Name: Determinazione ottimale attività citotossica di specifiche cellule T umane Her2neu CD8 confrontando il Cr51 saggio di rilascio al Sistema xCELLigence (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-08T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Scopri come determinare l'attività citotossica delle cellule T CD8 specifiche per l'antigene Her2neu utilizzando il sistema xCELLigence a impedenza e confrontandola con il saggio di rilascio al Cr51. Questo metodo offre monitoraggio in tempo reale, maggiore sensibilità e minori requisiti cellulari rispetto ai metodi tradizionali.

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Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni a Keith L. Knutson dalla Susan G. Komen per la Fondazione Cure e NIH / NCI 9R01 CA152045 e P50-CA116201.

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</ol>

Produzione e del libero accesso di questo video-articolo è sponsorizzato da Roche Diagnostics.

Cellule T CD8 sono importanti per la risposta immunitaria adattativa, essendo in grado di uccidere direttamente le cellule infette o maligne 4. Mentre ci sono diversi modi per misurare il numero di cellule antigene-specifiche T CD8 (es. ELISPOT, tetramero, citometria a flusso), spesso è utile sapere se queste cellule sono funzionalmente citotossico 3. Il test più riconoscibile per la valutazione della funzione citotossica è il CRA, che è considerato il gold standard 4 test. Le principali limitazioni del CRA sono (1) il requisito della radioattività, (2) la mancanza di sensibilità, (3) la mancanza di informazioni relative alla meccanica, (4) necessità di grandi quantità di cellule, e (5) set up laborioso. Così, negli ultimi dieci anni, c&#39;è stato interesse ad adottare nuove strategie per ridurre al minimo queste limitazioni. Recenti approcci comprendono quelli che misura caspasi release 4, BLT esterasi activity5, e l&#39;espressione di superficie di CD107 6. Il presente manoscritto suggerisce cheil saggio impedenza-based, eseguito sul sistema xCELLigence Roche, può anche essere utile come alternativa al CRA. La capacità di adattare l&#39;approccio impedenza basato poggia sulla constatazione che le cellule T, che non aderiscono perfettamente alle superfici, non sembrano avere molto impatto sulla impedenza diminuendo così qualsiasi preoccupazione di interferenza diretta delle cellule T, con la misura. La manodopera necessaria per l&#39;utilizzo del sistema di dosaggio impedenza dovrebbe essere significativamente meno soprattutto dovuto all&#39;eliminazione delle preoccupazioni regolamentari per l&#39;uso di radioattività. L&#39;unico svantaggio notevole del sistema di impedenza-based è che un esborso di $ 50.000 a $ 60.000 è richiesto per l&#39;acquisto dell&#39;unità xCELLigence. Tuttavia, l&#39;unità xCELLigence elimina la necessità di un contatore di radiazioni ed è molto più versatile, essendo utile per valutare la risposta cellulare ai farmaci e migrazione oltre alla citotossicità delle cellule T 8. Le osservazioni chela diminuzione dell&#39;impedenza cellula tumorale è dose-dipendente, come illustrato nella figura 2, con una pendenza ripida ragionevolmente seguendo una semplice funzione quadratica secondaria suggerisce che l&#39;analisi può essere utilizzato in saggi di diluizione limitante (ADL) per stimare la frequenza di cellule citotossiche 9 . Un vantaggio con l&#39;approccio basato impedenza è che il numero di cellule T e cellule tumorali necessaria è inferiore al CRA, rendendo LDA potenzialmente più fattibile. Ad esempio, nel CRA, con un rapporto di 01:40, 1 x 10 5 cellule tumorali per pozzetto sono placcati che richiede 4 x 10 6 cellule T totale per pozzetto. Tuttavia, nel saggio impedenza-based, sono necessari solo 1,5 x 10 4 cellule tumorali per pozzetto, che consuma solo 6 x 10 5 cellule T totale per pozzetto. Così, il saggio impedenza-based utilizza cellule T 85% in meno e cellule tumorali. Questa riduzione suggerisce che il sistema basato impedenza potrebbe essere adattato al monitoraggio immunologico in studi clinici umani dove tegli volumi di prelievi di sangue può essere limitato. Inoltre, mentre il CRA è limitata a un singolo punto di tempo, il saggio impedenza basata raccoglie continue dati in tempo reale, permettendo all&#39;utente di confrontare più punti di tempo di lisi sullo stesso esperimento con il lavoro aggiuntiva minima e cellule. Calcoli di frequenza potrebbe potenzialmente essere combinati con altre strategie che non misurano la funzione, come le analisi tetramero di stabilire il rapporto tra cellule T citotossiche funzionali al totale antigene-specifiche cellule CD8 T 10. Una delle caratteristiche più interessanti di questo approccio impedenza-based è che, a differenza di molti altri saggi, citotossicità può essere monitorato in tempo reale, rendendo potenzialmente più facile studiare interazioni cellulari con l&#39;uso di inibitori o anticorpi. Un altro è che il metodo può essere adatto per le cellule tumorali che resistono etichettatura. Infine, dato che le cellule tumorali non-morti non sono etichettati e rimangono sterili, ulteriore raccolta e lo studio delle cellule cellule resistenti T è possibLe. In sintesi, mentre entrambi i sistemi forniscono dati uccisione tumorali in risposta a specifiche cellule T, il saggio impedenza-based è più sensibile del CRA e fornisce una piattaforma più flessibile.

