Name: Nelle misure in vitro di costrizione tracheale con Mice (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-25T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 20 s
Description: Impara a misurare la contrattilità del muscolo liscio tracheale nei topi con tensiometria in vitro di anelli tracheali isolati. Questo metodo diretto consente di studiare i meccanismi fisiologici e farmacologici della costrizione delle vie aeree.

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Questo lavoro è stato finanziato da una sovvenzione da parte del Centro per l&#39;Innovazione nella prevenzione e nel trattamento delle malattie delle vie aeree, NINDS sovvenzione (NS052574), e dal Programma per la Ricerca Sandler asma.

1. Attrezzatura I componenti principali di un dispositivo di misurazione contrazione sono mostrate schematicamente in figura 2A). <ol><li> Un bagno tessuto. Il bagno tessuto mantiene una soluzione ossigenata fisiologica a temperatura calda. Per topi anelli trachea, si usa un bagno tessuto 10 ml contenente una camicia d&#39;acqua per la circolazione di una soluzione di riscaldamento, un ingresso di vetro sinterizzato a bolle di ossigeno (95% / 5% O 2 / CO 2 miscela) e di ingresso e di uscita per cambiare soluzioni. Una soluzione PSS serbatoio viene memorizzato a ebollizione costante del 95% / 5% O 2 / CO 2 in miscela a 37 ° C in bagno di acqua (non mostrato). Per gli scambi, soluzione PSS viene pompata dal serbatoio verso l&#39;ingresso bagno tessuto (porta inferiore) a circa 100 ml al minuto per consentire lo scambio di soluzione relativamente veloce. La soluzione è presa attraverso una porta troppopieno (apertura superiore) che permette volume costante (~ 10 ml) nel tessuto del bloccoh durante la soluzione di scambio. Usiamo un circolatore Haake riscaldamento per pompare acqua calda attraverso la camicia bagno di tessuto (per mantenere 37 ° C). Bagni dei tessuti può essere ottenuto da una serie di fornitori e sono disponibili in una varietà di formati e stili per soddisfare le esigenze sperimentali del ricercatore. </li><li> Un trasduttore di forza. Per misurare la tensione isometrica, il tubo trachea viene infilato su L-forma estremità di due barre di acciaio inossidabile (Figura 2A). Si deve prestare attenzione ad utilizzare un tipo di acciaio inossidabile che è compatibile con materiale biologico. L&#39;asta superiore è collegato tramite una clip a un trasduttore di forza isometrica. L&#39;asta inferiore contiene la trachea in una posizione fissa, ed è montato su un micrometro per la regolazione della tensione passiva e / o lunghezza del muscolo. Contrazione della trachea crea tensione sul trasduttore di forza, che viene convertito in un segnale di tensione al preamplificatore. L&#39;asta inferiore può anche essere configurato per includere due piastre rettangolari platino (4 mm di distanza) t<html> cappello fianco della trachea (Figura 2B). Le piastre platino sono collegati ad uno stimolatore Grass S88 che consente l&#39;erogazione di un campo elettrico attraverso la trachea. Fili aperti e saldatura sono rivestiti con Sylgard (Sylgard 184 elastomero di silicone, Dow Corning Corp, Midland, MI), per evitare la lisciviazione dei metalli nella soluzione del bagno. </li><li> A / D converter software, computer e acquisizione. Segnali provenienti dai preamplificatori sono registrati su un MacLab 8 A / D del sistema. Questa è una versione precedente di hardware corrente ADInstrument PowerLab. Usiamo il programma grafico (ADInstruments) che consente la registrazione continua della tensione in tutto l&#39;esperimento. Generazione di tensione del muscolo trachea è piuttosto lento, e quindi troviamo che l&#39;acquisizione di 100 punti al secondo è sufficiente. La misura della tensione viene calibrato utilizzando pesi noti (fino a 5 grammi) prima di ogni esperimento. Sistemi simili sono disponibili presso i venditori di altri (ad esempio, BIOPAC, Instruments GW). </li></ol>titolo &quot;&gt; 2. Trachea isolamento <ol><li> Prima di isolamento tessuto il trasduttore di forza viene calibrato con pesi noti, e il bagno tessuto viene riempito con PSS normali (vedi Tabella I). L&#39;entrata dell&#39;aria è regolata per ottenere un flusso di luce di O 2 / CO 2. </li><li> Trachee da due mesi o topi più anziani sono ottimali. I piccoli animali