Name: Il saggio neuroblasti: un test per la generazione e arricchimento delle cellule progenitrici neuronali di differenziare i Progeny cellule staminali neurali in citometria a flusso (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 40 s
Description: Scopri il saggio neuroblasti per generare e purificare progenitori neuronali da cellule staminali neurali mediante citometria a flusso. Questo metodo consente di isolare popolazioni cellulari immature per studi neuroscientifici avanzati.

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Questo lavoro è stato sostenuto da un finanziamento della Fondazione Overstreet.

1. Impostazione di base prima di procedere alla coltura cellulare <ol><li> NeuroCult Media NSC basale e NeuroCult NSC supplementi proliferazione vengono miscelati con un rapporto 9:1, rispettivamente, per rendere completo supporto NSC. </li><li> A 37 ° C bagno di acqua viene utilizzata per riscaldare il mezzo. </li><li> Giusta quantità di calore inattivato siero fetale bovino (FCS) è stato scongelato. </li><li> Quantità appropriata di soluzioni crescita fotografici fattore compreso il fattore di crescita epidermico (EGF a 10 pg / ml), fattore di crescita fibroblastico (FGF-B a 10 pg / ml) e 0,2% soluzione di eparina in salina tamponata con fosfato (PBS) vengono scongelate. </li><li> Fiaschi coltura tissutale (T25, T75 e T175 o) sono necessari per l&#39;espansione e la differenziazione NSC. </li><li> Colture di tessuti trattati 96 e 24 pozzetti e vetrini sono necessari per la placcatura cellule ordinati. </li></ol> 2. Isolamento ed espansione (Passaging) di NSCs <ol><li> Staminali neurali e cellule progenitrici sono isolate ed espanse da mouse bpioggia come descritto in protocolli separati 1, 2 3. </li><li> Quando il neurosfere (neurosfere sia primarie o diversi passaggi) sono pronti per subcoltura (150-200 micron di diametro), le sfere terreno contenente viene trasferita ad un tubo di tessuto appropriato sterile cultura dimensioni, e centrifugate a 800 rpm (110 g) per 5 min a temperatura ambiente. </li><li> Il mezzo supernatante viene rimosso e le sfere vengono risospese in 1 ml di pre-riscaldato 0,05% tripsina-EDTA. </li><li> Dopo incubazione a 37 ° bagnomaria C per 2-3 min, un volume uguale di inibitore della tripsina di soia viene aggiunta alla sospensione cellulare per interrompere l&#39;attività tripsina. </li><li> Per assicurare che la tripsina è stato completamente inattivato, la sospensione cellulare viene delicatamente pipettano su e giù 3-5 volte. </li><li> Dopo centrifugazione a 800 rpm (110 g) per 5 minuti, il surnatante viene rimosso e le cellule vengono risospese in 1 ml di mezzo completo NSC. </li><li> 10 pl di sospensione cellulare viene miscelata con 90 pl di trypan blu per eseguire un numero di celle. Nota: Altri diluizioni cellulari idonee possono anche essere utilizzati. </li><li> Le cellule vengono poi usati per subcultura 1, 2 o per differenziazione come descritto di seguito. </li></ol> 3. Differenziazione delle staminali neurali e cellule progenitrici, il saggio neuroblasti (NBA) <ol><li> Le cellule risultanti da neurosfere dissociate sono piastrate ad una concentrazione di 2-3 x 10 5 cellule / ml in mezzo completo NSC supplementato con 20 ng / ml EGF, 10 ng / ml bFGF, 1 pl / ml di eparina 0,2% e il 5% FCS inattivato al calore in un pallone di coltura tissutale appropriate dimensioni. 5 ml di mezzo è utilizzato per T25, T75 per 20 ml e 40 ml per T175 palloni. Nota: FCS causerà le cellule per fissare saldamente al substrato e non è necessario per il rivestimento dei cilindri per la cultura NBA. </li><li> Cultoure beute vengono poi incubate a 37 ° C incubatore umidificato con 5% CO 2 per 3-4 giorni. Questo periodo viene chiamata fase di proliferazione, durante la quale progenie NSC collegare al substrato e proliferare come un monostrato di cellule. </li><li> Quando la coltura diventa 90-95% confluenti, il mezzo di ciascun pallone viene commutato al mezzo completo NSC supplementato con 5% FCS in assenza di fattori di crescita. </li><li> Beute di coltura sono nuovamente incubate a 37 ° C incubatore umidificato con 5% CO 2 per altri 3-4 giorni. Questo periodo è chiamato stadio di differenziazione, durante la quale progenitori neuronali appaiono in cima ad un monostrato astrociti proliferano e per rendere colonie di cellule neuronali immature. Il giorno 4-5 della fase di differenziazione, la coltura è pronta per l&#39;isolamento delle cellule neuroblasti citometria di flusso tecnologia. </li></ol> 4. Preparazione celle per citometria a flusso Trypsinizazione <ol><li> La cultura di differenziare progenie NSC giorno 4-5 della fase di differenziazione viene lavata una volta con una quantità appropriata di PBS (2 ml per T25, T75 per 4 ml e 8 ml per T175 pallone) per rimuovere FCS dalla coltura. Nota: FCS blocchi tripsina-EDTA attività. </li><li> Poi, una quantità sufficiente di pre-riscaldato 0,05% tripsina-EDTA (2 ml per T25, T75 per 4 ml e 8 ml per T175 pallone) viene