<table><tbody><tr><td>Ficoll-Paque Plus </td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-03</td><td>Utilizzato per isolare le PBMC dal sangue </td></tr><tr><td>RPMI 1640 </td><td>Cellgro</td><td>10-040-CV</td><td>Mezzi di coltura cellulare </td></tr><tr><td>FBS </td><td>Denville Scientific</td><td>FB5001-H</td><td>Mezzi di coltura cellulare </td></tr><tr><td>IL-2 umano </td><td>eBioscience</td><td>14-8029-81</td><td>Per stimolare la crescita delle cellule T </td></tr><tr><td>Interferone gamma umano </td><td>Scienze cellulari</td><td>CR2026</td><td>Per stimolare l'espressione del MHC in cellule tumorali </td></tr><tr><td>peptide HER-2/neu p369-377 </td><td>Centro di sintesi peptidica Mayo Clinic</td><td>sequenza aminoacidica KIFGSLAFL</td><td>Si lega a HLA-A2 </td></tr><tr><td>Peptide p58-66 dell'influenza </td><td>Centro di sintesi peptidica Mayo Clinic</td><td>sequenza aminoacidica GILGFVFTL</td><td>Si lega all'HLA-A2 </td></tr><tr><td>Human CD3/CD28 Dynabeads </td><td>Invitrogen</td><td>111-61D</td><td>Per l'attivazione e l'espansione non specifica dei linfociti T </td></tr><tr><td>Cromo-51 </td><td>MP Biomedicals</td><td>62015</td><td>Reagente di marcatura CRA </td></tr><tr><td>E-plate </td><td><a href="http://www.aceabio.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Gruppo Roche</a></td><td>05469830001</td><td>Per unità di impedenza xCelligence </td></tr><tr><td>Piastra Luma 96 </td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>6005630</td><td>Per misurare la radioattività con il Top Count NXT. </td></tr><tr><td>xCelligence RTCA DP Station </td><td><a href="http://www.aceabio.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Roche Applied Science</a></td><td>RTCA DP</td><td>Unità di impedenza </td></tr><tr><td>Top Count NXT </td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>C990601</td><td>Scintillazione &amp;amp; Contatore di luminescenza </td></tr><tr><td>Fas Ligando anticorpo</td><td>BD Biosciences</td><td>556372</td><td>Per bloccare le interazioni Fas-Fas legante</td></tr><tr><td>anticorpo HLA-A2 BB7.2</td><td>BD Biosciences</td><td>551230</td><td>Per il blocco delle HLA di classe I</td></tr><tr><td>IgG2b murina, &amp;#954;</td><td>BD Biosciences</td><td>555740</td><td>Controllo di isotipo per HLA classe I</td></tr><tr><td>linea tumorale SKBR3</td><td>ATCC</td><td>HTB-30</td><td>Adenocarcinoma</td></tr><tr><td>linea tumorale MCF7</td><td>ATCC</td><td>HTB-22</td><td>Adenocarcinoma</td></tr><tr><td>linea tumorale HCC1419</td><td>ATCC</td><td>CRL-2326</td><td>Carcinoma duttale primitivo</td></tr><tr><td>linea tumorale BT20</td><td>ATCC</td><td>HTB-19</td><td>Carcinoma</td></tr></tbody></table>

