Name: Nelle misure in vitro di costrizione tracheale con Mice (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-25T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 20 s
Description: Impara a misurare la contrattilità del muscolo liscio tracheale nei topi con tensiometria in vitro di anelli tracheali isolati. Questo metodo diretto consente di studiare i meccanismi fisiologici e farmacologici della costrizione delle vie aeree.

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Questo lavoro è stato finanziato da una sovvenzione da parte del Centro per l&#39;Innovazione nella prevenzione e nel trattamento delle malattie delle vie aeree, NINDS sovvenzione (NS052574), e dal Programma per la Ricerca Sandler asma.

1. Attrezzatura I componenti principali di un dispositivo di misurazione contrazione sono mostrate schematicamente in figura 2A). <ol><li> Un bagno tessuto. Il bagno tessuto mantiene una soluzione ossigenata fisiologica a temperatura calda. Per topi anelli trachea, si usa un bagno tessuto 10 ml contenente una camicia d&#39;acqua per la circolazione di una soluzione di riscaldamento, un ingresso di vetro sinterizzato a bolle di ossigeno (95% / 5% O 2 / CO 2 miscela) e di ingresso e di uscita per cambiare soluzioni. Una soluzione PSS serbatoio viene memorizzato a ebollizione costante del 95% / 5% O 2 / CO 2 in miscela a 37 ° C in bagno di acqua (non mostrato). Per gli scambi, soluzione PSS viene pompata dal serbatoio verso l&#39;ingresso bagno tessuto (porta inferiore) a circa 100 ml al minuto per consentire lo scambio di soluzione relativamente veloce. La soluzione è presa attraverso una porta troppopieno (apertura superiore) che permette volume costante (~ 10 ml) nel tessuto del bloccoh durante la soluzione di scambio. Usiamo un circolatore Haake riscaldamento per pompare acqua calda attraverso la camicia bagno di tessuto (per mantenere 37 ° C). Bagni dei tessuti può essere ottenuto da una serie di fornitori e sono disponibili in una varietà di formati e stili per soddisfare le esigenze sperimentali del ricercatore. </li><li> Un trasduttore di forza. Per misurare la tensione isometrica, il tubo trachea viene infilato su L-forma estremità di due barre di acciaio inossidabile (Figura 2A). Si deve prestare attenzione ad utilizzare un tipo di acciaio inossidabile che è compatibile con materiale biologico. L&#39;asta superiore è collegato tramite una clip a un trasduttore di forza isometrica. L&#39;asta inferiore contiene la trachea in una posizione fissa, ed è montato su un micrometro per la regolazione della tensione passiva e / o lunghezza del muscolo. Contrazione della trachea crea tensione sul trasduttore di forza, che viene convertito in un segnale di tensione al preamplificatore. L&#39;asta inferiore può anche essere configurato per includere due piastre rettangolari platino (4 mm di distanza) t<html> cappello fianco della trachea (Figura 2B). Le piastre platino sono collegati ad uno stimolatore Grass S88 che consente l&#39;erogazione di un campo elettrico attraverso la trachea. Fili aperti e saldatura sono rivestiti con Sylgard (Sylgard 184 elastomero di silicone, Dow Corning Corp, Midland, MI), per evitare la lisciviazione dei metalli nella soluzione del bagno. </li><li> A / D converter software, computer e acquisizione. Segnali provenienti dai preamplificatori sono registrati su un MacLab 8 A / D del sistema. Questa è una versione precedente di hardware corrente ADInstrument PowerLab. Usiamo il programma grafico (ADInstruments) che consente la registrazione continua della tensione in tutto l&#39;esperimento. Generazione di tensione del muscolo trachea è piuttosto lento, e quindi troviamo che l&#39;acquisizione di 100 punti al secondo è sufficiente. La misura della tensione viene calibrato utilizzando pesi noti (fino a 5 grammi) prima di ogni esperimento. Sistemi simili sono disponibili presso i venditori di altri (ad esempio, BIOPAC, Instruments GW). </li></ol>titolo &quot;&gt; 2. Trachea isolamento <ol><li> Prima di isolamento tessuto il trasduttore di forza viene calibrato con pesi noti, e il bagno tessuto viene riempito con PSS normali (vedi Tabella I). L&#39;entrata dell&#39;aria è regolata per ottenere un flusso di luce di O 2 / CO 2. </li><li> Trachee da due mesi o topi più anziani sono ottimali. I piccoli animali