aggiunto a ciascun pallone a coprire il monostrato di cellule e incubate per 1-2 min in uno 37 ° C incubatore umidificato. </li><li> Il pallone viene controllato al microscopio per valutare l&#39;effetto di Tripsina-EDTA sulla cultura. Il pallone viene tenuto con una mano e colpito saldamente con l&#39;altra mano per rimuovere le cellule dal fondo del pallone. </li><li> Volume uguale di inibitore di tripsina di soia viene aggiunta al pallone per estinguere attività tripsina. La sospensione cellulare viene delicatamente pipettano su e giù da garantire l&#39;inattivazione tripsina e per realizzare una cella singola omogeneasospensione. Nota: In alternativa, media supplementato con 5% FCS potrebbe essere utilizzata per estinguere attività tripsina. </li><li> Per rimuovere non dissociati ciuffi, la sospensione cellulare viene fatto passare attraverso un 40-pm di dimensione filtro a maglie. </li><li> La sospensione cellulare viene quindi centrifugata a 800 rpm (110g) per 5 minuti, il surnatante viene rimosso e le cellule vengono risospese in un volume adeguato di mezzo completo NSC. </li><li> Il volume finale della sospensione cellulare è regolata in modo che la densità cellulare non supera 2-3x10 6 -cells/ml. Ad alta densità cellulare potrebbe causare il blocco flusso nella macchina citometria a flusso. </li><li> Se si desidera isolare le cellule neuronali solo in base alle loro proprietà fisiche, ora si può procedere alla FACS smistamento come descritto nella parte 4. </li><li> Prima di smistamento, ioduro di propidio (PI, Sigma, 500 mg / ml in PBS) è aggiunto ad una concentrazione di 1 pl / ml di sospensione cellulare per escludere cellule morte. </li></ol> Vivi cell immunomarcatura Per ottenere una purezza più elevata di cellule neuronali, raccolte singola cellula dalla cultura NBA può essere colorato per PSA-NCAM (un indicatore dei primi progenitori neuronali immature) e poi le cellule positive da parte della popolazione neuronale può essere isolato utilizzando la macchina FACS. <ol><li> Dopo aver eseguito un conteggio delle cellule, la sospensione singola cellula dalla cultura NBA è diviso in quattro gruppi: <ul><li> Le cellule di gruppo, serve solo come controllo per regolare i parametri e cancelli (0,5-1 x 10 6 celle). </li><li> Cellule più PI, serve come controllo per regolare i parametri e cancelli (0,5-10 x 10 6 celle). Cellule PI negativi di questo gruppo possono essere ordinati in base alle caratteristiche fisiche cellule. </li><li> Secondario solo (Isotype gruppo di controllo) che serve anche come controllo per regolare i parametri e cancelli (1-2 x 10 6 cellule). </li><li> Immunomarcatura gruppo (8-10 x 10 6 cellule) che si è macchiato per PSA-NCAM per raggiungereulteriore purificazione delle cellule neuronali immature. Per escludere le cellule morte su ordinamento, PI viene aggiunto a questo gruppo pure. </li></ul></li><li> Per avviare immunomarcatura, le cellule vengono centrifugate a 800 rpm (110 g) per 5 min. Il supernatante viene rimosso e le cellule vengono risospese in 100 pl di mezzo completo NSC. </li><li> Ficoeritrina (PE) coniugato anti-PSA-NCAM anticorpo viene aggiunto ad un rapporto di 10 microlitri / 5-10 x 10 6 cellule alla sospensione cellulare per essere colorati per PSA-NCAM. Allo stesso modo, un PE coniugato anticorpo IgG1 controllo isotipico viene aggiunto alla sospensione cellulare isotipo di controllo. Seguire le istruzioni sul foglio delle specifiche di anticorpi quanto riguarda la concentrazione di anticorpi da utilizzare. La sospensione cellulare viene quindi miscelata delicatamente e incubate a temperatura ambiente per 10-15 minuti in scuro. </li><li> Le sospensioni cellulari (PSA-NCAM e tubi controllo isotipico) vengono quindi centrifugati a 800 rpm (110 g) per 5 minuti, il surnatante viene rimosso e le cellule sono ri-suspended in 1 ml di mezzo completo NSC. </li><li> Per rimuovere l&#39;eccesso non-limitati anticorpi dai campioni, 4 step è ripetuto 2-3 volte. </li><li> Dopo re-sospensione cellule in un volume adeguato di mezzo, ioduro di propidio (PI, Sigma, 500 mg / ml in PBS) è aggiunto ad una concentrazione di 1 pl / ml delle sospensioni di cellule (cellule più PI, isotipo di controllo e PSA- NCAM macchiate campioni) per escludere cellule morte quando analizzate mediante citometria di flusso. </li><li> 15 ml provette sterili falcon contenenti 1 ml di terreno completo sono pronti a raccogliere le cellule ordinati provenienti da diverse popolazioni cellulari. </li></ol> 5. Fluorescence-activated cell sorting (FACS) di neuroni immaturi <ol><li> La macchina FACS è impostato in base al suo manuale d&#39;istruzioni tramite il tecnico esperto di citometria a flusso struttura. </li><li> Soluzione salina tamponata (PBS) o qualsiasi altra soluzione appropriata depending su istruzioni del produttore, potrebbe essere utilizzato come fluido di guaina a 28 PSI mediante un ugello 90 micron. </li><li> Pressione differenziale sul sistema sia regolato in modo che il