determinazione ottimale attività citotossica di specifiche cellule t umane her2neu cd8 confrontando il cr51 saggio di rilascio al sistema xcelligence

Determining Optimal Cytotoxic Activity of Human Her2neu Specific CD8 T cells by Comparing the Cr51 Release Assay to the xCELLigence System

Citotossici CD8 cellule T costituiscono un sottogruppo di cellule T che sono in grado di indurre la morte delle cellule ospiti infettate o maligne 1. Queste cellule esprimono un recettore specializzato, chiamato il recettore delle cellule T (TCR), che può riconoscere uno specifico peptide antigenico legato a molecole HLA di classe 2. Impegno delle cellule infette o cellule tumorali attraverso i loro HLA di classe I risultati molecola nella produzione di molecole litici quali granzimi e perforina con conseguente morte delle cellule bersaglio. Mentre è utile per determinare la frequenza di cellule antigene-specifici T CD8 usando saggi come il ELISPOT o citometria a flusso, è anche utile per accertare la forza della risposta delle cellule T CD8 usando saggi di citotossicità 3. Il saggio più riconoscibile per la valutazione della funzione citotossica è il saggio di rilascio di cromo (CRA), che è considerato un saggio standard di 4. Il CRA ha diverse limitazioni, tra cui esposizione delle cellule a radiazioni gamma, lack di riproducibilità, e un requisito per un gran numero di cellule. Negli ultimi dieci anni, c&#39;è stato interesse ad adottare nuove strategie per superare queste limitazioni. Recenti approcci comprendono quelli che misura caspasi release 4, BLT attività esterasi 5 e l&#39;espressione di superficie di CD107 6. Il saggio impedenza-based, utilizzando il sistema xCELLigence Roche, è stata esaminata nel presente documento per il suo potenziale come alternativa al CRA. Impedenza o opposizione ad una corrente elettrica si verifica quando le cellule tumorali aderenti legano alle piastre di elettrodi. Le cellule tumorali si staccano a seguito di uccisione e impedenza elettrica è ridotto, che può essere misurata con il sistema xCELLigence. La capacità di adattare l&#39;approccio impedenza-based per valutare uccisione cellulo-mediata si basa sulla constatazione che le cellule T non aderiscono saldamente alla maggior parte delle superfici e non sembrano avere molto impatto sulla impedenza diminuendo così qualsiasi preoccupazione di interferenza diretta delle cellule T conla misurazione. Risultati mostrano che il saggio impedenza-based può rilevare cambiamenti nei livelli di cellule T antigene-specifiche citotossici CD8 con una maggiore sensibilità relativa allo standard CRA. Sulla base di questi risultati, gli approcci basati impedenza possono essere buone alternative alle agenzie di rating o altri approcci che mirano a misurare la funzionalità citotossica delle cellule T CD8.

