Determinazione ottimale attività citotossica di specifiche cellule T umane Her2neu CD8 confrontando il Cr51 saggio di rilascio al Sistema xCELLigence

L'obiettivo generale del seguente esperimento è determinare l'attività citotossica delle cellule T confrontando un approccio basato sull'impedenza utilizzando il sistema EXOGEN con il saggio di rilascio di cromo. Il primo passo si ottiene separando le cellule mononucleate del sangue periferico dal sangue intero utilizzando il fial. Successivamente, le PBMC vengono aggiunte ai pozzetti insieme all'antigene peptidico, all'IL 2 ricombinante umano e alle PBMC irradiate per creare otto cellule T CD specifiche per l'antigene.

Le otto cellule T CD specifiche dell'antigene vengono quindi co-coltivate con cellule tumorali in entrambi i saggi al fine di causare la morte delle cellule tumorali. Si ottengono risultati che mostrano la percentuale di lisi delle cellule tumorali utilizzando sia il metodo dell'impedenza che il saggio di rilascio del cromo. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come il test di rilascio del cromo, è che il sistema basato sull'impedenza raccoglie dati in tempo reale e richiede meno cellule che non necessitano di alcuna marcatura. Per questo protocollo, il sangue proveniente da due donatori positivi HLA sani normali fornisce una fonte di pbmc o cellule mononucleate del sangue periferico seguendo il protocollo del produttore.

Utilizzare F call PA plus per separare i BMC P dal sangue. Successivamente, le piastre a sei pozzetti caricano circa 4 milioni di BMC P in due millilitri di terreno per pozzetto. A ciascuno, aggiungere bene HLAA due peptidi leganti per una concentrazione finale di 10 microgrammi per millilitro di coltura.

Le cellule a giorni alterni per aiutare a stimolare ed espandere le cellule T. Aggiungere terreni freschi integrati con IL 2 ricombinante umano per una concentrazione finale di 50 unità per millilitro. Dopo una settimana, preparare una coltura di pbmc autologo, irradiare le cellule e pulsarle per due ore con lo stesso hla.

Un peptide a due leganti a 10 microgrammi per millilitro restimola la coltura aggiungendo un millilitro di PBM CS autologo irradiato a ciascuno. Bene, continua ad aggiungere nuovi terreni integrati con IL due a giorni alterni dopo un'altra settimana, ristimola le colture allo stesso modo una seconda volta. Dopo altri sei giorni di coltura, le cellule saranno pronte per l'uso.

Preparare la stazione di misurazione dell'impedenza intelligente per l'uso bilanciandola a 37 gradi Celsius sotto il 5% di anidride carbonica per almeno un'ora. Raccogliere il 75% di cellule tumorali umane confluenti utilizzando lo 0,25% di tripsina e la centrifugazione. Contare le cellule tumorali utilizzando un emocitometro e ricostituirle in RPMI.

Mezzi tumorali a una concentrazione di 7.500 cellule per microlitro. Il programma successivo, il software agente Excel, imposta la pagina di layout con il layout del pozzo. Imposta la pagina di pianificazione per eseguire le letture dell'impedenza ogni cinque minuti per un periodo di 40 ore per le prime 18 ore, il sistema Xceligent prenderà solo le letture dell'impedenza delle cellule tumorali.

Quindi aggiungere 100 microlitri di terreno tumorale RPMI per pozzetto. Effettuare una lettura di fondo su tali EPL misurando l'impedenza in assenza di celle. Dopo aver aggiunto le cellule tumorali, caricare le piastre nella stazione e iniziare a effettuare le letture.

Le cellule tumorali inizieranno immediatamente ad aderire alle EPL. Dopo circa 18 ore di incubazione, le cellule tumorali si saranno attaccate alle EPL e saranno raddoppiate a 15.000 cellule tumorali per pozzetto. In questo momento, raccogliere le cellule T preparate mediante centrifuga di raschiatura delicata e agitazione.

Le cellule T, le ricostituiscono in terreno RPMI con il 10% di FBS e le contano utilizzando un emocitometro. Una volta nota la densità cellulare, preparare una doppia serie di diluizioni di cellule T in modo tale che quando 200 microlitri di cellule T vengono aggiunti alle cellule tumorali, la concentrazione più alta è di 40 cellule T per cellula tumorale. L'ultima diluizione della serie dovrebbe fornire 1,25 cellule T per cellula tumorale.

Mettere in pausa la stazione EXOGEN e rimuovere l'EPL utilizzando una pipetta. Rimuovere il terreno nei pozzetti, quindi caricare 200 microlitri di cellule T utilizzando tutte le concentrazioni della serie di diluizione come controllo negativo. Utilizzare terreni puri, riportare l'EPL alla stazione di trasmissione e continuare il programma al termine del saggio.

