurata degli effetti antinfiammatori è della massima importanza per la valutazione di potenziali nuovi farmaci per il trattamento della malattia infiammatoria intestinale. La microscopia olografica digitale fornisce la valutazione dell'infiammazione in campioni di tessuto del colon murino e umano, nonché la valutazione multimodale automatizzata della guarigione delle ferite epiteliali in vitro.

Multimodale Quantitative Phase Imaging con Digital olografico microscopia Valita accuratamente guarigione infiammazione intestinale e epiteliale della ferita

Gli attuali trattamenti di malattie infiammatorie croniche intestinali (IBD) hanno lo scopo di alleviare i sintomi della malattia, ma possono causare gravi effetti collaterali. Così, strategie alternative sono allo studio in modelli animali colite. Qui, viene spiegato come gli effetti benefici della dieta completa sui segni clinici IBD sono analizzati in un tale modello di colite.

Analizzando Effetti benefici dei supplementi nutrizionali sulle funzioni intestinali epiteliali barriera durante Experimental Colitis

Specifica della destinazione sonde rappresenta uno strumento innovativo per l'analisi dei meccanismi molecolari, come espressione della proteina in vari tipi di malattia (ad es., infiammazione, infezione e tumorigenesi). In questo studio, descriviamo una valutazione tomografica tridimensionale quantitativa di infiltrazione del macrofago intestinale in un modello murino di colite usando la tomografia di fluorescenza-mediata specifica per F4/80.

Fluorescenza-mediata di tomografia per la rilevazione e la quantificazione di infiammazione intestinale murina del macrofago-correlati

Qui presentiamo un protocollo per studiare l'effetto di annullamento dei geni legati al gustazione sulle risposte immunitarie in un sodio del solfato del dextrano (DSS)-infiammatorie intestinali (IBD) la malattia del mouse modello indotto.

Effetti del gusto segnalazione proteina Abolishment su infiammazione dell'intestino in un modello murino di malattia infiammatoria intestinale

Il punteggio sistematico dell'infiammazione intestinale utilizzando un sistema assistito da computer gratuito è un potente strumento per confrontare quantitativamente i cambiamenti istopatologici nei modelli di colite caratterizzati dalla presenza di ulcere e cambiamenti infiammatori. La valutazione del punteggio della colite istologica rafforza le osservazioni cliniche e facilita l'interpretazione dei dati.

Analisi sistematica del punteggio per l'infiammazione intestinale in un modello di colite indotta da solfato di sodio di Murine

Jared Leadbetter spiega perché la termite-gut comunità microbica è un sistema eccellente per studiare le complesse interazioni tra microbi. Il rapporto simbiotico esistente tra l'insetto ospite e lignocellulosa-degradanti microbi intestinali si spiega, così come gli usi industriali di questi microbi per la biomassa vegetale degradante e biocarburanti di generazione.

Indagare la comunità microbica nel hindgut Termite - Intervista

Impara a valutare la risposta immunitaria intestinale nella colite indotta da DSS nei topi, misurando l'attività della mieloperossidasi e le citochine pro-infiammatorie. Questo metodo fornisce informazioni chiave sui meccanismi dell'IBD.

Indagare infiammazione intestinale in DSS-indotta Modello di IBD

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