possono essere usati ma trachee ottenuti da questi richiedono una maggiore abilità da montare sui cavi dei trasduttori di forza a causa delle loro piccole dimensioni. Prima di dissezione, i topi sono profondamente sedato con isoflurano. Il livello adeguato di sedazione viene raggiunto quando un dito-pinch con pinza è in grado di suscitare una risposta. I topi sono immediatamente sacrificati mediante dislocazione cervicale Una nota importante:. Abbiamo osservato che Avertin (Tribromoethanol), un sedativo comunemente usato nei topi, ha forti effetti rilassanti sulla muscolatura liscia delle vie aeree e, pertanto, non deve essere utilizzato per gli studi di contrazione trachea. </li><li> La pelle (e in pelliccia) viene rimosso dal torace alla gola. Ribs sono tagliati dalla base dello sterno, lateralmente (su entrambi i lati) all&#39;inizio del cuore. Lo sterno e le costole sono poi tirato in avanti alla gola per rivelare il cuore / polmoni, timo, trachea (ventrale) ed esofago (allegata al - e dorsale a trachea). </li><li> La trachea viene asportata tagliando la biforcazione bronchiale sotto e sopra la faringe. La trachea viene inserito in un gelido ossigenato (95/5) soluzione di PSS (composizione indicata nella tabella I). </li><li> La trachea è sezionato pulizia dei tessuti circostanti. Durante la pulizia, la trachea può essere tenuto alla faringe o al di sotto della biforcazione. Tuttavia, si deve fare attenzione a non applicare direttamente le pinze alla stessa trachea. Forbici Belle può essere usato per tagliare tessuti circostanti, ma il taglio deve essere effettuato sempre parallelo alla trachea per evitare danni. Questa parte della procedura è facilitata se la preparazione trachea è bloccato sotto la biforcazione e sopra la faringe su un Sylgard rivestita piatto (Sylgard 184 SiliconeElastomero, Dow Corning Corp, Midland, MI). </li><li> Dopo aver rimosso il tessuto circostante, la trachea è tagliato sotto la faringe e sopra la biforcazione bronchiale e delicatamente montato su fili trasduttori di forza. </li><li> La trachea viene infilato su due a forma di L uncini metallici (Figura 2A). Un rebbio è collegato ad un trasduttore forza-spostamento per la registrazione continua della tensione isometrica. Un altro polo è collegato ad un micrometro. Il bagno tessuto viene quindi sollevato in modo che la trachea è immerso in PSS. Montaggio della trachea dovrebbe essere fatto più rapidamente possibile per ridurre il tempo trachea si tengono fuori di PSS. Con la pratica, il montaggio della trachea può essere fatto in un minuto ma in genere evitare di volte di più di 3 minuti per evitare la perdita di vitalità. </li><li> Il micrometro viene regolato lentamente per ottenere una tensione passiva di ~ 10 mN (~ 1 grammo-forza). La tensione ottimale di riposo è stata determinata empiricamente e abbiamo trovato che la tensione passiva di circa 5-10 risultati mN in un equivalente, massima risposta ad alta stimolazione di potassio. Questo è coerente con un numero di altri studi che utilizzano una tensione passiva in questo intervallo 16,17,18. Nei primi 5-10 minuti, trachea tensione passiva tende a scendere leggermente (stress-rilassamento fenomeno) e il micrometro viene utilizzato per regolare la tensione passiva a ~ 10 mN durante equilibrazione. La trachea è lasciato equilibrare per almeno 1 ora prima sfide sperimentali. </li></ol> 3. Alta stimolazione di potassio Equilibrazione seguito, la trachea è sfidato due volte con una soluzione di alta PSS di potassio (67 mM KCl, Tabella I). La contrazione generalmente richiede 5-10 minuti per raggiungere ~ steady-state in quel momento il bagno tessuto è risciacquato più volte con PSS normali per rilassarsi completamente la trachea. La contrazione potassio viene ripetuto una seconda volta, e una terza volta (se necessario) fino contrazioni riproducibili. <pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 4. Contrazione evocati dalla stimolazione elettrica La trachea è fiancheggiato da due piastre rettangolari platino (elettrodi) che permettono la stimolazione di campo elettrico (EFS) alla preparazione. La risposta contrattile alla EFS è una funzione della frequenza e tensione. Esso è inoltre influenzata da parametri fisici quali la superficie degli elettrodi e la distanza tra loro. Le caratteristiche di potenza del stimolatore anche influenzare la risposta tali che a tensioni superiori e uscite di corrente lo stimolatore può raggiungere il suo massimo. Le caratteristiche di ogni sistema EFS dovrebbe essere determinata esaminando le risposte muscolari contrattili a diverse durate di stimolo, frequenze, tensioni e durate di impulso. Per il nostro setup sperimentale, abbiamo scoperto che gli elettrodi separati da ~ 4 mm, ampiezza e la stimolazione di 44 V (0,5 ms impulsi) e di 30 Hz è ottimale per raggiungere riproducibili risposte contrattili quasi massimi. 