Rilevamento di Traslocazione tossina nel citosol Host Surface Plasmon Resonance

L'obiettivo generale di questa procedura è rilevare e quantificare il pool di tossina che entra nel citosol. A tal fine, la tossina viene innanzitutto legata alla superficie della cellula ospite a quattro gradi Celsius. La tossina non legata viene quindi rimossa e le cellule vengono riscaldate a 37 gradi Celsius, condizione che permette il movimento della tossina all'interno del sistema endomembranario e successivamente nel citosol dell'ospite; viene quindi utilizzata la dig tonina per permeabilizzare in modo selettivo la membrana plasmatica dopo la permeazione cellulare.

Gli estratti cellulari vengono separati in frazioni distinte di membrana e citosoliche mediante centrifugazione differenziale come passaggio finale. La risonanza di superficie plasmatica, abbreviata SBR, viene utilizzata per rilevare e quantificare l'ingresso della tossina nel citosol attraverso la perfusione della frazione citosolica su un sensore SPR rivestito con un anticorpo antitossina. Questo metodo contribuirà a rispondere a domande fondamentali nel campo della biologia delle tossine, come l'efficienza e la cinetica dell'ingresso della tossina nel citosol, la quantità di tossina che entra nel citosol e l'eventuale inibizione farmacologica del trasporto della tossina verso il citosol. Prima di iniziare questo protocollo, preparare le cellule heli per l'intossicazione cellulare come descritto nel protocollo scritto, dopo un'incubazione notturna delle cellule HeLa.

Sostituire il mezzo di coltura con un millilitro di DMEM contenente 100 nanogrammi per millilitro di ganglioside GM1 e incubare per un'ora a 37 gradi Celsius. Questo aumenta il numero di siti di legame per la tossina colerica. Poiché il ganglioside GM1 agisce come recettore della tossina, si inserirà nella membrana plasmatica delle cellule esposte a una soluzione di GM1.

Dopo un'incubazione di un'ora, rimuovere il mezzo GM e lavare le cellule due volte con DMEM. Quindi aggiungere un millilitro di DMEM contenente un microgrammo per millilitro di tossina colerica e incubare le cellule a quattro gradi Celsius per 30 minuti. Rimuovere il mezzo contenente la tossina e lavare le cellule due volte.

Quindi incubare le cellule in un millilitro di DMEM a 37 gradi Celsius per il tempo desiderato. Al termine di ogni periodo di chase, lavare le cellule con PBS e successivamente incubare ogni pozzetto con 250 microlitri di EDTA 0,5 millimolare in PBS. Dopo un'incubazione di 10 minuti sul ghiaccio, rimuovere le cellule dalla piastra a sei pozzetti mediante ripetuti passaggi con una pipetta P1000.

Dopo aver raccolto le cellule da una pozzetta, combinarle con la seconda e poi con la terza pozzetta della stessa condizione. Successivamente, trasferire la sospensione cellulare combinata dalle tre pozzette replicate in un'unica provetta per microcentrifuga. Centrifugare ora la provetta in una microcentrifuga da banco per cinque minuti.

A 5.000 ×g, si dovrebbero ottenere pellet cellulari di dimensioni approssimativamente equivalenti per tutte le condizioni. Eliminare il soprannatante, quindi risospendere il pellet cellulare in 100 microlitri di una soluzione lavorativa dello 0,04% di digitonina, preparata in precedenza e raffreddata. Collocare la sospensione cellulare sul ghiaccio per 10 minuti; quindi, utilizzando una microcentrifuga da banco, centrifugare la digitonina e le cellule permeabilizzate a 16.000 ×g per 10 minuti.

Trasferire il citosol contenente la frazione soprannatante in una nuova provetta da microcentrifuga e conservare la frazione pellettata contenente gli organelli. Gli standard della tossina SPR vengono preparati alle concentrazioni di centodieci, uno e 0,1 nanogrammi per millilitro in tampone HCN. I campioni vengono preparati diluendo le frazioni soprannatanti contenenti citosol in tampone HCN fino a un volume finale di un millilitro. Sono necessari volumi campione di almeno un millilitro per garantire che l'aria venga espulsa dal loop campione da 500 microlitri prima dell'iniezione. Le frazioni pellettate contenenti organelli vengono risospese in un millilitro di tampone HCN contenente il 1% di Triton X-100.

L'aggiunta di detergente è necessaria per rilasciare il pool di tossina racchiusa nella membrana. Inoltre, preparare set paralleli di frazioni citosoliche e organellari L come controllo sperimentale per confermare la fedeltà della procedura di frazionamento; risospendere la frazione citosolica in 20 microlitri di buffer campione 4x e la frazione organellare L in 120 microlitri di buffer campione 1x. Risolvere volumi equivalenti di ciascuna frazione mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide in presenza di dodecilsolfato di sodio (SDS-PAGE) e analizzare tramite immunotrasferimento (Western blot) per dimostrare la distribuzione di una proteina citosolica nella frazione soprannatante e di una proteina solubile del reticolo endoplasmico nella frazione pellet. Per preparare la lamella SPR, posizionare innanzitutto una lamella di vetro placcata d'oro con uno strato autoassemblato nell'apparato SPR.

Attivare la lamellina sensore perfundendo una soluzione E-D-C-N-H-S sulla lamellina per 10 minuti a un flusso di 41 microlitri al minuto. Per tutte le successive perfusioni, utilizzare lo stesso flusso. Rimuovere il tampone di attivazione E-D-C-N-H-S lavando la piastra per cinque minuti con PBS contenente 0,05%2020.