Il saggio di rilascio di cromo, un test comune per rilevare l&#39;attività delle cellule T citotossiche, ha diversi limiti. Utilizzando cellule T CD8 antigene-specifici e la linea tumorale umano cancro al seno, SKBR3, nel presente articolo, un approccio basato impedenza è stata esaminata per la capacità di rilevare uccisione delle cellule.

Determinazione ottimale attività citotossica di specifiche cellule T umane Her2neu CD8 confrontando il Cr51 saggio di rilascio al Sistema xCELLigence

Le cellule T CD8 citotossiche costituiscono un sottogruppo di cellule T in grado di indurre la morte di cellule ospiti infette o maligne1. Queste cellule esprimono...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è determinare l'attività dei linfociti T citotossici confrontando un approccio basato sull'impedenza mediante il sistema EXOGEN con il saggio di rilascio del cromo. Il primo passaggio consiste nell'isolare le cellule mononucleate del sangue periferico dal sangue intero utilizzando fial. Successivamente, le PBMC vengono aggiunte alle pozzette insieme all'antigene peptidico, all'IL ricombinante umana due e alle PBMC irradiate per generare linfociti T CD otto specifici per l'antigene.I linfociti T CD8 specifici per l'antigene vengono quindi coltivati in co-coltura con cellule tumorali in entrambi i saggi, al fine di indurre la morte delle cellule tumorali. I risultati ottenuti mostrano la percentuale di lisi delle cellule tumorali, utilizzando sia il metodo di impedenza sia il saggio di rilascio del cromo. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come il saggio di rilascio del cromo, è che il sistema basato sull'impedenza raccoglie dati in tempo reale e richiede un numero minore di cellule, che non necessitano di alcuna etichettatura. Per questo protocollo, il sangue proveniente da donatori sani HLA-A2 positivi fornisce una fonte di PBMC, o cellule mononucleate del sangue periferico, seguendo il protocollo del produttore.Utilizzare F call PA plus per separare le P BMCs dal sangue. Successivamente, distribuire in piastre a sei pozzetti circa 4 milioni di P BMCs in due millilitri di terreno per pozzetto. Aggiungere a ciascun pozzetto il peptide legante HLAA2 a una concentrazione finale di 10 microgrammi per millilitro di coltura.Le cellule a giorni alterni per favorire la stimolazione e l'espansione dei linfociti T. Aggiungere mezzo fresco integrato con IL ricombinante umana due in concentrazione finale di 50 unità per millilitro. Dopo una settimana, preparare una coltura di PBMC autologhi, irradiare le cellule e incubarle per due ore con lo stesso HLA.Un peptide con due siti di legame a 10 microgrammi per millilitro riattiva la coltura aggiungendo un millilitro di PBM CS autologo irradiato a ciascuna. Continuare ad aggiungere mezzo fresco integrato con IL-2 ogni due giorni; dopo un’altra settimana, riattivare nuovamente le colture nello stesso modo. Dopo ulteriori sei giorni di coltura, le cellule saranno pronte per l’uso.Preparare la stazione di misurazione dell'impedenza cellulare portandola a equilibrio a 37 gradi Celsius sotto una concentrazione di anidride carbonica al 5% per almeno un'ora. Raccogliere le cellule tumorali umane al 75% di confluenza utilizzando tripsina allo 0,25% e centrifugazione. Contare le cellule tumorali mediante emocitometro e ricostituirle in RPMI.Mezzo tumorale a una concentrazione di 7.500 cellule per microlitro. Successivamente, il software dell'agente Excel ha configurato la pagina del layout con la disposizione delle pozzette. Configurare la pagina della programmazione per eseguire letture di impedenza ogni cinque minuti per un periodo di 40 ore; per le prime 18 ore, il sistema Xceligent eseguirà letture di impedenza solo sulle cellule tumorali.Quindi aggiungere 100 microlitri di mezzo tumorale RPMI per