5. Contrazione Evoked dalla stimolazione colinergica La reattività della trachea di esogena composti applicati è valutata mediante aggiunta di una singola dose del farmaco di interesse o, con aggiunte multiple del farmaco in modo dose cumulativa. Per la trachea, il nostro laboratorio solitamente usata carbacolo per attivare i recettori colinergici, perché, a differenza di acetilcolina, carbacolo non è degradato dalla acetilcolinesterasi. Una ragionevole dose-risposta è compreso tra 10 -8 a 10 -5 M carbacolo. Montaggio del registro [carbacolo] contrattile curva di risposta con uno di tipo Hill-equazione consente una stima della CE 50 (mezza raggiungere la massima concentrazione efficace) che è una misura della sensibilità di contrazione tracheale per l&#39;agonista colinergico 19. Vale la pena notare che una data dose di carbacolo darà una risposta leggermente maggiore in dose singola che come parte di una curva di risposta alla dose cumulativa. 6. Risultati rappresentativi </p&gt; Un esempio di una risposta contrattile di potassio è mostrata in Figura 3A. La contrazione raggiunge un massimo in circa 10 minuti, ma può mostrare un lieve calo negli anni successivi. Durante il lavaggio iniziale di potassio, il muscolo può mostrare un aumento transitorio di contrazione che è causa di una caduta nella temperatura del piccolo volume di soluzione PSS riscaldato nelle linee soluzione perfusione transitoriamente la preparazione. Questo può essere minimizzata con un volume morto minimo nella tubazione che collega il serbatoio riscaldata PSS bagno e tessuti, e anche attraverso lo scambio di soluzione relativamente velocemente (generalmente si pompa soluzioni a 100 ml / min). Ogni preparazione avrà alcune differenze nella risposta contrattile a causa delle differenze di massa muscolare o danni verificatisi durante la dissezione. 3B figura mostra due trachee di massa muscolare diversa sfidati con potassio e carbacolo. Anche se le contrazioni colinergici-evocati differiscono, ily sono simili dopo la normalizzazione della risposta con soluzione di potassio (Figura 3C). La figura 4 mostra un esempio di (colinergico) contrazione carbacolo evocata utilizzando dosi singole (A) e un aumento cumulativo (B). Le soluzioni carbacolo vengono aggiunti direttamente alla vasca e il gas gorgogliati aiuta in miscelazione rapida. Vale la pena notare che l&#39;aggiunta di una singola dose (cioè 1 pM, Figura 4A) ha una risposta leggermente maggiore della concentrazione equivalente durante un cumulativa curva dose-risposta (1 pM, Figura 4B). Figura 4C mostra un grafico della forza di contrazione in funzione delle concentrazioni carbacolo utilizzando i dati di Figura 4B. Effetti di carbacolo saturano ad concentrazione 10 -5 M. Anche se agonisti colinergici avvia contrazione attraverso meccanismi di rilascio di calcio, una componente sostanziale della contrazione è mediata da depolarizzazione eattivazione di canali voltaggio-dipendenti calcio 20. Figura 5A mostra un esempio di EFS evocati contrazioni. Trachee sono stimolati con durata di 0,5 millisecondi, 40 impulsi volt fino contrazioni raggiungere un plateau (vedi riquadro a1). Un aumento della frequenza di stimolazione determina un aumento della risposta contrattile (frequenza curva di risposta è riportata in Figura 5B). Stimolazione del campo elettrico è stato dimostrato per evocare contrazioni prevalentemente attivando nervi presinaptici. Ciò è dimostrato dal l&#39;effetto della tossina botulinica, un bloccante del rilascio di neurotrasmettitore che blocca la maggior parte delle contrazioni EFS-evocati trachea 21. Inoltre, tetrodotossina, un agente che blocca i canali del Na + inibisce anche l&#39;attività nervosa ed elimina la risposta della trachea per EFS. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3703/3703fig1.jpg" /> Figura 1. Schema di tha grandi vie di segnalazione in una preparazione trachea isolata. Mostrato è un terminale assone colinergico innerva una cellula del muscolo liscio tracheale. Le vie di segnalazione principali sono M3-M2-muscarinici e l&#39;attivazione del recettore dell&#39;acetilcolina (mAChR) che causano il rilascio del calcio attraverso i recettori IP3 (M3) e la riduzione del cAMP (M2). Recettori M2 (e alcuni contributo dei recettori M3) anche causare depolarizzazione colinergica evocata che attiva L canali di tipo dipendente dalla tensione di calcio e influsso di calcio. Comuni agenti contrattili e dei loro effettori sono: 1. di potassio (depolarizzare cellule muscolari lisce e assoni colinergici), 2. campo di stimolazione elettrica (EFS, depolarizza colinergico assone) e 3. l&#39;applicazione esogena di agenti colinergici quali acetilcolina o carbacolo (attiva i recettori muscarinici direttamente). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3703/3703fig2.jpg" /> Figura 2. Schema di materiale utilizzato per misurare le contrazioni tracheali. A. Il trasduttore di forza, micrometro e bagno tessuti sono montati su asta di supporto tramite morsetti a vite. L&#39;anello tracheale è filettato sulle aste superiore e inferiore. Nel diagramma, il bagno di tessuto è posizionata sotto la preparazione (ad esempio durante il montaggio della trachea sul trasduttore di forza). Durante gli studi di contrazione, il bagno tessuto viene spostata verticalmente a fare il bagno la preparazione. B. Per la stimolazione del campo elettrico l&#39;asta inferiore viene modificato per includere due piastre platino che sono montati lateralmente al filo azienda trachea. Le piastre platino sono collegati da fili elettrici ad uno stimolatore. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3703/3703fig3.jpg" /> Figura 3. Esempi di potassio (67 mM) di risposta contrattile della trachea. (A) mostra duplicati, risposte riproducibili al potassio alto. (B) Esempi di risposta contrattile alla carbacolo di due differenti trachee. (C) Le risposte alle trachee in B sono simili quando normalizzared per la risposta ad alta potassio. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3703/3703fig4.jpg" /> Figura 4. Esempi di carbacolo contrazioni indotte. (A) carbacolo contrazioni indotte sono state somministrate dosi singole seguita da washout. (B) Esempio cumulativa curva dose-risposta per la trachea in A. (C) contrazioni picco da B vengono tracciati come funzione della concentrazione carbacolo. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3703/3703fig5.jpg" /> Figura 5. Esempi di contrazioni evocati dalla stimolazione del campo elettrico. (A) stimolazione del campo elettrico della contrazione trachea utilizzando impulsi 0,5 ms, 40 volt, e frequenze di stimolazione diversi come indicato. Inset è tempo espanso contrazione a 30 Hz. (B) contrazioni di picco di A sono plotted in funzione della frequenza di stimolazione. PSS normali <table border="1"><tbody><tr><td> Sale </td><td> Conc. (MM) </td><td> Importo (g / 2 L) </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 119 </td><td> 13,91 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 4,7 </td><td> 0,7 </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> 1,18 </td><td> 0,32 </td></tr><tr><td> MgSO 4 x 7H 2 O </td><td> 1,17 </td><td> 0,58 </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> 18 </td><td> 3,02 </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> 0,026 </td><td> 0,1 ml di 0,5 M </td></tr><tr><td> Glucosio </td><td> 11 </td><td> 3,96 </td></tr><tr><td> Saccarosio </td><td> 12,5 </td><td> 8,56 </td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> 2 </td><td> 400 ml di 10 mM </td></tr></tbody></table> Alta K + PSS (NACL e rettifiche KCl) <table border="1"><tbody><tr><td> Sale </td><td> Conc. (MM) </td><td> Importo (g / 2 L) </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 56,7 </td><td> 6,628 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 67 </td><td> 9,991 </td></tr></tbody></table> . Tabella 1 Ricetta per soluzioni PSS. Nota: Le soluzioni sono fatta fresca ogni settimana, con acqua ultrapura di qualità, e sono conservate in frigorifero per non più di 5 giorni per evitare di contaminare la crescita.