La piastra contiene ora legami reattivi di MI a causa della rimozione del gruppo protettivo da parte della soluzione E-D-C-N-H-S. Successivamente, perfondere un anticorpo anti-CTA sulla lamina sensore attivata in una diluizione di uno a 20.000 in acetato di sodio 20 millimolare per 15 minuti. Si osserverà un calo iniziale dell'unità di indice di rifrazione, abbreviata RIU, dovuto al cambiamento di pH.

Questo sarà seguito da un aumento dell'RIU poiché l'anticorpo viene catturato dai legami reattivi amidici. Sul vetrino del sensore, rimuovere l'anticorpo non legato mediante un lavaggio con PBST di cinque minuti. Il segnale RIU prodotto dall'anticorpo catturato raggiungerà una fase di plateau e si stabilizzerà, fornendo un nuovo segnale di baseline.

Come passaggio finale nella preparazione della lamella, perfondere etanolammina uno molare sulla lamella sensibile per cinque minuti. Questo passaggio blocca e inattiva eventuali legami liberi rimasti sulla lamella sensibile. Il segnale RIU aumenterà per stabilire una lettura di base; perfondere PBST sulla lamella sensibile rivestita con anticorpo per cinque minuti.

Quindi, perfondere un campione sperimentale o uno standard di tossina sul sensore per 300 secondi. Rimuovere il ligando dal buffer e perfondere PBST sul sensore per altri 200 secondi. Qualsiasi tossina rimasta legata al sensore viene rimossa mediante un centoduesimo lavaggio con PBST a pH 5,0.

Questo riporterà il segnale al valore iniziale della linea di base, consentendo così l'elaborazione di un altro campione sullo stesso sensore. Prima di caricare un nuovo campione, spingere una piccola quantità di aria attraverso il loop del campione per espellere eventuali residui di fluido del campione precedente. Dopo l'acquisizione.

I dati possono essere analizzati con il software Scrubber due e il software Igor può essere utilizzato per la preparazione delle figure. La tossina della pertosse è una tossina di tipo AB che si sposta dalla superficie cellulare al reticolo endoplasmatico prima che la sua catena a. PTs uno entri nel citosol.

Il saggio di traslocazione basato sulla SPR potrebbe rilevare le PTs nel citosol delle cellule CHO intossicate. Nessun segnale è stato generato dal citosol delle cellule non intossicate, confermando l'assenza di reazione incrociata dell'anticorpo anti-PTs con un componente del citosol dell'ospite.

La frazione citosolica di cellule intossicate in presenza di felden. A non ha prodotto neppure un segnale positivo, poiché la BFA impedisce il trasporto della tossina al sito di translocazione nel reticolo endoplasmatico e, di conseguenza, il rilascio della catena H nel citosol. La colera tossina è un'altra tossina di tipo AB che si transloca nel reticolo endoplasmatico.

CTA uno è stato rilevato nella frazione citosolica di cellule helo trattate con CT. Ciò ha sottolineato che la metodologia funziona con diversi tipi cellulari ed è applicabile a qualsiasi tossina per la quale sia disponibile un anticorpo specifico per la catena A. Nessun segnale è stato rilevato quando la frazione citosolica di cellule trattate con CT è stata fatta passare su un sensore SPR rivestito con un anticorpo anti-CTB, dimostrando così che, a differenza della sottounità CTA1, il pentamero CTB responsabile del legame cellulare non entra nel citosol.

Dopo la profusione su un sensore SPR rivestito con un anticorpo anti-CTA. Il segnale della frazione organellare è fuori scala rispetto al segnale più debole della frazione citosolica. Questo è coerente con l'inefficienza nota del trasporto della CT verso il sito di translocazione nel RE, il che a sua volta limita la quantità di tossina che può raggiungere il citosol.

È inoltre possibile monitorare l'accumulo dipendente dal tempo della tossina citosolica traslocata. Dopo l'esposizione delle cellule alla CT a quattro gradi Celsius, nessuna tossina è stata rilevata nel citosol 15 minuti dopo il riscaldamento a 37 gradi Celsius.

Un piccolo accumulo di tossina citosolica è stato rilevato dopo 30 minuti a 37 gradi Celsius e quantità progressivamente maggiori di tossina citosolica sono state rilevate dopo i periodi di chase di 45 e 60 minuti. Questo dimostra un rilascio continuo a lungo termine della tossina associata alla cellula nel citosol ospite. Il saggio può inoltre rilevare l'inibizione della traslocazione della tossina nel citosol: cellule trattate con DMSO al 10% hanno mostrato livelli bassi di tossina CT1 di tipo citosolico rispetto alle cellule di controllo intossicate non trattate, a causa dello svolgimento della tossina.

Una catena è un prerequisito per la traslocazione nel citosol, quindi la stabilizzazione indotta da DMSO della CT A1 ha di conseguenza impedito il suo spostamento dal reticolo endoplasmatico al citosol. Per quantificare il blocco della traslocazione della tossina indotto da DMSO, è stata utilizzata una curva standard generata a partire da concentrazioni note di tossina per calcolare una concentrazione citosolica di cta1 pari a 0,3 nanogrammi per millilitro nelle cellule non trattate e a 0,1 nanogrammi per millilitro nelle cellule trattate con DMSO. L'inibizione dello svolgimento della CT A1 da parte del DMSO ha pertanto determinato una riduzione di tre volte nella traslocazione dal reticolo endoplasmatico al citosol della CT A1.

Seguendo questa procedura, saremo in grado di utilizzare altre tecniche, come i saggi di intossicazione, per stabilire un collegamento diretto tra la quantità di tossina presente nel citosol e l'attività della tossina.