possono essere usati ma trachee ottenuti da questi richiedono una maggiore abilità da montare sui cavi dei trasduttori di forza a causa delle loro piccole dimensioni. Prima di dissezione, i topi sono profondamente sedato con isoflurano. Il livello adeguato di sedazione viene raggiunto quando un dito-pinch con pinza è in grado di suscitare una risposta. I topi sono immediatamente sacrificati mediante dislocazione cervicale Una nota importante:. Abbiamo osservato che Avertin (Tribromoethanol), un sedativo comunemente usato nei topi, ha forti effetti rilassanti sulla muscolatura liscia delle vie aeree e, pertanto, non deve essere utilizzato per gli studi di contrazione trachea. </li><li> La pelle (e in pelliccia) viene rimosso dal torace alla gola. Ribs sono tagliati dalla base dello sterno, lateralmente (su entrambi i lati) all&#39;inizio del cuore. Lo sterno e le costole sono poi tirato in avanti alla gola per rivelare il cuore / polmoni, timo, trachea (ventrale) ed esofago (allegata al - e dorsale a trachea). </li><li> La trachea viene asportata tagliando la biforcazione bronchiale sotto e sopra la faringe. La trachea viene inserito in un gelido ossigenato (95/5) soluzione di PSS (composizione indicata nella tabella I). </li><li> La trachea è sezionato pulizia dei tessuti circostanti. Durante la pulizia, la trachea può essere tenuto alla faringe o al di sotto della biforcazione. Tuttavia, si deve fare attenzione a non applicare direttamente le pinze alla stessa trachea. Forbici Belle può essere usato per tagliare tessuti circostanti, ma il taglio deve essere effettuato sempre parallelo alla trachea per evitare danni. Questa parte della procedura è facilitata se la preparazione trachea è bloccato sotto la biforcazione e sopra la faringe su un Sylgard rivestita piatto (Sylgard 184 SiliconeElastomero, Dow Corning Corp, Midland, MI). </li><li> Dopo aver rimosso il tessuto circostante, la trachea è tagliato sotto la faringe e sopra la biforcazione bronchiale e delicatamente montato su fili trasduttori di forza. </li><li> La trachea viene infilato su due a forma di L uncini metallici (Figura 2A). Un rebbio è collegato ad un trasduttore forza-spostamento per la registrazione continua della tensione isometrica. Un altro polo è collegato ad un micrometro. Il bagno tessuto viene quindi sollevato in modo che la trachea è immerso in PSS. Montaggio della trachea dovrebbe essere fatto più rapidamente possibile per ridurre il tempo trachea si tengono fuori di PSS. Con la pratica, il montaggio della trachea può essere fatto in un minuto ma in genere evitare di volte di più di 3 minuti per evitare la perdita di vitalità. </li><li> Il micrometro viene regolato lentamente per ottenere una tensione passiva di ~ 10 mN (~ 1 grammo-forza). La tensione ottimale di riposo è stata determinata empiricamente e abbiamo trovato che la tensione passiva di circa 5-10 risultati mN in un equivalente, massima risposta ad alta stimolazione di potassio. Questo è coerente con un numero di altri studi che utilizzano una tensione passiva in questo intervallo 16,17,18. Nei primi 5-10 minuti, trachea tensione passiva tende a scendere leggermente (stress-rilassamento fenomeno) e il micrometro viene utilizzato per regolare la tensione passiva a ~ 10 mN durante equilibrazione. La trachea è lasciato equilibrare per almeno 1 ora prima sfide sperimentali. </li></ol> 3. Alta stimolazione di potassio Equilibrazione seguito, la trachea è sfidato due volte con una soluzione di alta PSS di potassio (67 mM KCl, Tabella I). La contrazione generalmente richiede 5-10 minuti per raggiungere ~ steady-state in quel momento il bagno tessuto è risciacquato più volte con PSS normali per rilassarsi completamente la trachea. La contrazione potassio viene ripetuto una seconda volta, e una terza volta (se necessario) fino contrazioni riproducibili. <pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 4. Contrazione evocati dalla stimolazione elettrica La trachea è fiancheggiato da due piastre rettangolari platino (elettrodi) che permettono la stimolazione di campo elettrico (EFS) alla preparazione. La risposta contrattile alla EFS è una funzione della frequenza e tensione. Esso è inoltre influenzata da parametri fisici quali la superficie degli elettrodi e la distanza tra loro. Le caratteristiche di potenza del stimolatore anche influenzare la risposta tali che a tensioni superiori e uscite di corrente lo stimolatore può raggiungere il suo massimo. Le caratteristiche di ogni sistema EFS dovrebbe essere determinata esaminando le risposte muscolari contrattili a diverse durate di stimolo, frequenze, tensioni e durate di impulso. Per il nostro setup sperimentale, abbiamo scoperto che gli elettrodi separati da ~ 4 mm, ampiezza e la stimolazione di 44 V (0,5 ms impulsi) e di 30 Hz è ottimale per raggiungere riproducibili risposte contrattili quasi massimi. 