Segmentazione e misurazione dei volumi FAT nei modelli murini di obesità Utilizzo di X-ray Tomografia Computerizzata

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di ottenere immagini non invasive, quantificare e visualizzare il contenuto di grasso nei topi vivi. Questo risultato si ottiene innanzitutto eseguendo una scansione TC a raggi X del topo. Il secondo passaggio della procedura consiste nel segmentare e quantificare i volumi di grasso all'interno del topo in base alla densità radiologica.

Il terzo passaggio consiste nel visualizzare i dati TC in tre dimensioni, con i volumi di grasso evidenziati in rosso. In definitiva, i risultati possono consentire la quantificazione e la visualizzazione del contenuto di grasso durante studi longitudinali in vivo mediante una TC a raggi X albia, abbinata ai pacchetti software PMOD e VolView. Uno dei principali vantaggi di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'analisi ex vivo, è che essa permette una valutazione non invasiva e longitudinale del grasso in modelli animali di piccole dimensioni per lo studio delle malattie.

Generalmente, le persone nuove a questo metodo incontreranno difficoltà poiché il protocollo di segmentazione e visualizzazione comprende diversi passaggi che devono essere completati in successione. Inoltre, è necessario utilizzare i parametri ottimali dei raggi X durante l'acquisizione. Per ottenere il migliore contrasto dal tessuto adiposo, iniziare anestetizzando i topi obesi di interesse mediante una camera di induzione, quindi trasferirli su un cono nasale.

Mantenere l'anestesia durante l'acquisizione delle immagini posizionando i topi in un lettino standard per ratti con gli arti laterali rispetto al tronco. Questo garantisce un'acquisizione TC uniforme. Impostare il sistema TC per scansionare un lettino di lunghezza pari a 115 millimetri utilizzando 600 proiezioni.

Impostare la sorgente a raggi X a 200 microampere e 45 chilovolt picco e utilizzare un filtro in alluminio da 0,5 millimetri per indurire il fascio. La dose profonda equivalente di radiazione che il topo riceverà con questa impostazione è di circa 220 milli sievert, mentre l'equivalente di dose superficiale è di 357,4 milli sievert sul computer. Selezionare l'algoritmo FBP utilizzando parametri standard per la ricostruzione dell'immagine.

Infine, l'immagine finale è composta da voxel isotropi di 125 micron, foxholes, ed è utilizzabile per l'analisi dell'immagine dell'intero animale. L'analisi dell'immagine viene eseguita utilizzando il software di analisi PMOD: inizialmente PMOD segmenta le immagini in base alla densità del tessuto e successivamente al volume di grasso. Dopo aver caricato l'immagine, ridurne le dimensioni per minimizzare il carico computazionale.

Passare alla scheda della vista principale, selezionare strumenti seguito da riduci. Impostare i valori di riduzione a due per X, due per Y e due per Z, selezionare sostituisci ed eseguire il processo. Quando il processo è completato, appare una finestra di messaggio.

Per eliminare gli elementi del letto e del cono nasale dalle immagini, mascherarli prima dell'analisi VOI. Passare ai layout dei piani, rotazioni, marcatori 3D specchiati e selezionare piani e layout. Selezionare mostra piano Z. Quindi scorrere fino al cono nasale nel piano Z.

Successivamente, selezionare la scheda principale VOI e scegliere disegna vertici. Disegnare una ROI attorno al naso, escludendo il letto e il cono nasale, quindi selezionare copia ROI effettiva su ciascuna. Sezionare con l'elemento del cono nasale.

Incollare l'ROI dall'area di attesa sul naso secondo necessità. Utilizzare il comando del gruppo di modifica dei vertici per regolare gli ROI. Quando i coni nasali non sono più visibili, eliminare l'ROI e generare un VOI per racchiudere la circonferenza dell'animale.

Accedi agli strumenti VOI, quindi a mascheramento e algebra. Inserisci meno 1000 nella casella di dialogo fornita. Successivamente, seleziona il pulsante con la dicitura "Maschera i voxel al di fuori dei VOI selezionati".

