Rilevamento di aspergillosi polmonare in pazienti con neoplasie ematologiche maligne utilizzando la tecnologia a flusso laterale

L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare l'uso di un dispositivo a flusso laterale per la rilevazione rapida dell'antigene diagnostico di aspergillus in sieri umani e fluidi BAL. Questo viene ottenuto applicando innanzitutto il campione di siero o BAL alla porta di rilascio del dispositivo a flusso laterale. Il secondo passaggio consiste nel permettere alla soluzione di migrare lungo la membrana.

Il passaggio successivo consiste nel determinare se il test è valido esaminando la linea di controllo interna. L'ultimo passaggio consiste nell'interpretare il risultato del test esaminando la linea di test. In definitiva, il dispositivo a flusso laterale viene utilizzato per rilevare la presenza dell'antigene diagnostico di Aspergillus nei fluidi sierici o nel lavaggio broncoalveolare (BAL).

Il test LFD per Aspergillus può essere utilizzato come test complementare per la diagnosi di aspergillosi polmonare invasiva. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come il saggio immunoenzimatico per galattomanna di Aspergillus, il saggio per beta-glucano e il test PCR per Aspergillus, è che si tratta di un test diagnostico rapido effettuabile al letto del paziente, che richiede strutture di laboratorio minime e una formazione limitata. Sebbene il LFD sia stato sviluppato per la rilevazione di specie di Aspergillus, la tecnologia a flusso laterale può essere applicata anche alla rilevazione di altri agenti patogeni infettivi, come specie di Cetosporium, Fusarium e Riser.

Incorporando anticorpi monoclonali specifici per questi organismi, la dimostrazione visiva di questo metodo risulta fondamentale. Poiché l'interpretazione dei risultati del test immunocromatografico richiede familiarità con il formato del saggio, per raccogliere il siero da campioni di sangue non trattati, lasciare coagulare il sangue a quattro gradi Celsius. Il siero e i fluidi di lavaggio broncoalveolare, o BAL, devono essere conservati in aliquote a meno 20 gradi Celsius prima dell'uso; la conservazione in aliquote limita il potenziale degrado dell'antigene bersaglio dovuto al congelamento e scongelamento ripetuto dei campioni durante test ripetuti. Per preparare i campioni di siero e BAL da sottoporre a test, scongelare i campioni a temperatura ambiente, quindi mantenerli sul ghiaccio. Mescolare accuratamente mediante vortex e centrifugare per un minuto a 14.000 RPM. Per l'analisi di routine di campioni umani, diluire il siero uno a uno con mezzo di coltura tissutale; in alternativa, per dissociare l'antigene bersaglio dai complessi immunitari sierici, diluire il siero uno a due con PBS contenente EDTA al 4%, riscaldare per tre minuti in un bagno di acqua bollente e centrifugare per cinque minuti a 14.000 RPM.

I fluidi BAL umani non richiedono trattamenti preliminari. Un campione di lavaggio broncoalveolare scongelato, agitato con vortice e centrifugato è un campione pronto che può essere applicato direttamente al dispositivo di analisi in flusso laterale. Per i test, i dispositivi di analisi in flusso laterale (LFD) vengono conservati a temperatura ambiente o a 23 gradi Celsius, condizioni alle quali rimangono stabili per 12 mesi.

Per iniziare il saggio, rimuovere i dispositivi dalle loro confezioni e posizionarli su una superficie piana. Utilizzando una punta di pipetta sterile, applicare 100 microlitri di siero pretrattato nel porto di rilascio del dispositivo entro pochi secondi. Il liquido dovrebbe migrare per azione capillare lungo la membrana di cellulosa nitrata nella finestra di osservazione.

Nello stesso modo, applicare 100 microlitri di un campione di BAL non diluito alla porta di rilascio del dispositivo. Lasciare procedere il saggio per 15 minuti a temperatura ambiente, momento in cui i risultati del test devono essere registrati. Il test non deve essere lasciato per più di 15 minuti prima della registrazione dei risultati.