Normalizza i risultati. Seguire sempre le procedure istituzionali di sicurezza dalle radiazioni quando si lavora con cellule bersaglio marcate con cromo 51 e cromo 51 e utilizzare la schermatura per ridurre l'esposizione alle radiazioni. Inizia pulsando le cellule tumorali per due ore a 1 milione di cellule per millilitro con 10 microlitri per millilitro di cromo 51 fresco.

Successivamente, lavare le cellule tumorali in 10 millilitri di terreno RPMI con FBS al 10%, centrifugare le cellule e ricostituirle nello stesso terreno a 1 milione di cellule per millilitro. Quindi su una piastra inferiore rotonda da 96 pozzetti. Aggiungere 100.000 cellule tumorali per pozzetto per calcolare il rilascio spontaneo.

Non aggiungere nient'altro a sei di questi pozzi ad altri sei pozzi. Aggiungere 100 microlitri di Triton X 100 per licare le cellule e quindi calcolare il rilascio massimo in tutti i pozzetti rimanenti. Aggiungere le cellule T alla piastra utilizzando la serie di diluizione preparata in precedenza.

Ora incubare le piastre per cinque ore e raccogliere 50 campioni di microlitri di surnatante da ciascuna, caricare bene i campioni su una piastra luma dopo aver asciugato le piastre nella cappa durante la notte a temperatura ambiente. Misurare il loro CPM utilizzando una cellula T del contatore gamma e SKBR tre. Le cellule tumorali sono state coltivate su piastre X intelligence ed è stato misurato l'indice cellulare, che è un riflesso dell'impedenza della piastra perché le cellule T non richiedono aderenza per proliferare.

Il loro effetto sull'impedenza è stato trascurabile su una coltura di 40 ore. Le cellule tumorali coltivate da sole hanno mostrato una misurazione dell'impedenza crescente. Tuttavia, un'aggiunta di cellule T a 18 ore interrompe questa tendenza.

Questo evento richiede la normalizzazione del software dopo l'aggiunta di cellule T e viene ulteriormente studiato nel prossimo esperimento. Quando le cellule SK BR tre sono state co-coltivate con concentrazioni variabili di cellule T, le riduzioni dell'impedenza dipendevano chiaramente dalla dose di cellule T. I dati raccolti ogni cinque minuti in tre prove erano al termine delle 10 ore. Gli indici cellulari hanno seguito un polinomio del secondo ordine nell'intervallo delle cellule T, indicando che la stazione Exogen monitora la morte mediata da otto cellule T CD di tre tumori SK B in tempo reale come un calo dell'indice cellulare per determinare se le riduzioni dell'impedenza di SK BR 3 da parte delle cellule T erano specifiche per l'antigene.

SK KBR tre cellule sono state co-coltivate con HLA A, due cellule T positive specifiche per l'INFLUENZA che non riconoscono HER due nuove. Queste cellule avevano un'attività litica significativamente inferiore per determinare ulteriormente se le sue due nuove cellule T specifiche stavano uccidendo in modo antigene-specifico, l'anticorpo contro il ligando veloce è stato incorporato nelle co-colture. L'anticorpo non ha ridotto l'attività litica delle due nuove cellule T specifiche HER P 360 9.

Tuttavia, con le cellule T che sono state attivate in modo non specifico con anti-CD tre, perline CD 28, l'anticorpo ha inibito la lisi per determinare se l'uccisione stava avvenendo in modo dipendente dalla classe HLA uno. Alle cocolture sono stati aggiunti anticorpi anti HLA di classe uno o anticorpi di controllo isotipo. I risultati hanno fortemente supportato questa ipotesi.

Le cellule T sono state successivamente co-coltivate con altre cellule tumorali con un rapporto di uno a cinque. La linea cellulare tumorale HLA A due negativi BT 20 è stata utilizzata come controllo negativo. I risultati mostrano che il metodo è utile per più cellule tumorali aderenti bersaglio.

Le co-colture delle due nuove cellule T specifiche di HER P 360 9 sono state aggiunte alle cellule bersaglio marcate con cromo 51, seguite dall'analisi CRA. Il test di intelligenza sembra più sensibile per analizzare la coerenza. La variazione intra-test è stata calcolata come il coefficiente percentuale di variazione in ciascun rapporto cellulare compreso tra uno e 40 e uno e cinque.

Questo valore è stato misurato al di sotto del 15% con i rapporti cellulari più bassi. Tuttavia, la percentuale di CV era alta o imprevedibile. Inoltre, è stata esaminata la variabilità della lisi delle cellule T SK BR 3 mediante co-coltura con diverse linee di cellule T specifiche di P 360 9.

I dati sono stati generati a distanza di 30 giorni. I saggi sono stati eseguiti in triplicato e i risultati sono stati molto simili. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come determinare l'attività delle cellule T citotossiche utilizzando otto cellule T CD specifiche per l'antigene e cellule tumorali utilizzando un approccio basato sull'impedenza.