pozzetto. Effettuare una lettura di fondo sugli EPL misurando l'impedenza in assenza di cellule. Dopo aver aggiunto le cellule tumorali, caricare le piastre nella stazione EPL e iniziare a effettuare le letture.Le cellule tumorali inizieranno immediatamente ad aderire agli EPL. Dopo circa 18 ore di incubazione, le cellule tumorali si saranno attaccate agli EPL e avranno raddoppiato, raggiungendo 15.000 cellule tumorali per pozzetto. A questo punto, raccogliere le cellule T preparate mediante raschiamento delicato e centrifugazione con agitazione.I linfociti T, ricostituirli in mezzo RPMI con il 10% di FBS e contarli utilizzando un emocitometro. Una volta nota la densità cellulare, preparare una serie di diluizioni a due raddoppi dei linfociti T in modo che, quando 200 microlitri di linfociti T vengono aggiunti alle cellule tumorali, la concentrazione più alta sia di 40 linfociti T per cellula tumorale. L'ultima diluizione della serie deve fornire 1,25 linfociti T per cellula tumorale.Mettere in pausa la stazione EXOGEN e rimuovere l'EPL utilizzando una pipetta. Rimuovere il mezzo dai pozzetti, quindi aggiungere 200 microlitri di cellule T utilizzando tutte le concentrazioni della serie di diluizioni come controllo negativo. Utilizzare mezzo puro, reinserire l'EPL nella stazione e proseguire il programma al termine del saggio.Normalizzare i risultati. Seguire sempre le procedure di sicurezza istituzionali relative alle radiazioni quando si lavora con cromo 51 e cellule bersaglio marcate con cromo 51, e utilizzare schermature per ridurre l'esposizione alle radiazioni. Iniziare pulsando le cellule tumorali per due ore a un milione di cellule per millilitro con 10 microlitri per millilitro di cromo 51 fresco.Successivamente, lavare le cellule tumorali in 10 millilitri di terreno RPMI con FBS al 10%, centrifugare le cellule e risospendere nello stesso terreno a una concentrazione di 1 milione di cellule per millilitro. Quindi, in una piastra da 96 pozzetti con fondo rotondo, aggiungere 100.000 cellule tumorali per pozzetto per calcolare il rilascio spontaneo.Non aggiungere nulla a sei di queste pozzette, rispetto ad altre sei pozzette. Aggiungere 100 microlitri di Triton X-100 per lisare le cellule e quindi calcolare il rilascio massimo in tutte le pozzette rimanenti. Aggiungere le cellule T alla piastra utilizzando la serie di diluizioni preparata in precedenza.Ora incubare le piastre per cinque ore e raccogliere campioni di 50 microlitri di sopernatante da ciascuna pozzetta. Caricare i campioni su una piastra luma dopo aver essiccato le piastre nell'incubatrice per tutta la notte a temperatura ambiente. Misurare i CPM mediante un contatore a gamma T-cell e SKBR tre. Le cellule tumorali sono state coltivate su piastre X intelligence e è stato misurato l'indice cellulare, che rappresenta una riflessione dell'impedenza della piastra poiché le cellule T non richiedono l'adesione per proliferare.Il loro effetto sull'impedenza è stato trascurabile durante una coltura di 40 ore. Le cellule tumorali coltivate da sole hanno mostrato un aumento della misurazione dell'impedenza. Tuttavia, l'aggiunta di cellule T a 18 ore interrompe questa tendenza.Questo evento richiede una normalizzazione software dopo l'aggiunta delle cellule T ed è ulteriormente analizzato nel successivo esperimento. Quando le cellule SK BR 3 sono state coltivate in co-cultura con diverse concentrazioni di cellule T, le riduzioni dell'impedenza sono risultate chiaramente dipendenti dalla dose di cellule T; i dati sono stati raccolti ogni cinque minuti in tre ripetizioni al momento delle 10 ore. Gli indici cellulari hanno seguito un polinomio del secondo ordine nell'intervallo di concentrazioni di cellule T, indicando che la stazione Exogen monitora in tempo reale la morte mediata dalle cellule T