Name: Rilevamento di aspergillosi polmonare in pazienti con neoplasie ematologiche maligne utilizzando la tecnologia a flusso laterale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-22T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Scopri il rilevamento rapido dell'aspergillosi polmonare invasiva utilizzando un dispositivo a flusso laterale per campioni di siero e BAL. Questo metodo offre una diagnosi in 15 minuti per pazienti con neoplasie ematologiche.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Finanziamento al Dott. Thornton dalla Pfizer Limited è riconosciuto con gratitudine.

1. Raccolta, conservazione e preparazione dei liquidi di lavaggio broncoalveolare di siero e <ol><li> Raccogliere siero da campioni di sangue non trattati consentendo coagulazione a 4 ° C, e siero negozio come aliquote a -20 ° C prima dell&#39;uso. Liquidi di lavaggio broncoalveolare (BAL) dovrebbero essere memorizzati come aliquote a -20 ° C. Nota: Stoccaggio di siero e BAL come aliquote limita il potenziale di degradazione della antigene bersaglio da ripetuti di congelamento-scongelamento dei campioni durante la ripetizione del test. </li><li> Scongelare i campioni e mescolare i campioni di siero e BAL accuratamente su vortex e centrifugare per 1 min a 14.000 rpm. </li><li> Per le prove di routine di campioni di siero umano, diluire il siero 1:01 (v / v) con mezzo di coltura tissutale (TCM). TCM consiste di mezzo RPMI-1640, 10% (v / v) di siero fetale bovino, 1% (v / v) di 200 mM L-glutammina soluzione, e sodio azide (0,02% w / v) come conservante. Il terreno è preparato in anticipo e può essere conservato a 4 ° C per diversi mesi. Applicare 100 microlitri della diluted il siero LFD. </li><li> Per fluidi umani BAL, e per i fluidi di BAL modelli animali, si applicano 100 microlitri di campione puro al LFD, senza alcun pre-trattamento. </li><li> Per il siero da modelli animali, diluire siero 1:2 (v / v) con soluzione salina tamponata con fosfato contenente il 4% (w / v) EDTA, calore per 3 minuti in un bagno di acqua bollente, centrifugare per 5 min a 14.000 rpm, e applicare 100 ul di surnatante pulito al dispositivo LFD. </li></ol> 2. Applicazione di siero e BAL al dispositivo a flusso laterale <ol><li> Conservare il flusso laterale dispositivi a temperatura ambiente (23 ° C). A questa temperatura, dispositivi sono stabili per 12 mesi. Rimuovere i dispositivi dalle loro tasche e posto su una superficie piana. </li><li> Utilizzando una punta di pipetta sterile, applicare 100 pl di pretrattato campione di siero o pulito BAL alla porta di uscita del dispositivo. </li><li> Lasciare il saggio a funzionare per 15 min a temperatura ambiente, momento in cui i risultati delle prove devono essere registrati. Nota: In pochi secondi il liquido sarà seen migrare per capillarità lungo la membrana di nitrocellulosa nella finestra di osservazione. </li></ol> 3. Registrazione ed interpretare i risultati LFD <ol><li> La LFD consiste di una linea di controllo interno (indicato con la lettera C sul contenitore in plastica) e una linea di test (indicata con la lettera T). La linea di controllo deve sempre apparire a prescindere di antigene Aspergillus nel campione di siero o BAL. Questo dimostra che il test è stato eseguito correttamente. </li><li> Se l&#39;antigene Aspergillus è presente nel campione di siero o BAL, la linea di test appariranno anche entro 15 minuti di applicazione del campione. Poiché l&#39;intensità della linea di test è proporzionale alla quantità di antigene presente nel campione Aspergillus, la linea di test può apparire come una debole positivo (+), un moderato positivo (+ +) o come un forte positivo (+ + +) . Tuttavia, qualsiasi linea test positivo, indipendentemente intensità, che indicano la presenza di Aspergillus antigene nel campione. In the l&#39;assenza di antigene Aspergillus, nessuna linea di test apparirà, e il risultato è registrato come negativo (-). </li></ol> 4. Risultati rappresentativi Esempi rappresentativi di negativo, debolmente positivi, moderatamente positivi