tasso di innesco tipo non superi i 2500 eventi al secondo. </li><li> La sospensione cellulare dalle cellule gruppo solo viene eseguito attraverso la macchina FACS. </li><li> In primo luogo, le cellule (eventi) vengono riportati in base alla loro dimensione (Forward Scatter (FSC), luce) rispetto complessità interna (Side Scatter (SSC), luce) per distinguere diverse popolazioni cellulari. Per fare ciò, i parametri di tensione per FSC e SSC deve essere regolato in modo che le cellule possono essere visti nella trama citometria a flusso. </li><li> Per escludere ciuffi e farsetti cellule, le cellule vengono prima tracciate sulla base dell&#39;area dispersione in avanti (FSC-A) rispetto a larghezza d&#39;impulso scatter avanti (FSC-W) e la popolazione singola cellula è controllato come popolazione 1 (P1). Quindi le cellule P1 sono riportati sulla base di zona laterale scatter (SSC-A) rispetto scatter ampiezza di lato impulso (FSC-W) e questa volta le singole cellule sono gated in quanto popolazione 2 (P2). Avendo stabilito questi due porte consecutive, grumi o doppietti (FSC di alta larghezza di impulso e di alta SSC larghezza d&#39;impulso) sono stati esclusi. </li><li> Per escludere le cellule morte o danneggiate, le singole cellule (P2) sono tracciate sulla base di reattività rispetto PI FSC-A e la popolazione singola cellula dal vivo è recintato. </li><li> Singole cellule vive sono riportati sulla base di FSC rispetto SSC per distinguere diverse popolazioni cellulari in base alle dimensioni delle cellule e la granularità interna. In questa fase due popolazioni cellulari principali sono gated come FSC basso SSC bassa (P3) e FSC elevata SSC alta (P4) popolazioni cellulari. </li><li> Per ordinare PSA-NCAM cellule immature immuno-reattivi neuronali dalla bassa popolazione FSC SSC basso, il primo FSC popolazione a basso SSC basso da cellule di controllo (oltre a PI e isotipo di controllo) i gruppi è tracciata sulla base di immunoreattività PE rispetto FSC-A e il negativo cellule sono gated (P5), e poi le cellule positive da PSA-NCAMgruppo macchiato sono gated come popolazione 6 (P6). </li><li> Dopo aver regolato tutte le porte necessarie, le cellule di interesse vengono ordinati in 15 tubi di tessuto ml sterili contenenti 1 ml di coltura media NSC. </li><li> Ordinati cellule vengono quindi centrifugate a 1200 rpm (240 g) per 5 min. </li><li> Il supernatante viene scartato ed il pellet viene risospeso in un volume adeguato di mezzo (a seconda della dimensione pellet) e un conteggio delle cellule viene effettuato. </li><li> Le cellule vengono quindi piastrate in Poly-L-ornitina rivestite piastre da 96 pozzetti ad una densità di 20-30 x 10 3 cellule / pozzetto in 200-250 microlitri di terreno completo NSC con 5% FCS e 20 ng / ml umana ricombinante BMP4 5 . </li></ol> Nota: a mantello 96 pozzetti, 100 pl di soluzione di poli-L-ornitina lavoro (1,5 ml Poly-O e 8,5 ml di PBS sterile) viene aggiunto a ciascun pozzetto e la piastra viene incubata a 37 ° C incubatore per almeno un ore. Quindi, il Poly-O viene rimosso e ciascun pozzetto viene lavato tre volte con PBS sterile(Lasciare il PBS rimanere nel bene per 10 minuti ogni volta). Usare 500 pl di Poly-L-ornitina lavoro soluzione / se ben 24-pozzetti vengono utilizzati. <ol start="14"><li> Le cellule vengono poi fissati a tempi diversi dopo ditta utilizzando freddo paraformaldeide al 4% e immunomacchiate appropriati marcatori di cellule neuronali e gliali per valutare il fenotipo di cellule selezionate provenienti da diverse popolazioni cellulari. </li></ol> 6. Risultati rappresentativi Nella cultura neuroblasti differenziazione saggio (NBA), cellule placcati collegare al substrato coltura tissutale e crescere come monostrato. A seconda della densità iniziale placcatura delle cellule, la cultura si trasformerà in una cultura del 90-95% confluenti dopo 3-4 giorni. In questa fase, un monostrato di cellule principalmente astrocitari possono essere visualizzate sotto con piccole cellule progenitrici neuronali rotonde sopra 4,5 (Figura 1). Dopo il passaggio del mezzo su un supporto fattore di crescita libera, le cellule progenitrici neuronali iniziaredividono rapidamente e generare gruppi di cellule immature neuroblasti sopra del monostrato astrociti in 4-5 giorni (Figura 2). Analisi di citometria di flusso del dissociato cultura NBA il giorno 4-5 stadio di differenziazione, mostra due principali popolazioni cellulari; FSC SSC bassa bassa e FSC di alta SSC alto in base alle dimensioni delle cellule (FSC) e la granularità interna (SSC) (Figura 3). Immuno-fluorescente analisi delle celle ordinate indica che le cellule neuronali sono situate principalmente nelle basse FSC popolazioni SSC basso (con più del 75% della loro espressione β-tubulina III), mentre cellule selezionate dalla popolazione FSC alta SSC alta sono prevalentemente astrociti GFAP immunoreattive (Figura 4). Ulteriore purificazione delle cellule neuronali immature fino a quasi omogeneità (97%) potrebbe