5. Contrazione Evoked dalla stimolazione colinergica La reattività della trachea di esogena composti applicati è valutata mediante aggiunta di una singola dose del farmaco di interesse o, con aggiunte multiple del farmaco in modo dose cumulativa. Per la trachea, il nostro laboratorio solitamente usata carbacolo per attivare i recettori colinergici, perché, a differenza di acetilcolina, carbacolo non è degradato dalla acetilcolinesterasi. Una ragionevole dose-risposta è compreso tra 10 -8 a 10 -5 M carbacolo. Montaggio del registro [carbacolo] contrattile curva di risposta con uno di tipo Hill-equazione consente una stima della CE 50 (mezza raggiungere la massima concentrazione efficace) che è una misura della sensibilità di contrazione tracheale per l&#39;agonista colinergico 19. Vale la pena notare che una data dose di carbacolo darà una risposta leggermente maggiore in dose singola che come parte di una curva di risposta alla dose cumulativa. 6. Risultati rappresentativi </p&gt; Un esempio di una risposta contrattile di potassio è mostrata in Figura 3A. La contrazione raggiunge un massimo in circa 10 minuti, ma può mostrare un lieve calo negli anni successivi. Durante il lavaggio iniziale di potassio, il muscolo può mostrare un aumento transitorio di contrazione che è causa di una caduta nella temperatura del piccolo volume di soluzione PSS riscaldato nelle linee soluzione perfusione transitoriamente la preparazione. Questo può essere minimizzata con un volume morto minimo nella tubazione che collega il serbatoio riscaldata PSS bagno e tessuti, e anche attraverso lo scambio di soluzione relativamente velocemente (generalmente si pompa soluzioni a 100 ml / min). Ogni preparazione avrà alcune differenze nella risposta contrattile a causa delle differenze di massa muscolare o danni verificatisi durante la dissezione. 3B figura mostra due trachee di massa muscolare diversa sfidati con potassio e carbacolo. Anche se le contrazioni colinergici-evocati differiscono, ily sono simili dopo la normalizzazione della risposta con soluzione di potassio (Figura 3C). La figura 4 mostra un esempio di (colinergico) contrazione carbacolo evocata utilizzando dosi singole (A) e un aumento cumulativo (B). Le soluzioni carbacolo vengono aggiunti direttamente alla vasca e il gas gorgogliati aiuta in miscelazione rapida. Vale la pena notare che l&#39;aggiunta di una singola dose (cioè 1 pM, Figura 4A) ha una risposta leggermente maggiore della concentrazione equivalente durante un cumulativa curva dose-risposta (1 pM, Figura 4B). Figura 4C mostra un grafico della forza di contrazione in funzione delle concentrazioni carbacolo utilizzando i dati di Figura 4B. Effetti di carbacolo saturano ad concentrazione 10 -5 M. Anche se agonisti colinergici avvia contrazione attraverso meccanismi di rilascio di calcio, una componente sostanziale della contrazione è mediata da depolarizzazione eattivazione di canali voltaggio-dipendenti calcio 20. Figura 5A mostra un esempio di EFS evocati contrazioni. Trachee sono stimolati con durata di 0,5 millisecondi, 40 impulsi volt fino contrazioni raggiungere un plateau (vedi riquadro a1). Un aumento della frequenza di stimolazione determina un aumento della risposta contrattile (frequenza curva di risposta è riportata in Figura 5B). Stimolazione del campo elettrico è stato dimostrato per evocare contrazioni prevalentemente attivando nervi presinaptici. Ciò è dimostrato dal l&#39;effetto della tossina botulinica, un bloccante del rilascio di neurotrasmettitore che blocca la maggior parte delle contrazioni EFS-evocati trachea 21. Inoltre, tetrodotossina, un agente che blocca i canali del Na + inibisce anche l&#39;attività nervosa ed elimina la risposta della trachea per EFS. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3703/3703fig1.jpg" /> Figura 1. Schema di tha grandi vie di segnalazione in una preparazione trachea isolata. Mostrato è un terminale assone colinergico innerva una cellula del muscolo liscio tracheale. Le vie di segnalazione principali sono M3-M2-muscarinici e l&#39;attivazione del recettore dell&#39;acetilcolina (mAChR) che causano il rilascio del calcio attraverso i recettori IP3 (M3) e la riduzione del cAMP (M2). Recettori M2 (e alcuni contributo dei recettori M3) anche causare depolarizzazione colinergica evocata che attiva L canali di tipo dipendente dalla tensione di calcio e influsso di calcio. Comuni agenti contrattili e dei loro effettori sono: 1. di potassio (depolarizzare cellule muscolari lisce e assoni colinergici), 2. campo di stimolazione elettrica (EFS, depolarizza colinergico assone) e 3. l&#39;applicazione esogena di agenti colinergici quali acetilcolina o carbacolo (attiva i recettori muscarinici direttamente). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3703/3703fig2.jpg" /> Figura 2. Schema di materiale utilizzato per misurare le contrazioni tracheali. A. Il trasduttore di forza, micrometro e bagno tessuti sono montati su asta di supporto tramite morsetti a vite. L&#39;anello tracheale è filettato sulle aste superiore e inferiore. Nel diagramma, il bagno di tessuto è posizionata sotto la preparazione (ad esempio durante il montaggio della trachea sul trasduttore di forza). Durante gli studi di contrazione, il bagno tessuto viene spostata verticalmente a fare il bagno la preparazione. B. Per la stimolazione del campo elettrico l&#39;asta inferiore viene modificato per includere due piastre platino che sono montati lateralmente al filo azienda trachea. Le piastre platino sono collegati da fili elettrici ad uno stimolatore. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3703/3703fig3.jpg" /> Figura 3. Esempi di potassio (67 mM) di risposta contrattile della trachea. (A) mostra duplicati, risposte riproducibili al potassio alto. (B) Esempi di risposta contrattile alla carbacolo di due differenti trachee. (C) Le risposte alle trachee in B sono simili quando normalizzared per la risposta ad alta potassio. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3703/3703fig4.jpg" /> Figura 4. Esempi di carbacolo contrazioni indotte. (A) carbacolo contrazioni indotte sono state somministrate dosi singole seguita da washout. (B) Esempio cumulativa curva dose-risposta per la trachea in A. (C) contrazioni picco da B vengono tracciati come funzione della concentrazione carbacolo. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3703/3703fig5.jpg" /> Figura 5. Esempi di contrazioni evocati dalla stimolazione del campo elettrico. (A) stimolazione del campo elettrico della contrazione trachea utilizzando impulsi 0,5 ms, 40 volt, e frequenze di stimolazione diversi come indicato. Inset è tempo espanso contrazione a 30 Hz. (B) contrazioni di picco di A sono plotted in funzione della frequenza di stimolazione. PSS normali <table border="1"><tbody><tr><td> Sale </td><td> Conc. (MM) </td><td> Importo (g / 2 L) </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 119 </td><td> 13,91 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 4,7 </td><td> 0,7 </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> 1,18 </td><td> 0,32 </td></tr><tr><td> MgSO 4 x 7H 2 O </td><td> 1,17 </td><td> 0,58 </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> 18 </td><td> 3,02 </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> 0,026 </td><td> 0,1 ml di 0,5 M </td></tr><tr><td> Glucosio </td><td> 11 </td><td> 3,96 </td></tr><tr><td> Saccarosio </td><td> 12,5 </td><td> 8,56 </td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> 2 </td><td> 400 ml di 10 mM </td></tr></tbody></table> Alta K + PSS (NACL e rettifiche KCl) <table border="1"><tbody><tr><td> Sale </td><td> Conc. (MM) </td><td> Importo (g / 2 L) </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 56,7 </td><td> 6,628 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 67 </td><td> 9,991 </td></tr></tbody></table> . Tabella 1 Ricetta per soluzioni PSS. Nota: Le soluzioni sono fatta fresca ogni settimana, con acqua ultrapura di qualità, e sono conservate in frigorifero per non più di 5 giorni per evitare di contaminare la crescita.