risultati positivi, e forte LFD con campioni di BAL e siero sono mostrati nella Figura 1. I risultati di antigene prove positive di LFD (debole e forte) o negativi test LFD che utilizza fluidi BAL da leucemia mieloide acuta (AML) pazienti diagnosticati secondo EORTC / MSG criteri diagnostici sono riportati nella Tabella 1. Incluso in questa tabella sono i corrispondenti clinici e micologica (galattomannano e cultura) i dati ei risultati di un test specifico Aspergillus-PCR sviluppato presso Ospedale S. Bartolomeo 8, per ogni paziente. La diagnosi della malattia è basata su fattori dell&#39;ospite (neutropenia, l&#39;uso prolungato di corticosteroidi, il trattamento con altri riconosciuti cellule T immunosuppressants), i criteri clinici e positività GM per il BAL (qui definito come un valore di indice GM&gt; 0,8). Sotto i 2002 EORTC / MSG linee 10, 12 pazienti, 13 e 16 sono stati diagnosticati con IA &#39;possibile&#39; sulla base di fattori dell&#39;ospite e dei criteri clinici o positività GM. Secondo le riviste (2008) EORTC / MSG linee 2, i fattori di accoglienza e positività GM da soli o host fattori e dei criteri clinici da soli non indicherebbe l&#39;infezione &#39;possibile&#39; fungina invasiva se non accompagnati da documenti giustificativi da dati clinici e micologia, rispettivamente. Paziente 6 è stato diagnosticato un IA &#39;probabile&#39; in entrambi i 2002 e il 2008 le linee guida a causa di fattori dell&#39;ospite, le caratteristiche cliniche principali e secondarie e positività GM. Si noti che, mentre né il LFD né saggi di PCR sono attualmente inclusi nelle linee guida EORTC / MSG, esiste un accordo forte tra i due test e il test commerciale galattomannano che indicano la presenza di antigeni di Aspergillus e di acido nucleico nel campione BAL<html> s di pazienti 6 e 12. Ulteriori risultati delle prove dimostrano l&#39;efficacia dei saggi PCR LFD e nella diagnosi di IPA si possono trovare in Johnson et al 8. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3721/3721fig1.jpg" /> Figura 1. Negativo (linea di controllo solo) e positivo (linea di controllo e di prova) i risultati delle prove LFD utilizzando siero e nel BAL. Le intensità di reazioni di linea dei test sono proporzionali alle concentrazioni dell&#39;antigene bersaglio nei campioni di siero e BAL. Le reazioni in genere varia da debole (+) attraverso moderata (+ +) a forte (+ + +). Indipendentemente intensità prova linea, tutte tre le reazioni di siero positivi indicherebbe invasiva aspergillosi malattia polmonare dovuta alla presenza di antigene Aspergillus circolante nel sangue. Positive le reazioni BAL (debole, moderata o forte) sta ad indicare la germinazione delle spore e lo sviluppo di ife potenzialmente patogeni nei polmoni. pdflinebreak &quot;&gt; <table border="1"><tbody><tr><td> Paziente no. </td><td> Patient informazioni </td><td> Criteri clinici 1 </td><td> BAL cultura 2 </td><td> GM VIA indice 3 </td><td> EORTC / MSG (2002) 4 </td><td> EORTC / MSG (2008) 5 </td><td> Aspergillus PCR risultato </td><td> Risultato LFD </td></tr><tr><td> 6 </td><td> - </td><td> Principali segni CT (nodulo e halo) e una minore </td><td> Negativo </td><td> 0,9 (positivo) </td><td> Probabile </td><td> Probabile </td><td> Positivo </td><td> Debolmente positivo (+) </td></tr><tr><td> 12 </td><td> Presunto precedente infezione fungina </td><td> No major, minor uno </td><td> Candida glabrata </td><td> 6,43 (molto positive) </td><td> Possibile </td><td> Nessuno </td><td> Positivo </td><td> Strong positivo (+ + +) </td></tr><tr><td> 13 </td><td> Stafilococco coagulasi-negativiylococcus e E. coli nel sangue </td><td> No major, minor due </td><td> Negativo </td><td> 0,25 (negativo) </td><td> Possibile </td><td> Nessuno </td><td> Negativo </td><td> Negativo (-) </td></tr><tr><td> 16 </td><td> Infezioni del torace </td><td> 3 criteri minori tra nuova effusione plurale infiltrato più </td><td> Negativo </td><td> 0,16 (negativo) </td><td> Possibile </td><td> Nessuno </td><td> Negativo </td><td> Negativo (-) </td></tr></tbody></table> 