Creazione transitori pori della membrana cellulare utilizzando una stampante a getto d'inchiostro standard

L'obiettivo generale di questa procedura è creare pori transitori nelle membrane cellulari utilizzando la stampa a getto d'inchiostro. Ciò si ottiene modificando prima una stampante a getto d'inchiostro standard. Il secondo passaggio consiste nello svuotare e pulire una cartuccia di inchiostro della stampante di serie per consentire l'inserimento dell'inchiostro biologico.

Successivamente, le cellule di interesse vengono sospese in una soluzione di monomeri di acton marcati in fluorescenza e PBS per creare la soluzione di bio inchiostro. Il passaggio finale consiste nel stampare l'inchiostro biologico sui vetrini del microscopio utilizzando la stampante e la cartuccia modificate. In definitiva, la microscopia fluorescente può essere utilizzata per dimostrare che i quattro monomeri di actina G coniugati di Fluor sono stati internalizzati dalle cellule stampate attraverso i pori transitori della membrana.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto alle tecniche standard di trasfezione e microiniezione cellulare è che questa tecnica di stampa è facile da usare e produce un'elevata vitalità cellulare. Sebbene questa tecnica possa fornire informazioni sulla genetica, può essere applicata anche ad altri campi di studio come la biofisica cellulare e l'ingegneria tissutale in biofisica cellulare. Questa tecnica può essere utilizzata per osservare facilmente il citoscheletro di una cellula durante la migrazione cellulare.

Abbiamo avuto l'idea di questo metodo per la prima volta quando volevamo essere in grado di visualizzare i cambiamenti nella disposizione del citoscheletro dovuti alle forze applicate sulle cellule. Iniziare sbloccando i fermagli di plastica dalla base inferiore della stampante, quindi sollevare lentamente la custodia di plastica superiore. Quindi staccare il pannello luminoso del display dei pulsanti dalla parte superiore della stampante, lasciandolo collegato alla scheda madre della stampante.

Usando salviette Kim ed etanolo. Pulire l'interno della stampante, in particolare le aree in cui si trova la cartuccia d'inchiostro e dove avviene la stampa. Quindi, individuare il cavo che alimenta i meccanismi di alimentazione della carta per la scrivania HP Jet 500.

Si trovano appena sotto il vassoio della carta a sinistra della parte anteriore e scollegano i cavi dalla scheda madre. Ora individua il meccanismo di rilevamento della carta e fissa un anello di filo alla leva di plastica grigia che si trova sopra e dietro il meccanismo di alimentazione della carta da stampa per fungere da maniglia manuale, posiziona un tavolino qui. Il supporto di spedizione in schiuma per 15 provette da centrifuga viene utilizzato con diversi vetrini da microscopio fissati con nastro adesivo nella regione di stampa davanti al meccanismo di alimentazione della carta per portare i vetrini di stampa desiderati a un livello appena sotto la testina di stampa della cartuccia.

Infine, per mantenere la tecnica asettica, posizionare la stampante all'interno di una cappa a flusso laminare. Iniziare rimuovendo la cartuccia dalla confezione, lasciando il nastro protettivo che copre i contatti della stampante e la testina di stampa. Stabilizzare il corpo della cartuccia con un morsetto lasciando la parte superiore verde libera da qualsiasi ostacolo utilizzando un utensile da taglio rotante portatile.

Tagliare la parte superiore verde della cartuccia, svuotare l'inchiostro rimanente dal serbatoio, quindi rimuovere il nastro protettivo di plastica che copre i contatti della stampante e la testina di stampa. È probabile che l'acqua fuoriesca dalla testina di stampa durante questo processo, ma non danneggi la cartuccia. Quando l'acqua scorre limpida, lasciare asciugare la cartuccia.

Per mantenere un ambiente di stampa pulito, iniziare immergendo completamente la cartuccia in un becher pieno di acqua deionizzata, quindi sonicare la cartuccia per 15 minuti. Dopo la sonicazione, rimuovere la cartuccia e scuotere l'acqua in eccesso. Spruzzare il 70% di etanolo nella cartuccia per creare un ambiente più asettico.