essere raggiunto con la selezione positiva del PSA-NCAM cellule IR da parte della popolazione FSC bassa SSC basso (Figura3, 4). Arricchito cellule neuronali generati dalle NSCs isolati da topo E14 eminenze gangliari acquisire un fenotipo GABAergico ed esprimere DARPP-32, un marker di neuroni spinosi medi, sulla differenziazione (Figura 5). <img src="/files/ftp_upload/3712/3712fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Test cultura neuroblasti dalla E14 cellule staminali neuronali di topo il giorno 4 della fase di proliferazione. Questa cultura monostrato costituito da celle piatte astrocitari (punte di freccia) sotto e rotonde cellule progenitrici neuronali (frecce) sulla parte superiore. Original ingrandimento; 20 x. <img src="/files/ftp_upload/3712/3712fig2.jpg" alt="Figura 2"/> . Figura 2 test cultura neuroblasti dalla E14 cellule staminali neuronali di topo il giorno 4 dello stadio di differenziazione: A) contrasto di fase, B) colorazione immunofluorescenza. Si noti il cluster di cellule neuronali immature (frecce in A </strong&gt; e β tubulina III colorazione in B) sulla parte superiore del monostrato astrociti (punte di freccia in A, colorazione GFAP in B). Original ingrandimento; 20 x. <img src="/files/ftp_upload/3712/3712fig3.jpg" alt="Figura 3"/> . Figura 3 appezzamenti di ordinamento rappresentativi: A). FSC vs SSC sorta plot prima esclusione di doppiette e cellule morte. B, C). Appezzamenti di ordinamento per l&#39;esclusione di doppietti a base di FSC e SSC larghezza d&#39;impulso. D). Esclusione delle cellule morte e danneggiate sulla base di immunoreattività ioduro di propidio. E). FSC vs SSC complotto dopo l&#39;esclusione di doppietti e cellule morte, che mostra i due principali popolazioni etichettati come la bassa FSC SSC bassa e gli alti FSC popolazioni SSC elevate. F, G). Appezzamenti Ordina per isolare PSA-NCAM cellule immature IR dal FSC di popolazione SSC basso. Micrografie rappresentativi Figura 4. A partire da cellule ordinati da diverse popolazioni un giorno dopo la placcatura. A) FSC bassa popolazione SSC bassa (più del 75% di queste cellule sono i neuroni). B) FSC di popolazione SSC alto (la maggior parte di queste cellule sono astrociti ). C) PSA-NCAM + cellule ordinati dalla popolazione FSC SSC bassa bassa (quasi tutte le celle sono ordinati neuroni). Ingrandimento originale, 20 x. <img src="/files/ftp_upload/3712/3712fig5.jpg" alt="Figura 5"/> Figura 5. Ordinati neuroni immaturi differenziarsi in neuroni GABAergici (A) ed espressi DARPP-32 (B), un marker per medie neuroni spinosi.

<ol><li>Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Expansion+of+the+Adult+Mouse+Neural+Stem+Cells+Using+the+Neurosphere+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay.</a> J. Vis. Exp. (45), e2393(2010).</li>
<li>Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M., Ansari, S., Reynolds, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+Embryonic+Mouse+Neural+Stem+Cell+Culture+Using+the+Neurosphere+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay.</a> J. Vis. Exp. (47), e2457(2011).</li>
<li>Siebzehnrubl, F. A., Vedam-Mai, V., Azari, H., Reynolds, B. A., Deleyrolle, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Characterization+of+Adult+Neural+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and Characterization of Adult Neural Stem Cells.</a> Methods. Mol. Biol. 750, 61-77 (2011).</li>
<li>Scheffler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+and+functional+characterization+of+adult+brain+neuropoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Phenotypic and functional characterization of adult brain neuropoiesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 9353-9358 (2005).</li>
<li>Azari, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+immature+neuronal+cells+from+neural+stem+cell+progeny%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Purification of immature neuronal cells from neural stem cell progeny.</a> PLoS One. 6, e20941-e20941 (2011).</li>
<li>Amariglio, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor-Derived+Brain+Tumor+Following+Neural+Stem+Cell+Transplantation+in+an+Ataxia+Telangiectasia+Patient%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+Medicine%22%5BJournal%5D)">Donor-Derived Brain Tumor Following Neural Stem Cell Transplantation in an Ataxia Telangiectasia Patient.</a> Plos Medicine. 6, 221-231 (2009).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La capacità di isolare definite popolazioni di cellule nervose (neuroni cioè, astrociti e oligodendrociti) potrebbe risolvere alcuni degli impedimenti connessi con l&#39;applicazione clinica delle cellule staminali neurali (NSC). In primo luogo, ci permette di caratterizzare completamente la popolazione di partenza di cellule del donatore. In secondo luogo, permette di utilizzare un particolare tipo di cellula o una combinazione di tipi di cellule diversi con un rapporto specifico, a seconda della natura o stadio della ...