1 noduli o aloni su una tomografia computerizzata di scansione è suggestivo di infezione fungina 2 Candida glabrata nel BAL verrebbe considerato come contaminante in quanto è la seconda più comune lievito isolato come parte della normale flora umani 9 3 Un indice di&gt; 0,8 nel test GM VIA del BAL è indicativa di infezione da Aspergillus 4 Sulla base dei 2002 EORTC / MSG criteri diagnostici per la &#39;possible &#39;,&#39; probabilmente &#39;o&#39; provata &#39;malattia fungina invasiva 10 5 Sulla base delle riviste (2008) EORTC / MSG criteri diagnostici per la &#39;possibile&#39;, &#39;probabile&#39; o &#39;provata&#39; la malattia fungina invasiva 2 Tabella 1. Risultati delle prove LFD di campioni di BAL da pazienti affetti da leucemia mieloide acuta con IPA probabile e dal controllo di pazienti con LMA (nessuna evidenza di infezione), e EORTC / MSG diagnosi di infezione.

<ol><li>Thornton, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+invasive+aspergillosis%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Appl.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Detection of invasive aspergillosis.</a> Adv. Appl. Microbiol. 70, 187-216 (2010).</li>
<li>De Pauw, B., Walsh, T. J., Donnelly, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revised+definitions+of+invasive+fungal+disease+from+the+European+Organization+for+Research+and+Treatment+of+Cancer%2FInvasive+Fungal+Infections+Cooperative+Group+and+the+National+Institute+of+Allergy+and+Infectious+Diseases+Mycology+Study+Group+%28EORTC%2FMSG%29+concensus+group%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Revised definitions of invasive fungal disease from the European Organization for Research and Treatment of Cancer/Invasive Fungal Infections Cooperative Group and the National Institute of Allergy and Infectious Diseases Mycology Study Group (EORTC/MSG) concensus group.</a> Clin. Infect. Dis. 46, 1813-1821 (2008).</li>
<li>Thornton, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+the+emerging+human+pathogen+Pseudallescheria+boydii+by+using+highly+specific+monoclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Vacc.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Tracking the emerging human pathogen Pseudallescheria boydii by using highly specific monoclonal antibodies.</a> Clin. Vacc. Immunol. 16, 756-764 (2009).</li>
<li>Pickering, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+%281+-%3E+3%29-%CE%B2-D-glucan+assay+for+diagnosis+of+invasive+fungal+infections%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a (1 -> 3)-β-D-glucan assay for diagnosis of invasive fungal infections.</a> J. Clin. Microbiol. 43, 5957-5962 (2005).</li>
<li>Thornton, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+immunochromatographic+lateral-flow+device+for+rapid+serodiagnosis+of+invasive+aspergillosis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Vacc.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Development of an immunochromatographic lateral-flow device for rapid serodiagnosis of invasive aspergillosis.</a> Clin. Vacc. Immunol. 15, 1095-1105 (2008).</li>
<li>Verweij, P. E., Mennink-Kersten, M. A. S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Issues+with+galactomannan+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Med.+Mycol%22%5BJournal%5D)">Issues with galactomannan testing.</a> Med. Mycol. 44, 179-183 (2006).</li>
<li>Wiederhold, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+lateral+flow+technology+and+galactomannan+and+%281+-%3E+3%29-%CE%B2-D-glucan+assays+for+detection+of+invasive+pulmonary+aspergillosis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Vacc.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Comparison of lateral flow technology and galactomannan and (1 -> 3)-β-D-glucan assays for detection of invasive pulmonary aspergillosis.</a> Clin. Vacc. Immunol. 16, 1844-1846 (2009).</li>