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<li>Krane, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aquaporin+5-deficient+mouse+lungs+are+hyperresponsive+to+cholinergic+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Aquaporin 5-deficient mouse lungs are hyperresponsive to cholinergic stimulation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 14114-14119 (2001).</li>
<li>Semenov, I., Wang, B., Herlihy, J. T., Brenner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BK+channel+beta1-subunit+regulation+of+calcium+handling+and+constriction+in+tracheal+smooth+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Lung.+Cell+Mol.+Physiol%22%5BJournal%5D)">BK channel beta1-subunit regulation of calcium handling and constriction in tracheal smooth muscle.</a> Am. J. Physiol. Lung. Cell Mol. Physiol. 291, L802-L810 (2006).</li>
<li>Fortner, C. N., Breyer, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EP2+receptors+mediate+airway+relaxation+to+substance+P+ATP%2C+and+PGE2%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Lung+Cell+Mol.+Physiol%22%5BJournal%5D)">EP2 receptors mediate airway relaxation to substance P ATP, and PGE2.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 281, 469-474 (2001).</li>
<li>Hay, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+modulation+of+endothelin+ligand-induced+contraction+in+isolated+tracheae+from+endothelin+B+%28ET%28B%29%29+receptor+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Differential modulation of endothelin ligand-induced contraction in isolated tracheae from endothelin B (ET(B)) receptor knockout mice.</a> Br. J. Pharmacol. 132, 1905-1915 (2001).</li>
<li>Stengel, P. W., Yamada, M., Wess, J., Cohen, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M%283%29-receptor+knockout+mice%3A+muscarinic+receptor+function+in+atria%2C+stomach+fundus%2C+urinary+bladder%2C+and+trachea%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Regul.+Integr.+Comp+Physiol%22%5BJournal%5D)">M(3)-receptor knockout mice: muscarinic receptor function in atria, stomach fundus, urinary bladder, and trachea.</a> Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp Physiol. 282, R1443-R1449 (2002).</li>
<li>Trevisani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+in+vitro+expression+of+B1+receptor+in+the+mouse+trachea+and+urinary+bladder%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Evidence for in vitro expression of B1 receptor in the mouse trachea and urinary bladder.</a> Br. J. Pharmacol. 126, 1293-1300 (1038).</li>
<li>Mehats, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDE4D+plays+a+critical+role+in+the+control+of+airway+smooth+muscle+contraction%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">PDE4D plays a critical role in the control of airway smooth muscle contraction.</a> FASEB J. 17, 1831-1841 (2003).</li>
<li>Kumar, R. K., Herbert, C., Foster, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%22classical%22+ovalbumin+challenge+model+of+asthma+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Drug+Targets%22%5BJournal%5D)">The "classical" ovalbumin challenge model of asthma in mice.</a> Curr. Drug Targets. 9, 485-494 (2008).</li>
</ol>

Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

Il protocollo qui presentato fornisce una preparazione fisiologica per valutare la funzionalità muscolare delle vie aeree. In genere funzionano 3-4 prodotti per il bagno di organi contemporaneamente, tuttavia, i sistemi preconfezionati sono disponibili un certo numero di fornitori che permettono misurazioni simultanee fino a 8 preparazioni (ADInstruments, strumenti di precisione del mondo, e apparecchi di Harvard). Abbiamo utilizzato un certo numero di trasduttori di forza e bagni organo tessuto con risultati equivalent...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Comments </td></tr><tr><td> Convertitore analogico-digitale </td><td> ADInstruments </td><td> PowerLab 4/35 </td><td></td></tr><tr><td> Carbacolo (Chloride Carbamoylcholine) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C4832 </td><td> 10 -2 M in acqua (aliquote possono essere conservati a -20 ° C) </td></tr><tr><td> Charting Software </td><td> ADInstrtuments </td><td> LabChart </td><td></td></tr><tr><td> Riscaldamento circolatore </td><td> Haake </td><td> Mixer Mill MM400 </td><td></td></tr><tr><td> Trasduttore di forza isometrica </td><td> Kent Scientific </td><td> TRN001 </td><td></td></tr><tr><td> Stimolatore </td><td> Grass Technologies </td><td> S88 Squ Doppia uscitasono Pulse stimolatore </td><td></td></tr><tr><td> Carta igienica </td><td> WPI </td><td> 47264 </td><td></td></tr></tbody></table>