<table border="1"><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Tipo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Comments </td></tr><tr><td> NeuroCult NSC medio basale </td><td> Medio </td><td> Stem Cell Technologies </td><td> 05700 </td><td></td></tr><tr><td> NeuroCult NSC proliferazione Integratori </td><td> Supplemento media </td><td> Stem Cell Technologies </td><td> 05701 </td><td></td></tr><tr><td> 0,05% di tripsina-EDTA </td><td> Reagente </td><td> Gibco </td><td> 25300-062 </td><td></td></tr><tr><td> Inibitore della tripsina di soia </td><td> Reagente </td><td> Sigma </td><td> T6522 </td><td></td></tr><tr><td> Pen / Strep </td><td> Reagente </td><td> Gibco </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> * MEM </td><td> Reagente </td><td> Gibco </td><td> 41500-018 </td><td> HEM componente </td></tr><tr><td> * I HEPES </td><td> Reagente </td><td> Sigma </td><td> H4034 </td><td> HEM componente </td></tr><tr><td> * Acqua distillata </td><td> Reagente </td><td> Gibco </td><td> 15230-147 </td><td></td></tr><tr><td> Cella filtro </td><td> Setaccio </td><td> BD Falcon </td><td> 352340 </td><td></td></tr><tr><td> T25 pallone </td><td> Cultura ware </td><td> Nalge Nunc internazionale </td><td> 136196 </td><td></td></tr><tr><td> T80 pallone </td><td> Cultura ware </td><td> Nalge Nunc internazionale </td><td> 178905 </td><td></td></tr><tr><td> 15 ml provette </td><td> Cultura ware </td><td> BD Falcon </td><td> 352096 </td><td></td></tr><tr><td> 50 ml provette </td><td> Cultura ware </td><td> BD Falcon </td><td> 352070 </td><td&gt; </td></tr><tr><td> EGF </td><td> Fattore di crescita </td><td> R &amp; D </td><td> 2028-EG </td><td></td></tr><tr><td> b-FGF </td><td> Fattore di crescita </td><td> R &amp; D </td><td> 3139-FB </td><td></td></tr><tr><td> Eparina </td><td> Fattore di crescita </td><td> Sigma </td><td> H4784 </td><td> Ricostituita in PBS </td></tr><tr><td> Anti-PSA-NCAM-PE </td><td> Anticorpo </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 130-093-274 </td><td></td></tr><tr><td> PE-coniugata del mouse IgG1 </td><td> Isotype controllo dell&#39;anticorpo </td><td> BD Pharminogen </td><td> 556029 </td><td></td></tr><tr><td> Eparina </td><td> Fattore di crescita </td><td> Sigma </td><td> H4784 </td><td> Ricostituita in PBS </td></tr><tr><td> HrBMP-4 </td><td> Fattore di crescita </td><td> R &amp; D </td><td> 314-BP-010 </td><td></td></tr><tr><td> Poly-L-OrnitHine </td><td> Reagente </td><td> Sigma </td><td> P4957 </td><td></td></tr><tr><td> Di siero di vitello fetale </td><td> Supplemento media </td><td> Gibco </td><td> 10099-141 </td><td></td></tr><tr><td> GFAP </td><td> Anticorpo </td><td> DAKO </td><td> Z0334 </td><td></td></tr><tr><td> B-III tubulina </td><td> Anticorpo </td><td> Promega </td><td> G7121 </td><td></td></tr></table> * Per fare HEM, mix 1 x 10 L pacchetto di MEM e 160 ml di HEPES 1M e portare il volume a 8,75 L con acqua distillata. Impostare il pH finale di 7,4 e conservarlo a 4 ° C.

il saggio neuroblasti: un test per la generazione e arricchimento delle cellule progenitrici neuronali di differenziare i progeny cellule staminali neurali in citometria a flusso

The Neuroblast Assay: An Assay for the Generation and Enrichment of Neuronal Progenitor Cells from Differentiating Neural Stem Cell Progeny Using Flow Cytometry

Le cellule staminali neuronali (NSC) possono essere isolate ed espanse in larga scala, utilizzando il saggio neurosfere e differenziato in tre tipi principali di cellule del sistema nervoso centrale (CNS); vale a dire, astrociti, oligodendrociti e neuroni. Queste caratteristiche rendono staminali neurali e cellule progenitrici una preziosa fonte rinnovabile di cellule per studi in vitro, come lo screening di stupefacenti, neurotossicologia ed elettrofisiologia ed anche per la terapia di sostituzione cellulare in molte malattie neurologiche. In pratica, tuttavia, l&#39;eterogeneità della progenie NSC, bassa produzione di neuroni e oligodendrociti, e il predominio di astrociti seguenti differenziazione limitare le loro applicazioni cliniche. Qui, descriviamo una metodologia innovativa per la purificazione e la successiva generazione dei neuroni immaturi di topo nati da NSC con fluorescenza selezione delle cellule attivate (FACS), la tecnologia. Usando questa metodologia, altamente arricchito neuronale popolazione di cellule progenitrici può essere realizzato spiritoHout qualsiasi astrociti evidente e bona fide contaminazione NSC. La procedura prevede differenziazione di progenie NSC isolate ed espanse da E14 eminenze gangliari topo con il test neurosfere, seguito da isolamento e arricchimento delle cellule neuronali immature base alle loro proprietà fisiche (dimensioni e complessità interna) e fluorescente citometria di flusso tecnologia. Nel complesso, ci vogliono 5-7 giorni per generare neurosfere e 6-8 giorni per differenziare progenie NSC altamente purificato e isolare cellule neuronali immature.