<li>Johnson, G. L., Bibby, D., Bustin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+Aspergillus+in+broncho-alveolar+lavage+fluid+using+two+biological+assays%3B+evidence+of+active+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Mycoses%22%5BJournal%5D)">Detection of Aspergillus in broncho-alveolar lavage fluid using two biological assays; evidence of active infection.</a> Mycoses. 54, Suppl 2. 130-131 (2011).</li>
<li>Malani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+glabrata+fungemia%3A+experience+in+a+tertiary+care+centre%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Candida glabrata fungemia: experience in a tertiary care centre.</a> Clin. Infect. Dis. 41, 975-981 (2005).</li>
<li>Ascioglu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+opportunistic+invasive+fungal+infection+in+immunocompromised+patients+with+cancer+and+hematopoietic+stem+cell+transplants%3A+an+international+concensus%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Defining opportunistic invasive fungal infection in immunocompromised patients with cancer and hematopoietic stem cell transplants: an international concensus.</a> Clin. Infect. Dis. 34, 71-74 (2002).</li>
<li>Denning, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+diagnosis+of+invasive+aspergillosis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Early diagnosis of invasive aspergillosis.</a> Lancet. 355, 423-424 (2000).</li>
<li>Greene, R., Shibuya, K., Ando, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreene%2C+R+%22Aspergillus+fumigatus+and+Aspergillosis%22">Aspergillus fumigatus and Aspergillosis</a>. Latge, J. -P., Steinbach, W. J. , ASM Press. 353-363 (2009).</li>
<li>Klont, R. R., Mennink-Kersten, M. A. S. H., Verweij, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utility+of+Aspergillus+antigen+detection+in+specimens+other+than+serum+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Utility of Aspergillus antigen detection in specimens other than serum samples.</a> Clin. Infect. Dis. 39, 1467-1474 (2004).</li>
<li>Iweala, O. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+diagnostic+tests%3A+an+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Contraception%22%5BJournal%5D)">HIV diagnostic tests: an overview.</a> Contraception. 70, 141-147 (2004).</li>
<li>Ketema, F., Zeh, C., Edelman, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+the+performance+of+a+rapid%2C+lateral+flow+assay+for+the+detection+of+antibodies+to+HIV%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Acquir.+Immune+Defic.+Syndr%22%5BJournal%5D)">Assessment of the performance of a rapid, lateral flow assay for the detection of antibodies to HIV.</a> J. Acquir. Immune Defic. Syndr. 27, 63-70 (2001).</li>
<li>Moody, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+diagnostic+tests+for+malaria+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Rapid diagnostic tests for malaria parasites.</a> Clin. Microbiol. Rev. 15, 66-78 (2002).</li>
<li>Parkash, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+of+a+lateral+flow+test+for+the+detection+of+leprosy+patients+in+India%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Performance of a lateral flow test for the detection of leprosy patients in India.</a> J. Med. Microbiol. 57, 130-132 (2008).</li>
<li>Sharma, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+lateral-flow+Clostridium+botulinum+neurotoxin+detection+kits+for+food+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of lateral-flow Clostridium botulinum neurotoxin detection kits for food analysis.</a> Appl. Environ. Microbiol. 71, 3935-3941 (2005).</li>
<li>Smits, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lateral-flow+assay+for+rapid+serodiagnosis+of+human+leptospirosis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Diagn.+Lab.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Lateral-flow assay for rapid serodiagnosis of human leptospirosis.</a> Clin. Diagn. Lab. Immunol. 8, 166-169 (2001).</li>
<li>Faulstich, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFaulstich%2C+K+%22Lateral+Flow+Immunoassay%22">Lateral Flow Immunoassay</a>. Wong, R., Tse, H. , Humana Press. 157-185 (2009).</li>
</ol>

Non abbiamo nulla da rivelare.