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<li>Krane, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aquaporin+5-deficient+mouse+lungs+are+hyperresponsive+to+cholinergic+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Aquaporin 5-deficient mouse lungs are hyperresponsive to cholinergic stimulation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 14114-14119 (2001).</li>
<li>Semenov, I., Wang, B., Herlihy, J. T., Brenner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BK+channel+beta1-subunit+regulation+of+calcium+handling+and+constriction+in+tracheal+smooth+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Lung.+Cell+Mol.+Physiol%22%5BJournal%5D)">BK channel beta1-subunit regulation of calcium handling and constriction in tracheal smooth muscle.</a> Am. J. Physiol. Lung. Cell Mol. Physiol. 291, L802-L810 (2006).</li>
<li>Fortner, C. N., Breyer, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EP2+receptors+mediate+airway+relaxation+to+substance+P+ATP%2C+and+PGE2%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Lung+Cell+Mol.+Physiol%22%5BJournal%5D)">EP2 receptors mediate airway relaxation to substance P ATP, and PGE2.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 281, 469-474 (2001).</li>
<li>Hay, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+modulation+of+endothelin+ligand-induced+contraction+in+isolated+tracheae+from+endothelin+B+%28ET%28B%29%29+receptor+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Differential modulation of endothelin ligand-induced contraction in isolated tracheae from endothelin B (ET(B)) receptor knockout mice.</a> Br. J. Pharmacol. 132, 1905-1915 (2001).</li>
<li>Stengel, P. W., Yamada, M., Wess, J., Cohen, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M%283%29-receptor+knockout+mice%3A+muscarinic+receptor+function+in+atria%2C+stomach+fundus%2C+urinary+bladder%2C+and+trachea%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Regul.+Integr.+Comp+Physiol%22%5BJournal%5D)">M(3)-receptor knockout mice: muscarinic receptor function in atria, stomach fundus, urinary bladder, and trachea.</a> Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp Physiol. 282, R1443-R1449 (2002).</li>
<li>Trevisani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+in+vitro+expression+of+B1+receptor+in+the+mouse+trachea+and+urinary+bladder%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Evidence for in vitro expression of B1 receptor in the mouse trachea and urinary bladder.</a> Br. J. Pharmacol. 126, 1293-1300 (1038).</li>
<li>Mehats, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDE4D+plays+a+critical+role+in+the+control+of+airway+smooth+muscle+contraction%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">PDE4D plays a critical role in the control of airway smooth muscle contraction.</a> FASEB J. 17, 1831-1841 (2003).</li>
<li>Kumar, R. K., Herbert, C., Foster, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%22classical%22+ovalbumin+challenge+model+of+asthma+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Drug+Targets%22%5BJournal%5D)">The "classical" ovalbumin challenge model of asthma in mice.</a> Curr. Drug Targets. 9, 485-494 (2008).</li>
</ol>

Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

Il protocollo qui presentato fornisce una preparazione fisiologica per valutare la funzionalità muscolare delle vie aeree. In genere funzionano 3-4 prodotti per il bagno di organi contemporaneamente, tuttavia, i sistemi preconfezionati sono disponibili un certo numero di fornitori che permettono misurazioni simultanee fino a 8 preparazioni (ADInstruments, strumenti di precisione del mondo, e apparecchi di Harvard). Abbiamo utilizzato un certo numero di trasduttori di forza e bagni organo tessuto con risultati equivalent...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Comments </td></tr><tr><td> Convertitore analogico-digitale </td><td> ADInstruments </td><td> PowerLab 4/35 </td><td></td></tr><tr><td> Carbacolo (Chloride Carbamoylcholine) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C4832 </td><td> 10 -2 M in acqua (aliquote possono essere conservati a -20 ° C) </td></tr><tr><td> Charting Software </td><td> ADInstrtuments </td><td> LabChart </td><td></td></tr><tr><td> Riscaldamento circolatore </td><td> Haake </td><td> Mixer Mill MM400 </td><td></td></tr><tr><td> Trasduttore di forza isometrica </td><td> Kent Scientific </td><td> TRN001 </td><td></td></tr><tr><td> Stimolatore </td><td> Grass Technologies </td><td> S88 Squ Doppia uscitasono Pulse stimolatore </td><td></td></tr><tr><td> Carta igienica </td><td> WPI </td><td> 47264 </td><td></td></tr></tbody></table>

nelle misure in vitro di costrizione tracheale con mice

In vitro Measurements of Tracheal Constriction Using Mice

Transgenici e topi knockout sono potenti strumenti per lo studio della fisiologia e fisiopatologia delle vie aeree 1,2. In tensometry isolati in vitro di preparazioni tracheali ha dimostrato di essere un saggio utile della muscolatura liscia delle vie aeree (ASM) risposta contrattile nei topi geneticamente modificati. Questi preparati in vitro tracheali sono relativamente semplici, forniscono una risposta forte, e trattenere sia funzionali terminazioni nervose colinergiche e risposte muscolari, anche dopo lunghi incubazioni. Tensometry tracheale fornisce inoltre un saggio funzionale per studiare una varietà di vie di segnalazione secondo messaggero che influenzano la contrazione della muscolatura liscia. Contrazione della trachea è mediato principalmente dai parasimpatici, nervi colinergici che rilasciano acetilcolina sulla ASM (Figura 1). I principali recettori muscarinici dell&#39;acetilcolina ASM sono M2 e M3 che sono G e I / O GQ recettori accoppiati, rispettivamente <sup&gt; 3,4,5. Recettori M3 evocare contrazione accoppiamento Gq per attivare la fosfolipasi C, aumento della produzione e IP3 IP3-mediato rilascio del calcio dal reticolo sarcoplasmatico 3,6,7. M2 / G i / o segnalazione è creduto per migliorare contrazioni mediante inibizione di adenilato ciclasi che porta ad una diminuzione dei livelli di cAMP 5,8,9,10. Questi percorsi costituiscono il cosiddetto &quot;farmaco-contrazione&quot; della muscolatura liscia delle vie aeree 11. Inoltre, colinergici segnalazione attraverso i recettori M2 e M3 modulata dal segnale) comporta percorsi che depolarizzare il ASM che a loro volta attivano L-type, voltaggio-dipendenti canali del calcio (Figura 1) e flusso di calcio (cosiddetto &quot;eccitazione-contrazione&quot; ) 4,7. Recensioni più dettagliate sulle vie di segnalazione che controllano costrizione delle vie respiratorie può essere trovato 4,12. Le vie di cui sopra sembrano essere conservati tra i topi e altre specie. Tuttavia, trachee topo differiscono da altre specie in alcuni percorsi di segnalazione. Il più importante è la loro mancanza di risposta contrattile di istamina e adenosina 13,14, entrambi i modulatori ASM ben noti negli esseri umani e altre specie 5,15. Presentiamo qui protocolli per l&#39;isolamento di murini anelli tracheali e la misura in vitro della loro produzione contrattile. Sono incluse le descrizioni della configurazione delle apparecchiature, l&#39;isolamento anello di trachea e misure contrattili. Esempi sono forniti per evocare contrazioni indirettamente con elevata stimolazione dei nervi e potassio direttamente da depolarizzazione del muscolo ASM attivare il voltaggio-dipendenti influsso di calcio (1. Alto K +, Figura 1). Inoltre, i metodi sono presentati per stimolazioni di nervi solo utilizzando stimolazione di campo elettrico (2. EFS, Figura 1) stimolazione, o per diretta del muscolo ASM utilizzando neurotrasmettitore esogeno applicato alla vasca (3. Esogeno ACH, Figura 1). Questo FLExibility e facilità di preparazione rende il modello di anello trachea isolata un saggio robusto e funzionale per un numero di segnalazione cascate coinvolti nella contrazione muscolare liscia delle vie aeree.