Dopo aver raccolto le cellule di interesse, centrifugare le cellule in cinque millilitri di terreno fresco in una provetta da centrifuga conica da 15 millilitri per cinque minuti a 250 volte G a temperatura ambiente. Quindi, aspirare il terreno e quindi risospendere le cellule una volta da 10 a 5 cellule per millilitro in una soluzione madre fluorescente di actina G appena preparata Per creare l'inchiostro biologico, si noti che 250 microlitri di inchiostro biologico stampano tre vetrini coprioggetti con il motivo a linee mostrato qui. Dopo che la stampante è stata accesa e riscaldata, posizionare qui la superficie di stampa desiderata, vengono utilizzati vetrini coprioggetto da 22 millimetri per 22 millimetri al centro del tavolino precedentemente assemblato.

Quindi, apri un programma software di disegno e seleziona il modello desiderato. A questo punto, pipettare circa 100-120 microlitri di sospensione cellulare nel piccolo pozzetto circolare sul fondo del vano cartucce. Stampare il file quando la stampante si riscalda di nuovo, la cartuccia si sposterà in posizione pronta.

Quando la cartuccia si sposta leggermente a sinistra dell'inchiostro, gocciola bene e rimane lì. Tirare verso l'alto il meccanismo di alimentazione della carta, il filo e la stampa inizieranno. La stampante stamperà sul vetrino di copertura posto al centro della fase di stampa utilizzando una stampante HP desk jet 500 con un inchiostro bio costituito da una sospensione di cellule di fibroblasti in una soluzione di monomero di actina G.

All'interno di una serie HP 26, le celle delle cartucce d'inchiostro venivano stampate sui vetrini dei vetrini dei microscopi. Questa figura illustra un risultato rappresentativo di cellule di fibroblasti stampate che mostrano monomeri di actina fluorescenti incorporati. Questo modello è stato utilizzato nella figura precedente per creare una linea continua della soluzione di stampa sulla maggior parte del vetrino del microscopio.

In questa figura, è mostrata la linea retta in cui il biolegame e le cellule si sono depositati reciprocamente. Si noti che subito dopo la stampa, c'è un aumento della fluorescenza di fondo perché la soluzione di biolink in cui sono sospese le cellule contiene monomeri di actina fluorescenti liberi in eccesso che incubano le cellule per circa 10 minuti dopo la stampa facilitano l'adesione al vetrino, consentendo alla soluzione di monomero in eccesso di essere lavata dal substrato con terreni di crescita freschi riducendo significativamente la fluorescenza di fondo. Qui, un'immagine rappresentativa di tre fibroblasti T tre stampati in una zona di stampa localizzata, come mostrato questa fotomicrografia al microscopio fluorescente di una cellula presa 15 minuti dopo la stampa mostra giin in verde, il nucleo in blu e la sovrapposizione sia dell'actina GI che del colorante nucleare.

Le due immagini successive mostrano la microscopia fluorescente di due fibroblasti in un modello di linee tre ore dopo la stampa. Questa prima immagine mostra monomeri di actina marcati in fluorescenza all'interno delle cellule. Questa seconda immagine è una sovrapposizione del canale fluorescente con l'immagine di sfondo per mostrare che, sebbene possano esserci dei detriti sulla diapositiva nell'angolo in basso a sinistra, non è fluorescente.

Infine, viene presentato un gruppo di controllo di cellule non stampate incubate per tre ore con monomeri marcati in fluorescenza per dimostrare che i monomeri non possono penetrare la membrana cellulare senza permeazione della membrana mediante stampa cellulare. Durante il tentativo di questa procedura, è importante avere diverse cartucce pulite e pronte per l'uso poiché l'intasamento della stampante è uno dei problemi che rallenta questa tecnica. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come convertire una stampante desktop standard per stampare cellule viventi, che aiuta a creare una forza transitoria della membrana.