L&#39;identificazione definitiva di IPA può realmente essere raggiunti mediante isolamento dell&#39;agente eziologico da campioni bioptici, ma il recupero di campioni adeguati spesso non è possibile in pazienti molto malati e Aspergillus è raramente recuperabile dal sangue. Mentre grandi progressi sono stati fatti nell&#39;uso di scansione tomografica computerizzata del torace nella diagnosi IPA, caratteristiche che sono indicativi di IPA polmonare come il &quot;alone&quot; o &quot;mezzaluna&quot; air-segni sono transiente o può essere attribuito ad artefatti respirazione o di altre infezioni fungine 11,12. Tali dati sono quindi integrati con le tecniche sierologiche che mirano a identificare le molecole di firma (GM e β-glucano) da funghi che circolano nel siero del paziente o che sono presenti nei fluidi BAL, espettorato o 13 campioni di urina. Mentre questi test visualizzare sensibilità soddisfacente, mancano di specificità sufficiente o soffrono di interferenze determinate condizioni, 1,6 </sup&gt;. Il test per la rilevazione di IPA LFD qui presentato permette di diagnosticare il &#39;point-of-care&#39; della tecnologia IPA ed exploit che è stato utilizzato fino ad oggi nel test per la ricerca di virus, batteri, parassiti e tossine e 14-19, il più famoso, per il test di gravidanza a casa prima introdotto da Unipath nel 1988. Nella LFD Aspergillus qui descritto, l&#39;Aspergillus-specifico MAb JF5 è immobilizzato a una zona di cattura (linea del test) su una membrana di nitrocellulosa porosa. Immunoglobulina anti-topo immobilizzato alla membrana in una zona separata servito come controllo interno (linea di controllo). In aggiunta di siero o liquido BAL alla porta di rilascio, MAb JF5-coniugato di oro colloidale nel supporto di rilascio lega l&#39;antigene bersaglio e il complesso passa poi lungo la membrana porosa per azione capillare. MAb JF5 immobilizzato nella zona di cattura si lega alla JF5-oro colloidale-antigene complesso risultante in una linea di test rossa. Qualsiasi JF5-oro colloidale non legatoconiugato si lega al controllo interno, che indica che il test è stato eseguito correttamente. Ciò si traduce in una linea di controllo rossa. Il test è rapido, tenuto a soli 15 minuti per eseguire, è a buon mercato rispetto ai test di siero e BAL a base di GM e β-glucano di rilevamento, e non richiede costose attrezzature o strutture di laboratorio, per l&#39;esecuzione. Inoltre, MAb JF5 non cross-reagiscono con i farmaci o agenti inquinanti che sono stati indicati per causare falso positivo di reazione in GM e β-glucano test 1,4,6. Un ulteriore vantaggio importante rispetto agli attuali test diagnostici è la capacità di rilevare LFDs attività che è indicativo della crescita invasiva delle specie di Aspergillus. Un punto critico del procedimento LFD è la necessità di leggere i risultati 15 min dopo l&#39;applicazione del campione di siero o BAL al dispositivo. Il test non deve essere lasciato per più di 15 minuti prima di registrare i risultati, in quanto questo risultato interpretati polarizzazione puòsul. Una reazione debole non sarà rafforzata, estendendo il periodo di incubazione. Il trattamento termico di siero di modelli animali di infezione è stato trovato per migliorare la sensibilità del saggio. Una limitazione del test è che è qualitativa, e si affida al gestore di effettuare una valutazione soggettiva di positività. L&#39;intensità della linea di test varia a seconda del contenuto antigene di campioni di siero e BAL (Figura 1). Tuttavia, qualsiasi reazione positiva (determinata rispetto ai negativi noti) indica la presenza di antigene Aspergillus e quindi l&#39;infezione. Per limitare la soggettività di saggi LFD, dispositivi palmari sono disponibili che consentono la quantificazione delle intensità LFD linea del test e consentire la fissazione di valori soglia per il rilevamento dell&#39;antigene 20. Gli sviluppi futuri della direttiva sulle discariche sono la sua commercializzazione e lo sviluppo di un LFD multiplex che permette la rilevazione simultanea di altri agenti patogeni fungine invasiveanticorpi monoclonali altamente specifici utilizzando 3.