Topi transgenici sono stati estremamente utili per attribuire funzione fisiologica ai geni. Come tale, la ricerca in generale, e studi funzionali delle vie aeree, in particolare, hanno subito un notevole spostamento verso modelli murini. Qui forniamo protocolli per<em&gt; In vitro</em&gt; Studi di costrizione trachea per valutare la funzionalità della muscolatura liscia delle vie aeree in murino.

Nelle misure in vitro di costrizione tracheale con Mice

I topi transgenici e knockout sono stati strumenti potenti per l'indagine della fisiologia e della patofisiologia delle vie aeree1,2. La tensometria in vitro di...

L'obiettivo generale di questa procedura è misurare la contrattilità del muscolo liscio tracheale di topi. Questo viene ottenuto preparando innanzitutto i bagni tissutali e calibrando il trasduttore di forza isometrico. Successivamente, la trachea del topo viene isolata e montata sulle aste del trasduttore di forza.Successivamente, la trachea viene stimolata e la tensione risultante viene misurata e analizzata. In definitiva, i risultati possono mostrare la contrattilità del muscolo tracheale mediante misurazioni della forza isometrica. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come le misurazioni in vivo della resistenza delle vie aeree, è che le misurazioni della tensione in vitro forniscono un saggio più diretto della contrattilità del muscolo liscio.Lo svantaggio di questa tecnica è che si tratta di una preparazione in bagno d'organo, pertanto fattori circolanti che potrebbero influenzare la contrattilità del muscolo liscio in vivo potrebbero essere assenti nella preparazione in vitro. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sul muscolo liscio tracheale del topo, può essere applicato anche ad altri tessuti muscolari lisci, come vasi di gro

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Ripetute misurazioni della fisiologia respiratoria e roditori di campionamento di cellule infiammatorie delle vie aeree sono auspicabili, ma generalmente non realizzabili. Qui si descrive un metodo ripetibile per l'intubazione per via orale nei topi che permette misurazioni ripetute di iperreattività delle vie aeree e il campionamento di cellule infiammatorie delle vie aeree.

Un reversibile, metodo non invasivo per le misure di resistenza delle vie aeree e liquido di lavaggio broncoalveolare di campionamento nei topi

Restringimento aortico trasversale (TAC) nel topo è un modello comunemente usato sperimentale per studiare meccanismi che sottendono l'ipertrofia cardiaca e scompenso cardiaco sviluppo. Qui si descrivono le modalità per costrizione dell'aorta per creare un grado riproducibile di ipertrofia cardiaca nei topi.