nelle misure in vitro di costrizione tracheale con mice

In vitro Measurements of Tracheal Constriction Using Mice

Transgenici e topi knockout sono potenti strumenti per lo studio della fisiologia e fisiopatologia delle vie aeree 1,2. In tensometry isolati in vitro di preparazioni tracheali ha dimostrato di essere un saggio utile della muscolatura liscia delle vie aeree (ASM) risposta contrattile nei topi geneticamente modificati. Questi preparati in vitro tracheali sono relativamente semplici, forniscono una risposta forte, e trattenere sia funzionali terminazioni nervose colinergiche e risposte muscolari, anche dopo lunghi incubazioni. Tensometry tracheale fornisce inoltre un saggio funzionale per studiare una varietà di vie di segnalazione secondo messaggero che influenzano la contrazione della muscolatura liscia. Contrazione della trachea è mediato principalmente dai parasimpatici, nervi colinergici che rilasciano acetilcolina sulla ASM (Figura 1). I principali recettori muscarinici dell&#39;acetilcolina ASM sono M2 e M3 che sono G e I / O GQ recettori accoppiati, rispettivamente <sup&gt; 3,4,5. Recettori M3 evocare contrazione accoppiamento Gq per attivare la fosfolipasi C, aumento della produzione e IP3 IP3-mediato rilascio del calcio dal reticolo sarcoplasmatico 3,6,7. M2 / G i / o segnalazione è creduto per migliorare contrazioni mediante inibizione di adenilato ciclasi che porta ad una diminuzione dei livelli di cAMP 5,8,9,10. Questi percorsi costituiscono il cosiddetto &quot;farmaco-contrazione&quot; della muscolatura liscia delle vie aeree 11. Inoltre, colinergici segnalazione attraverso i recettori M2 e M3 modulata dal segnale) comporta percorsi che depolarizzare il ASM che a loro volta attivano L-type, voltaggio-dipendenti canali del calcio (Figura 1) e flusso di calcio (cosiddetto &quot;eccitazione-contrazione&quot; ) 4,7. Recensioni più dettagliate sulle vie di segnalazione che controllano costrizione delle vie respiratorie può essere trovato 4,12. Le vie di cui sopra sembrano essere conservati tra i topi e altre specie. Tuttavia, trachee topo differiscono da altre specie in alcuni percorsi di segnalazione. Il più importante è la loro mancanza di risposta contrattile di istamina e adenosina 13,14, entrambi i modulatori ASM ben noti negli esseri umani e altre specie 5,15. Presentiamo qui protocolli per l&#39;isolamento di murini anelli tracheali e la misura in vitro della loro produzione contrattile. Sono incluse le descrizioni della configurazione delle apparecchiature, l&#39;isolamento anello di trachea e misure contrattili. Esempi sono forniti per evocare contrazioni indirettamente con elevata stimolazione dei nervi e potassio direttamente da depolarizzazione del muscolo ASM attivare il voltaggio-dipendenti influsso di calcio (1. Alto K +, Figura 1). Inoltre, i metodi sono presentati per stimolazioni di nervi solo utilizzando stimolazione di campo elettrico (2. EFS, Figura 1) stimolazione, o per diretta del muscolo ASM utilizzando neurotrasmettitore esogeno applicato alla vasca (3. Esogeno ACH, Figura 1). Questo FLExibility e facilità di preparazione rende il modello di anello trachea isolata un saggio robusto e funzionale per un numero di segnalazione cascate coinvolti nella contrazione muscolare liscia delle vie aeree.

Topi transgenici sono stati estremamente utili per attribuire funzione fisiologica ai geni. Come tale, la ricerca in generale, e studi funzionali delle vie aeree, in particolare, hanno subito un notevole spostamento verso modelli murini. Qui forniamo protocolli per<em&gt; In vitro</em&gt; Studi di costrizione trachea per valutare la funzionalità della muscolatura liscia delle vie aeree in murino.

Nelle misure in vitro di costrizione tracheale con Mice

I topi transgenici e knockout sono stati strumenti potenti per l'indagine della fisiologia e della patofisiologia delle vie aeree1,2. La tensometria in vitro di...