Quando viene visualizzato il messaggio operazione dati irreversibile, si desidera continuare?, selezionare sì. Ora passare a piani, layout, rotazioni, marcatori 3D speculari e infine, piani e layout. Selezionare mostra tutti i piani.

Esaminare l'integrità della VOI. Quando la VOI appare corretta, salvarla come file analyze e modificare il prefisso del nome del file. Procedere con la segmentazione dell'immagine per il volume totale dell'animale.

Iniziare selezionando strumenti ed esterni. Quindi selezionare la casella di controllo per la segmentazione. Impostare un intervallo da meno 300 a più 3.500 ed eseguire la segmentazione.

Quindi selezionare le statistiche VOI, che riportano valori statistici rappresentativi del volume totale. Prendere nota di questo volume. Ora segmentare l'immagine per il volume di grasso, tornando innanzitutto all'immagine non segmentata.

In secondo luogo, carica il file di dati di massa salvato e seleziona la casella di analisi nella finestra di caricamento. Successivamente, seleziona strumenti ed esterni. Quindi, seleziona la casella di controllo della segmentazione.

Inserire un intervallo compreso tra -200 e -50 ed eseguire la segmentazione. Dopo aver approvato i risultati, selezionare VOI.Statistics. Si noti che le statistiche riportate rappresentano il volume di grasso.

Salvare i risultati nel formato analizzato e assegnare un prefisso univoco al nome del file. Tuttavia, se persistono densità cutanee o periferiche, utilizzare il protocollo di erosione e dilatazione per eliminare queste regioni nell'analisi del VOI. Prima di salvare, accedere a strumenti esterni e selezionare la casella di controllo morfologica nella nuova finestra.

Selezionare l'erosione seguita da. OK, tornare alla casella di controllo morfologica e selezionare la dilatazione e OK, verificare che il problema relativo alla densità cutanea o periferica sia stato risolto e salvare i risultati. Utilizzare il pacchetto software Volvo View versione 3.2 per creare visualizzazioni 3D rese delle immagini segmentate.

Iniziare aprendo il set di dati TC salvato in formato analyze. Utilizzare le impostazioni predefinite nella finestra di pop-up, quindi aprire il menu plugin e, nella sezione utilità, selezionare unisci volumi. Deselezionare la ridimensionamento dei componenti.

Fare clic su Assegna secondo input. Scegliere i dati del grasso segmentato come secondo input e utilizzare le impostazioni predefinite nella finestra popup. Quindi applicare il plugin per una visualizzazione ingrandita del topo in esame.

Fare doppio clic sulla finestra di visualizzazione del volume. Tornare alla scheda colore/opacità. La casella a discesa componente indica quale dataset è attualmente in fase di modifica.

Sono presenti due cursori nella parte inferiore della scheda. Essi determinano la luminosità relativa di ciascun set di dati componente all'interno della sovrapposizione, utilizzando valori compresi tra zero e uno. Per cambiare il colore in scala di grigi, ad esempio, andare alla sezione di mappatura del colore della scala.

Fare doppio clic su uno dei cursori e trascinarlo fuori dalla casella. Aggiungere un secondo cursore facendo clic in un punto qualsiasi all'interno dell'area del cursore. Impostare il cursore del colore sinistro su nero e il cursore del colore destro su bianco.

Successivamente, passare alla casella di mappatura dell'opacità scalare e creare un nuovo punto facendo clic all'interno della casella. In questo modo si otterranno in totale tre punti nella finestra per il punto centrale. Modificare il valore scalare a circa meno 3000 e impostare il valore di opacità a zero.

A destra della finestra si trova il terzo punto; modificarne il valore scalare a circa 32.000 e l'opacità a 0,25. Il primo punto può trovarsi ovunque a sinistra, purché il valore di opacità sia impostato a zero. Con lo scalare impostato, passare al componente due, che dovrebbe modificare l'aspetto del grasso, e cambiare ciascun cursore del colore in rosso facendo doppio clic e spostando il cursore della tonalità H fino all'estremità.