Aortica costrizione trasversale nei topi

Abbiamo sviluppato un metodo semplice, affidabile e relativamente poco costoso per l'intubazione endotracheale nei topi mediante laringoscopia diretta con un otoscopio con un speculum 2,0 millimetri. Questa tecnica è atraumatica e può essere utilizzato per misurazioni ripetute in esperimenti cronici. Troviamo superiore a tracheostomia o riportato in precedenza tecniche non chirurgiche.

Intubazione endotracheale in Mouse<em&gt; Via</em&gt; Laringoscopia diretta usando un otoscopio

Il presente documento descrive un metodo striaghforward ed efficiente intubazione topi per le misure di funzionalità polmonare o instillazione polmonare, che consente ai topi di recuperare e da studiare in tempi successivi. La procedura prevede una fonte economica di luce a fibre ottiche che illumina direttamente la trachea.

Un metodo semplice di intubazione mouse polmone

Il glicocalice endoteliale / endoteliale strato superficiale è perfettamente studiata usando la microscopia intravitale. Microscopia intravitale è tecnicamente difficile in un organo in movimento come il polmone. Si dimostra come brightfield simultanea e microscopia a fluorescenza possono essere utilizzate per stimare endoteliale spessore dello strato di superficie in un movimento...

Nella misura in vivo della superficie polmonare strato endoteliale mouse

L'obiettivo di questo protocollo è fornire metodi automatizzati per quantificare le patologie polmonari croniche in un modello murino di BPCO. Il protocollo include l'esposizione dei topi al fumo di sigaretta (CS), la misurazione della funzione polmonare, il gonfiaggio dei polmoni e l'utilizzo di metodi morfometrici per misurare l'enfisema e il rimodellamento delle piccole vie aeree nei topi.

Misurazione automatica di enfisema polmonare e piccole vie aeree ritocca in sigaretta Mice-fumo esposti

Questo articolo presenta un metodo rapido e semplice per l'amministrazione bleomicina direttamente nella trachea del mouse tramite intubazione. I principali vantaggi di questo metodo sono che è altamente riproducibile, facile da padroneggiare, e non richiede attrezzature specializzate o tempi di recupero lunghi.

Un metodo migliore per Rapid intubazione della trachea nei topi

Qui, presentiamo un protocollo di costrizione trasversale aortica (TAC) tramite un thoracotomy laterale. Questa tecnica è una procedura chirurgica mini-invasiva, chiuso il petto con l'obiettivo di simulare sovraccarico pressorio e insufficienza cardiaca nei topi utilizzando le impostazioni standard di Laboratorio TAC.

Un modello chiuso-cassa per indurre costrizione trasversale aortica in topi

L'obiettivo di questo articolo è quello di descrivere un metodo raffinato di intubazione del topo di laboratorio. Il metodo non è invasivo e, quindi, ideale per studi che richiedono il monitoraggio seriale della funzione respiratoria e/o l'instillazione di trattamenti nel polmone.

Intubazione orotrachea ripetuta nei topi

Vari modelli animali di ernia diaframmatica congenita e occlusione tracheale fetale presentano vantaggi e svantaggi per quanto riguarda questioni etiche, costi, difficoltà chirurgiche, dimensioni, tassi di sopravvivenza e disponibilità di strumenti genetici. Questo modello fornisce un nuovo strumento per studiare l'impatto sia dell'occlusione tracheale che dell'aumento della pressione luminare sullo sviluppo polmonare.

Modello di occlusione tracheale fetale transuterina nei topi

Qui, proponiamo un protocollo per la somministrazione di lipopolisaccaridi intratracheali (LPS) tramite intubazione endotracheale orofaringea non invasiva. Questo metodo riduce al minimo il trauma della procedura chirurgica per l'animale e fornisce accuratamente LPS alla trachea e quindi ai polmoni.

Instillazione di lipopolisaccaridi intratracheali non invasivi nei topi

Impara a misurare la contrattilità del muscolo liscio tracheale nei topi con tensiometria in vitro di anelli tracheali isolati. Questo metodo diretto consente di studiare i meccanismi fisiologici e farmacologici della costrizione delle vie aeree.

Nelle misure in vitro di costrizione tracheale con Mice

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