Questo protocollo video viene illustrato un nuovo metodo per la generazione e la successiva purificazione delle cellule progenitrici neuronali da una fonte rinnovabile di cellule staminali neuronali (NSC) sulla base della loro fisico (granularità e dimensione interna) e proprietà di fluorescenza usando citometria di flusso tecnologia.

Il saggio neuroblasti: un test per la generazione e arricchimento delle cellule progenitrici neuronali di differenziare i Progeny cellule staminali neurali in citometria a flusso

Le cellule staminali neurali (NSC) possono essere isolate ed espanse su larga scala utilizzando il saggio delle neurosfere e differenziate nei tre principali tipi cellulari di...

Lo scopo di questo protocollo video è dimostrare la generazione e l'arricchimento di cellule progenitrici neuronali a partire dalla progenie di cellule staminali neurali in differenziamento, utilizzando la citometria a flusso. Questo risultato si ottiene isolando ed espandendo innanzitutto le cellule staminali neurali mediante il saggio della neurosfera. Le cellule ottenute vengono quindi differenziate attraverso un metodo in due passaggi chiamato saggio del neuroblasto.Infine, mediante citometria a flusso, è possibile identificare e separare popolazioni cellulari distinte in base alle loro proprietà fisiche e fluorescenti. In questo protocollo, presenteremo nuovi metodi sia per la differenziazione delle cellule staminali neurali, noto come saggio del neuroblasto, sia per la purificazione della progenie neurale immatura risultante mediante citometria a flusso. Il saggio del neuroblasto prevede una fase di proliferazione, della durata di circa tre-quattro giorni, e una fase di differenziazione che dura circa quattro-cinque giorni.Durante la fase di differenziazione, si forma un monostrato di cellule composto da astrociti nella parte sottostante e da aggregati di neuroni immaturi nella parte superiore. Quando la progenie delle cellule staminali neurali in differenziazione viene dissociata in singole cellule ed analizzata mediante citometria a flusso, è possibile distinguere chiaramente una netta differenza tra i progenitori neurali e le altre cellule in termini di dimensioni e complessità interna. Delimitando la popolazione di cellule di piccole dimensioni, caratterizzate da bassa diffusione della luce in avanti e laterale, si possono isolare cellule neuronali fortemente arricchite, ottenendo una popolazione cellulare neurale ancora più omogenea.La coltura cellulare dissociata da neuro-assay ematico può essere analizzata per PSA e cam, e le cellule positive possono essere selezionate e separate dalla piccola popolazione cellulare. Ora, iniziamo. Le cellule staminali neurali vengono isolate ed espanse da embrione di topo.Giorno 14 dell'eminenza gangliare utilizzando il saggio delle neurosfere, come mostrato in un protocollo video separato, disponibile all'indirizzo visualizzato sullo schermo. Assicurarsi che le sfere abbiano raggiunto un diametro compreso tra 150 e 200 micron. Raccogliere le sfere e trasferirle in un tubo sterile di dimensioni adeguate.Centrifugare il tubo a 800 giri/min o a 110 G per cinque minuti. Quindi rimuovere il soprannatante e risospendere le sferoidi in un millilitro di soluzione di tripsina EDTA preriscaldata. Incubare le cellule in un bagno d'acqua a 37 gradi per due o tre minuti.Aggiungere un volume uguale di inibitore della tripsina alle cellule e mescolare accuratamente per inibire l'attività della tripsina e ottenere una sospensione di singole cellule. Trasferire le cellule in un tubo di dimensioni più piccole e centrifugare nuovamente a 110 G per cinque minuti. Rimuovere il soprannatante e risospendere le cellule in uno-due mililitri.Mezzo completo per cellule staminali neurali. Prelevare 10 microlitri della sospensione cellulare e mescolare accuratamente con 90 microlitri di triptano blu ed eseguire un conteggio cellulare. Per preparare il mezzo di coltura per la crescita, aggiungere siero di vitello fetale fino a una concentrazione finale del 5% nel mezzo completo per cellule staminali neurali.Quindi aggiungere le cellule al mezzo di coltura per raggiungere una densità da due a 300.000 cellule per ml. Aggiungere ora EGF a una concentrazione finale di 20 nanogrammi per ml e bFGF a una concentrazione finale di 10 nanogrammi per ml. Mescolare accuratamente la sospensione cellulare per renderla omogenea e seminare 20 ml per fiasca T80.Posizionare i flaconi nell'incubatrice a 37 gradi e 5%CO2 per tre o quattro giorni. I progenitori delle cellule staminali neurali si attaccheranno al substrato e prolifereranno come un monostrato; dopo tre o quattro giorni dal primo semina, la coltura avrà raggiunto una confluenza del 90-95% ed è pronta per il cambio del mezzo con un mezzo privo di fattori di crescita per l'indifferenziazione. Preparare ora un mezzo fresco per cellule staminali neurali integrato con 5%FCS e privo di qualsiasi fattore di crescita.Rimuovere il mezzo