Questo colora falsamente il grasso in rosso. Per creare un filmato di rotazione a tre pannelli che mostri il grasso alla TC e la sovrapposizione, prima di tutto fare clic e trascinare il topo del soggetto in posizione eretta con la schiena rivolta verso l'alto. In secondo luogo, sotto pesi dei componenti, impostare il valore del componente due a zero in modo che venga visualizzata solo la scansione TC. In terzo luogo, fare clic su revisione, seguito da fotocamera, e selezionare un numero di fotogrammi per il filmato di rotazione. In quarto luogo, modificare il valore di rotazione X a 360 gradi.

Quindi selezionare "create" nella finestra di dialogo popup. Creare una nuova cartella denominata CT e salvare il file in formato TIF, il che produrrà una serie di immagini di rotazione. Ripetere questi passaggi anche per l'immagine del grasso e per l'immagine sovrapposta di grasso e TC, salvando le rispettive immagini di rotazione in cartelle separate. Per generare un filmato di rotazione a partire dalle immagini ottenute, aprire ImageJ e importare le sequenze di immagini.

Selezionare la prima immagine nella cartella CT e le altre verranno selezionate automaticamente. Ripetere questo processo per le sequenze del tessuto adiposo e di sovrapposizione con uno dei pacchetti. Ancora aperto.

Aprire il gestore delle aree di interesse (ROI). Si trova in analizza strumenti, quindi nel gestore ROI disegnare un'area di interesse attorno al topo sottoposto a esame, escludendo i pixel di sfondo non necessari. Al termine, fare clic su aggiungi nel gestore ROI.

Quindi, applicare la stessa ROI a ogni sequenza di immagini. Quando la ROI è presente su tutti gli stack, fare clic con il tasto destro. All'interno della ROI, selezionare, duplicare e scegliere. Verificare lo stack duplicato.

Questo separa la regione di interesse (ROI) dal resto dell'immagine. Ora chiudere gli stack di immagini più grandi e ripetere questa procedura per tutte e tre le sequenze di immagini. Per combinare gli stack, utilizzare il comando combine, che si trova in stack, quindi strumenti.

Selezionare l'immagine TC come stack uno e l'immagine del tessuto adiposo come stack due. Quindi ripetere il processo, selezionando gli stack appena combinati come stack uno e l'immagine sovrapposta come stack due.

Questa operazione completa la creazione di un insieme di rotazione dell'immagine a tre pannelli. Anteprima l'insieme selezionando il pulsante di riproduzione nell'angolo in basso a sinistra della finestra dell'immagine. Quindi salvarlo come filmato A VI.

Sono stati utilizzati topi obesi B six V LE OB J per illustrare la fattibilità del sistema Alber CT. Per le misurazioni del contenuto di grasso basate sulla TC, sono stati confrontati con i tipi selvatici C 57 black six. A sinistra è mostrato il volume totale alla TC di un topo obeso.

Al centro è mostrato il volume di grasso in rosso, mentre a destra si trova la sovrapposizione. Un'analisi simile effettuata su animali di tipo selvatico mostra la notevole differenza nel contenuto di grasso rispetto al topo obeso. Per ogni animale sono stati calcolati il volume totale, il volume di grasso e i rapporti volumetrici.

Il rapporto medio tra volume adiposo e volume totale per il gruppo di tipo selvatico e per il gruppo obeso è stato rispettivamente di 0,09 e 0,42. Questi valori differiscono in modo significativo con un valore P di 0,001. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe acquisire una solida comprensione di come segmentare i volumi adiposi all'interno di un set di dati TC di un topo vivo, una volta padroneggiato il metodo.

Questa tecnica richiede meno di 30 minuti per essere eseguita. Grazie per averci guardato, e ci rivedremo la prossima volta.