L'obiettivo generale di questa procedura è misurare la contrattilità del muscolo liscio tracheale di topi. Questo viene ottenuto preparando innanzitutto i bagni tissutali e calibrando il trasduttore di forza isometrico. Successivamente, la trachea del topo viene isolata e montata sulle aste del trasduttore di forza.Successivamente, la trachea viene stimolata e la tensione risultante viene misurata e analizzata. In definitiva, i risultati possono mostrare la contrattilità del muscolo tracheale mediante misurazioni della forza isometrica. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come le misurazioni in vivo della resistenza delle vie aeree, è che le misurazioni della tensione in vitro forniscono un saggio più diretto della contrattilità del muscolo liscio.Lo svantaggio di questa tecnica è che si tratta di una preparazione in bagno d'organo, pertanto fattori circolanti che potrebbero influenzare la contrattilità del muscolo liscio in vivo potrebbero essere assenti nella preparazione in vitro. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sul muscolo liscio tracheale del topo, può essere applicato anche ad altri tessuti muscolari lisci, come vasi di grosso calibro, diversi tratti intestinali e muscolo liscio della vescica, dove preparazioni ad anello del muscolo sono sufficientemente grandi da poter essere montate su fili di trasduttori forzati.Due componenti del dispositivo per la misurazione della contrazione richiedono una descrizione qui: il bagno tissutale e il trasduttore di forza. Il bagno tissutale mantiene una soluzione fisiologica ossigenata a temperatura calda per anelli di trachea di topo. Viene utilizzato un bagno tissutale da 10 millilitri, dotato di una guaina ad acqua per il riscaldamento, un ingresso in vetro per far bollire l'ossigeno e porte di ingresso e uscita per cambiare le soluzioni conservate a parte.È presente un serbatoio di soluzione PSS saturata con ossigeno e mantenuta a 37 gradi Celsius mediante un bagno d'acqua, utilizzato per il ricambio della soluzione. La soluzione PSS viene pompata dal serbatoio all'ingresso della camera tissutale a circa 100 millilitri al minuto. Nel frattempo, una pompa circolatrice riscaldata fa circolare acqua a 37 gradi Celsius attraverso la giacca della camera tissutale.Il secondo strumento di interesse è il trasduttore di forza. Questo viene utilizzato per misurare la tensione isometrica nella trachea. Il tubo tracheale viene infilato sulle estremità a forma di L di due aste realizzate in materiale biologicamente compatibile, come l'acciaio inossidabile.La barra superiore è collegata tramite una clip a un trasduttore di forza isometrica. La barra inferiore mantiene la trachea in una posizione fissa ed è montata su un micrometro per la regolazione della tensione passiva e/o della lunghezza del muscolo. La contrazione della trachea genera una tensione sul trasduttore di forza, che viene convertita in un segnale elettrico a livello del preamplificatore per la stimolazione elettrica.La barra inferiore è configurata con due piastre rettangolari di platino posizionate a quattro millimetri di distanza, da posizionare ai lati della trachea. Le piastre di platino sono collegate a uno stimolatore convenzionale, come il Grass S 88.In questa preparazione, i fili scoperti devono essere saldati e rivestiti con un apposito isolante per prevenire il rilascio di metalli nella soluzione del bagno. L'equipaggiamento aggiuntivo comprende un computer con convertitore analogico-digitale e un software di acquisizione. I segnali provenienti dai preamplificatori vengono registrati su un sistema Mac Lab eight ad.Prima di iniziare l'isolamento del tessuto, il bagno per tessuti deve essere riempito con PSS normale e l'ingresso dell'aria deve essere regolato per ottenere un lieve flusso di ossigeno. Inoltre, calibrare i trasduttori di forza applicando pesi noti ai cavi del trasduttore di forza e calibrare il software di acquisizione di conseguenza.Sacrificare topi di almeno due mesi di età perché le trachee più piccole dei topi più giovani sono più difficili da dissezionare e montare. Abbiamo osservato che un sedativo comunemente usato nei topi ha un forte effetto rilassante sui muscoli lisci delle vie aeree superiori e quindi non dovrebbe essere utilizzato negli studi sulla contrazione tracheale. Dopo aver isolato la trachea, posizionare la trachea isolata in una piastra rivestita con soluzione PSS ossigenata e fredda con ghiaccio.Fissare la trachea alla piastra sotto la biforcazione e sopra la faringe sotto un microscopio stereoscopico. Rimuovere i tessuti circostanti con pinzette. Tenere la trachea alla faringe o sotto la biforcazione, ma non applicare mai direttamente la pinzetta sulla trachea stessa.In modo analogo, quando si asportano i tessuti, effettuare tagli solo in senso parallelo alla trachea dopo aver rimosso i tessuti circostanti. Tagliare la trachea perpendicolarmente al di sotto della faringe e al di sopra della biforcazione bronchiale. A questo punto, la trachea può