da ogni fiala e sostituirlo con mezzo privo di fattori di crescita. Incubare le fiale per altri quattro o cinque giorni. Durante questo periodo, le cellule progenitrici neuronali si divideranno attivamente e genereranno colonie di cellule neuronali immature, che appariranno sulla superficie di un monostrato astrocitario.Per preparare le cellule per la citometria a flusso, rimuovere innanzitutto il mezzo dal matraccio al quinto giorno della fase di differenziazione. Successivamente, per rimuovere il siero fetale dal coltura, aggiungere quattro millilitri di PBS, agitare delicatamente per circa 30 secondi e rimuovere. Quindi aggiungere una quantità sufficiente di tripsina preriscaldata. Viene aggiunto EDTA al matraccio per coprire il monostrato cellulare.Posizionare il matraccio in un incubatore a 37 gradi per uno o due minuti, quindi battere il matraccio da due a tre volte per assicurare il distacco delle cellule. A questo punto viene aggiunto un volume equale di inibitori della tripsina al matraccio per neutralizzare l'attività della tripsina. La sospensione cellulare viene pipettata delicatamente su e giù per garantire l'inattivazione della tripsina e ottenere una sospensione omogenea di cellule singole.Trasferire il contenuto del pallone in un tubo di dimensioni adeguate e centrifugare a 110 G per cinque minuti. Rimuovere il soprannatante, quindi risospendere le cellule in un volume appropriato di mezzo per cellule staminali neurali ed eseguire un conteggio cellulare come descritto in precedenza per le cellule singole ottenute dall'assay di neuroblasti. Le colture sono divise in quattro gruppi: cellule sole, cellule più pi, controllo isotipico e PSA in cam.Aggiungere mezzo alle cellule da sole e alle cellule più provette di PI in modo che ciascuna raggiunga un volume totale di un mil. Assicurarsi che le loro densità non superino i due-tre milioni di cellule per ml per evitare l'occlusione del flusso nella centrifuga della macchina di citometria a flusso, nel controllo isotipico e nelle provette di PSA e cam. Rimuovere il sopranatante da entrambe le provette e risospendere le cellule in 100 microlitri di mezzo completo per cellule staminali neurali.Seguendo le istruzioni del produttore, aggiungere la quantità appropriata di controllo isotipico coniugato con PE e di anticorpi anti-PSA e anti-cam coniugati con PE nei rispettivi tubi. Mescolare delicatamente i campioni e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente al buio. Centrifugare i campioni, rimuovere il sopranatante da entrambi i tubi e risospendere le cellule in un millilitro di mezzo completo per cellule staminali neurali.Ripetere questa procedura due o tre volte per rimuovere gli anticorpi non legati in eccesso dopo l'ultimo lavaggio. Risospendere ogni campione in un mil di mezzo completo. Aggiungere ioduro di propidio a una concentrazione di un microlitro per ml a ogni campione.Con l'eccezione del gruppo di cellule Alone, preparare tre provette da 15 ml con un mil di mezzo completo per cellule staminali neurali per la raccolta delle diverse popolazioni cellulari mediante citometria a flusso prima di iniziare la fluorescenza. La macchina per l'ordinamento di cellule attivate mediante fluorescenza deve essere regolata per l'allineamento del laser, i parametri di voltaggio e il corretto funzionamento da parte del tecnico esperto del laboratorio. Una volta effettuate tali regolazioni, far passare la sospensione cellulare del gruppo di cellule Alone attraverso la macchina per la citometria.Prima di tutto, gli eventi acquisiti vengono rappresentati in base alle loro proprietà di scattering in avanti e laterale per distinguere le diverse popolazioni cellulari. A tal fine, la tensione deve essere regolata in modo che gli eventi siano visibili nel grafico di citometria a flusso. A questo punto, analizzare il campione di cellule più PI per escludere aggregati e doppietti cellulari.Gli eventi vengono tracciati in base all'area dello scatteraggio in avanti rispetto alla larghezza dell'impulso dello scatteraggio in avanti e la popolazione di cellule singole viene selezionata come popolazione uno. Affinare la finestra per escludere eventi con elevata larghezza dell'impulso dello scatteraggio in avanti. Successivamente, per escludere ulteriormente aggregati e doppietti.Le cellule della popolazione uno vengono tracciate in base all'area dello scatter laterale rispetto alla larghezza dell'impulso dello scatter laterale e, questa volta, le cellule singole vengono selezionate come popolazione due. Gli eventi con elevata larghezza dell'impulso dello scatter laterale vengono esclusi per eliminare cellule morte o danneggiate. Le cellule singole della popolazione due vengono tracciate in base alla reattività al PI rispetto all'area dello scatter anteriore e viene selezionata la popolazione di cellule singole vive.Ora le singole cellule vive vengono rappresentate in un grafico in cui l'area della diffusione anterograda è