Un'eventuale prolungamento del periodo di incubazione non potenzierà una reazione settimanale, poiché ciò potrebbe introdurre un bias nell'interpretazione dei risultati. Il LFD è dotato di una linea di controllo interno indicata dalla lettera C sulla custodia in plastica e di una linea di test indicata dalla lettera T. La linea di controllo deve sempre apparire, indipendentemente dalla presenza dell'antigene aspergillo nel siero o nel campione di lavaggio broncoalveolare (BAL). Ciò indica che il saggio è stato eseguito correttamente qualora l'antigene aspergillo sia presente nel siero o nel campione di BAL.

La linea di test apparirà anche entro 15 minuti dall'applicazione del campione. Le intensità delle reazioni di test per la malattia di Lyme sono proporzionali alle concentrazioni dell'antigene bersaglio nei campioni di siero e VAL. L'aspetto più complesso di questa procedura è l'interpretazione dei risultati del test.

I risultati del test LFD devono essere letti dopo 15 minuti e il risultato del test deve essere confrontato con l'esempio rappresentativo mostrato qui. In questa figura sono mostrati esempi rappresentativi di risultati LFD deboli positivi, moderatamente positivi e fortemente positivi con campioni di lavaggio broncoalveolare (BAL) e siero. Qualsiasi linea di test positiva nel campione di siero, indipendentemente dall'intensità, indicherebbe aspergillosi polmonare invasiva o malattia IPA dovuta alla presenza di antigene di Aspergillus in circolo nel torrente ematico. Reazioni positive nel BAL, indipendentemente dall'intensità, indicherebbero germinazione delle spore e sviluppo di ife potenzialmente patogene nei polmoni.

In assenza di antigene aspergillo, non apparirà alcuna linea di test e il risultato viene registrato come negativo. Questa tabella mostra i risultati dei test LFD effettuati utilizzando fluidi BAL provenienti da pazienti affetti da leucemia mieloide acuta o da pazienti con ML, diagnosticati secondo i criteri diagnostici del gruppo di studio dell'Organizzazione Europea per la Ricerca e la Terapia del Cancro e dell'Istituto Nazionale per le Allergie e le Malattie Infettive. Nella tabella sono inclusi i corrispondenti dati clinici e psicologici, nonché i risultati di un test PCR specifico per ASPERIA per ciascun paziente.

Secondo le linee guida E-O-R-T-C-M-S-G del 2002, ai pazienti 12, 13 e 16 è stata diagnosticata un'IPA possibile sulla base di fattori ospite e criteri clinici oppure della positività al GM. Secondo le linee guida E-O-R-T-C-M-S-G riviste del 2008, i soli fattori ospite e la positività al GM oppure i soli fattori ospite e criteri clinici non indicherebbero un'infezione fungina invasiva possibile, a meno che non siano accompagnati da evidenze di supporto provenienti rispettivamente dai dati clinici e dalla micologia. Al paziente sei è stata diagnosticata un'IPA probabile secondo entrambe le linee guida del 2002 e del 2008 a causa di fattori ospite, caratteristiche cliniche maggiori e minori e positività al GM.

Infine, si noti che, sebbene attualmente né il saggio LFD né il saggio PCR siano inclusi nelle linee guida E-O-R-T-C-M-S-G nei campioni di BAL dei pazienti sei e dodici, esiste un forte accordo tra i due saggi e il test commerciale per il gala manin, che indica la presenza di antigene e acido nucleico di aspergillus dopo aver seguito questa procedura. Altri metodi, come il saggio enzimatico per il pella glattomannano, il panf, il test per il beta-glucano fungino o i test PCR per aspergillus, possono essere eseguiti in parallelo per confermare la malattia fungina invasiva. Non dimenticare che lavorare con siero sanguigno umano e fluidi di BAL può essere estremamente pericoloso e che gli operatori del dispositivo devono sempre essere vaccinati contro malattie come l'epatite B e la tubercolosi.I.