essere montata sul dispositivo.Il montaggio della trachea deve essere eseguito il più rapidamente possibile per minimizzare il tempo durante il quale la trachea viene tenuta fuori dalla PSS; inserire con attenzione ma rapidamente la trachea sui due spinotti metallici a forma di L. Quindi sollevare rapidamente il bagno tissutale per immergere la trachea nella PSS calda. Ora che la trachea è nuovamente nella PSS, regolare lentamente il micrometro per ottenere una tensione passiva di circa cinque-dieci millinewton o mezzo-uno grammo di forza.Questa è la tensione di riposo ottimale per i successivi cinque-dieci minuti. La tensione diminuirà, quindi continuare ad apportare regolazioni per mantenere la tensione desiderata fino a quando non si sarà stabilizzata. Una volta stabile, lasciare che la trachea raggiunga l'equilibrio per almeno un'ora prima di indurre sperimentalmente le contrazioni.Dopo l'equilibrazione, le contrazioni possono essere indotte mediante potassio, stimolazione elettrica transmurale o farmaci di interesse. Per utilizzare la stimolazione con potassio, sottoporre la trachea a una soluzione PSS con elevata concentrazione di potassio. In genere, dopo cinque-dieci minuti, le contrazioni raggiungono uno stato stazionario; a questo punto, risciacquare il bagno più volte con PSS normale per rilassare completamente la trachea.Quindi continuare a passare nuovamente alla soluzione PSS con elevato contenuto di potassio. Di solito non sono necessarie più di tre bagnature per ottenere contrazioni riproducibili. La stimolazione elettrica del campo viene applicata mediante piastre di platino posizionate ai lati della trachea.La risposta contrattile è influenzata dall'area degli elettrodi e dalla distanza tra di essi. A causa delle caratteristiche di potenza dello stimolatore, le uscite di corrente raggiungono un massimo a tensioni più elevate. Una risposta vicina al massimo può essere ottenuta utilizzando impulsi di 0,5 millisecondi o tensioni di 44 volt erogate a intervalli di 30 hertz.Tuttavia, ciò varierà tra i diversi sistemi e deve essere determinato empiricamente. Il sistema permette inoltre di misurare la risposta della trachea a un farmaco somministrato esogenamente attraverso di esso. È possibile valutare la soluzione del bagno, singole dosi di un farmaco o aggiunte multiple di un farmaco in modo cumulativo.Ad esempio, il carbacolo può essere utilizzato per attivare i recettori colinergici. A differenza dell'acetilcolina, non viene degradato dall'acetilcolinesterasi e produce una risposta più stabile. L'adattamento dei risultati a una curva di risposta logaritmica mediante un'equazione di tipo Hill consente di stimare la concentrazione efficace massima dimezzata o C 50.Un preparato tracheale è stato stimolato con una soluzione contenente una concentrazione elevata di potassio. La contrazione ha raggiunto il massimo in circa 10 minuti. Durante il primo lavaggio per rimuovere il potassio elevato, il muscolo ha mostrato un aumento transitorio della contrazione dovuto a una diminuzione della temperatura.Considerando il piccolo volume della soluzione PSS non riscaldata. Nelle linee della soluzione, si è effettuata una perfusione transitoria della preparazione. Successivamente, due trachee con massa muscolare diversa sono state sottoposte a stimolazione con potassio ad alta concentrazione e carbacolo.Sebbene le contrazioni indotte da stimolazione colinergica fossero diverse, divennero simili dopo la normalizzazione rispetto alla risposta ottenuta con soluzione di elevata concentrazione di potassio. Successivamente, il carbacolo è stato utilizzato per indurre contrazioni mediante dosi singole e incrementi cumulativi. Le soluzioni di OL sono state aggiunte direttamente al bagno.È opportuno notare che l'aggiunta di una singola dose ha prodotto una risposta leggermente maggiore rispetto alla concentrazione equivalente durante una risposta dose-cumulativa. Riportando graficamente la forza contrattile in funzione delle concentrazioni di carbacolo si è osservato che gli effetti del carbacolo si saturano a 10 alla meno cinque moli. I trachei sono stati sottoposti a stimolazione elettrica field (EFS) mediante impulsi di 0,5 millisecondi e 40 volt fino al raggiungimento di un plateau delle contrazioni. Un aumento della frequenza di stimolazione ha determinato un incremento della risposta contrattile.Questo potrebbe essere dovuto al fatto che si è dimostrato che la stimolazione elettrica field (EFS) provoca contrazioni principalmente attivando i nervi presinaptici. Ad esempio, la tossina botulinica blocca la maggior parte delle contrazioni indotte dall'EFS nella trachea. Inoltre, la tetrodotossina inibisce l'attività nervosa ed elimina la risposta della trachea all'EFS.Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in circa un'ora e mezza se effettuata correttamente. Tuttavia, le trachee rimangono vitali nell'organo bus per molte ore negli esperimenti log. Non necessario.

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