riportata contro l'area della diffusione laterale. A questo stadio, vengono selezionate le popolazioni cellulari di piccole e grandi dimensioni. La popolazione di piccole dimensioni presenta bassi valori di diffusione anterograda e bassi valori di diffusione laterale, ed è denominata popolazione tre.La popolazione ampia presenta elevate proprietà di scattering anteriore ed elevato scattering laterale ed è denominata qui popolazione quattro per selezionare inizialmente le cellule positive a PSA e CAM. Le popolazioni con basso scattering anteriore e basso scattering laterale provenienti da cellule più PI e gruppi di controllo isotipico sono riportate in grafico in base all'immunoreattività PE versus area di scattering anteriore, e le cellule negative sono selezionate come popolazione cinque. Successivamente, il campione colorato per PSA e CAM viene analizzato mediante l'apparecchiatura e gli eventi positivi sono selezionati come popolazione sei.I tubi sterili per colture cellulari da 15 ml contenenti un ml di mezzo per cellule staminali neurali vengono posizionati nella macchina per raccogliere le popolazioni cellulari ordinate. Successivamente vengono selezionate e ordinate le popolazioni cellulari di interesse dopo che le cellule sono state ordinate. Tornare nell'incubatrice per colture cellulari e lavare i tubi per liberare eventuali cellule ordinate che si sono attaccate alle pareti.Quindi centrifugare i tubi a 1200 giri/min o 240 G per cinque minuti, scartare il sopranatante e risospendere le cellule in una quantità adeguata di mezzo completo per cellule staminali neurali. Successivamente, eseguire un conteggio cellulare come mostrato in precedenza per seminare le cellule. Per prima cosa, preparare una quantità sufficiente di mezzo completo per cellule staminali neurali, integrato con FCS al 5% e 20 nanogrammi per ml.BMP ricombinante umano quattro. Mescolare accuratamente il mezzo e distribuirlo in nuove provette etichettate corrispondenti alle diverse popolazioni cellulari ordinate. Aggiungere le cellule ordinate alla provetta corrispondente per raggiungere una densità di circa centomila a 150.000 cellule per ml.Ora rimuovere il mezzo dalla piastra a 96 pozzetti rivestita con polio, mescolare le sospensioni cellulari e aggiungere da 200 a 250 microlitri per pozzetto. Etichettare la piastra e collocarla nell'incubatrice a 37 gradi e 5%CO2. Questo è un esempio di coltura da saggio di neuroblasti ottenuta da cellule staminali neurali di topo E14. Al quarto giorno della fase di proliferazione, le frecce indicano le cellule astrocitiche appiattite al di sotto, mentre le frecce piene indicano le cellule progenitrici neuronali rotonde in superficie.Questo è un esempio di coltura per saggio di neuroblasti a cinque giorni dal passaggio al mezzo contenente il fattore di crescita tre. Come si può osservare, sono presenti aggregati di cellule progenitrici neuronali che crescono sulla superficie di un monolayer astrocitario. Ecco un esempio di colorazione immunofluorescente della stessa coltura.Si noti l'aggregato di cellule neuronali immature marcate per la beta tre tubulina che si trovano sopra gli astrociti esprimenti GFAP. Questo è un esempio di cellule isolate dalla popolazione con bassa diffusione anterograda e bassa diffusione laterale, nella quale la maggior parte esprime il marcatore dei precursori neuronali beta tre tubulina. Queste sono cellule isolate dalla popolazione con elevata diffusione anterograda ed elevata diffusione laterale, nella quale la maggior parte sono astrociti esprimenti la proteina acida fibrillare gliale.Queste sono le cellule ordinate positive per PSA e CAM, provenienti dalla popolazione con bassa dispersione laterale e bassa dispersione in avanti, e quasi tutte sono cellule progenitrici neuronali che esprimono la beta-tubulina III, in grado di sopravvivere in coltura e maturare in neuroni GABAergici esprimenti DAX1 con medi spini. Vi abbiamo appena mostrato come generare e purificare cellule normali immature a partire dalla progenie di cellule staminali neurali in differenziamento, al fine di ottenere una coltura di assaggio di neurotossicità di alta qualità; raccomandiamo di non lasciare crescere troppo le sfere. Le sfere di grandi dimensioni sono associate a un maggior numero di morti cellulari e a una ridotta capacità neurogenica.Non trattare le sfere con tripsina per più di due o tre minuti, poiché la tripsina danneggia le cellule e riduce la loro capacità neurogenica. Inoltre, evitare che lo strato perforante diventi troppo confluenziale. Ciò potrebbe interferire con il normale processo di differenziazione; pertanto, è sempre consigliabile cambiare il mezzo quando la coltura raggiunge circa il 90% di confluenza. Quando si utilizza la citometria in flusso, si raccomanda vivamente di aggiungere antibiotici al mezzo per prevenire contaminazioni.Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

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