CD8+ nei tumori SK B 3 attraverso una diminuzione dell'indice cellulare, al fine di determinare se le riduzioni dell'impedenza delle cellule SK BR 3 indotte dalle cellule T fossero specifiche per l'antigene.Le cellule SK KBR tre sono state coltivate in co-coltura con linfociti T specifici per l'antigene influenzale di tipo FLU, positivi per HLA A due, che non riconoscono HER due new. Queste cellule hanno mostrato un'attività lítica significativamente inferiore; per determinare ulteriormente se i linfociti T specifici per HER due new uccidessero in maniera specifica per l'antigene, è stato aggiunto un anticorpo contro il ligando Fas nelle co-colture. L'anticorpo non ha ridotto l'attività lítica dei linfociti T specifici per HER due new P 360 9.Tuttavia, con linfociti T attivati in modo non specifico mediante microsferette anti-CD3 e CD28, l'anticorpo ha inibito la lisi, consentendo di determinare se l'uccisione avvenisse in maniera dipendente dalla classe I dell'HLA. Sono stati aggiunti ai co-colture o un anticorpo anti-classe I dell'HLA o un anticorpo di controllo isotipico. I risultati hanno fortemente sostenuto questa ipotesi.I linfociti T sono stati successivamente coltivati in co-coltura con altre cellule tumorali in un rapporto di uno a cinque. La linea cellulare tumorale negativa per HLA A due, BT 20, è stata utilizzata come controllo negativo. I risultati mostrano che il metodo è utile per molteplici cellule tumorali aderenti bersaglio.I co-colture delle nuove cellule T specifiche per HER2 P360-9 sono state aggiunte a cellule bersaglio marcate con cromo-51, seguite dall'analisi CRA. Il saggio di intelligence risulta più sensibile per analizzare la coerenza. La variazione intra-saggio è stata calcolata come coefficiente percentuale di variazione ad ogni rapporto cellulare compreso tra 1:40 e 1:5.Questo valore è risultato inferiore al 15% nei rapporti cellulari più bassi. Tuttavia, la percentuale di CV era elevata o imprevedibile. Inoltre, è stata esaminata la variabilità della lisi delle cellule T SK BR tre indotta dalla co-coltura con diverse linee cellulari T specifiche per P 360 9.I dati sono stati generati a distanza di 30 giorni. I saggi sono stati eseguiti in triplice replicato e i risultati sono risultati molto simili. Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come determinare l'attività dei linfociti T citotossici utilizzando linfociti T CD8 specifici per l'antigene e cellule tumorali, mediante un approccio basato sull'impedenza.

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Immunologia e Infezioni

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Questo protocollo fornisce un flusso di lavoro in vitro standardizzato per la misurazione coerente della citotossicità naturale, mediata dai recettori degli antigeni chimerici e dipendente dagli anticorpi delle cellule naturali umane, utilizzando imaging a cellule vive e citometria di flusso.

Quantificazione della citotossicità delle cellule NK potenziata dai recettori antigenici chimerici e dagli anticorpi terapeutici tramite imaging a cellule vive e citometria a flusso

Scopri come determinare l'attività citotossica delle cellule T CD8 specifiche per l'antigene Her2neu utilizzando il sistema xCELLigence a impedenza e confrontandola con il saggio di rilascio al Cr51. Questo metodo offre monitoraggio in tempo reale, maggiore sensibilità e minori requisiti cellulari rispetto ai metodi tradizionali.

Determinazione ottimale attività citotossica di specifiche cellule T umane Her2neu CD8 confrontando il Cr51 saggio di rilascio al Sistema xCELLigence (Video) | JoVE Journal

Determinazione ottimale attività citotossica di specifiche cellule T umane Her2neu CD8 confrontando il Cr51 saggio di rilascio al Sistema xCELLigence

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