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Comments </td></tr><tr><td> Aspergillus LFD </td><td> Università di Exeter </td><td></td><td> Disponibile presso l&#39;autore corrispondente su richiesta </td></tr><tr><td> RPMI-1640 </td><td> Sigma </td><td> R0883 </td><td></td></tr><tr><td> L-Glutammina </td><td> Sigma </td><td> G7513 </td><td></td></tr><tr><td> Siero fetale di vitello </td><td> Biosera </td><td> S9100 </td><td> Altre fonti di siero di vitello fetale possono essere utilizzati nella preparazione di TCM </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Fisher Scientific </td><td> BPE120-1 </td><td></td></tr></tbody></table>

rilevamento di aspergillosi polmonare in pazienti con neoplasie ematologiche maligne utilizzando la tecnologia a flusso laterale

Detection of Invasive Pulmonary Aspergillosis in Haematological Malignancy Patients by using Lateral-flow Technology

L&#39;aspergillosi polmonare invasiva (IPA) è una delle principali cause di morbilità e mortalità nei pazienti con neoplasie ematologiche e staminali ematopoietiche riceventi trapianto di cellule 1. Rilevamento di IPA rappresenta una sfida formidabile diagnostica e, in assenza di un &#39;gold standard&#39;, si basa su una combinazione di dati clinici e di microbiologia e istopatologia, ove possibile. La diagnosi di IPA devono essere conformi alla Organizzazione Europea per la Ricerca e la Cura del Cancro e l&#39;Istituto Nazionale di Allergologia e Malattie Infettive Micologia Study Group (EORTC / MSG) la definizione di un consenso &quot;provato&quot;, &quot;probabile&quot;, e &quot;possibile&quot; malattie fungine invasive 2 . Attualmente, non a base di acido nucleico prove sono state esternamente convalidato di rilevazione IPA e quindi la reazione a catena della polimerasi (PCR) non è incluso nelle attuali EORTC / MSG criteri diagnostici. Identificazione di Aspergillus in sezioni istologiche è problematico a causa di Simiirregolarità in morfologie ifali con altri patogeni fungine invasive 3, e l&#39;identificazione comprovata richiede l&#39;isolamento dell&#39;agente eziologico in coltura pura. Cultura approcci basati contare sulla disponibilità di campioni di biopsia, ma questi non sono sempre accessibili in pazienti malati, e non sempre producono propaguli vitali per la cultura se sono stati ottenuti. Una caratteristica importante nella patogenesi di Aspergillus è angio-invasione, una caratteristica che fornisce la possibilità di monitorare il fungo immunologicamente con test che rilevano le firme caratteristiche antigeniche molecole nel siero e nel lavaggio broncoalveolare (BAL) fluidi. Questo ha portato allo sviluppo del immunoenzimatico Platelia (GM-EIA) che rileva Aspergillus galattomannano e un saggio &#39;pan-fungini&#39; (test Fungitell) che rileva il conservato fungina componente della parete cellulare (1 → 3)-β-D- glucano, ma non nelle Mucorales che non hanno tale componente in 1,4 loro pareti cellulari. Ècita che circonda l&#39;accuratezza di questi test 1,4-6 ha portato al recente sviluppo della prossima generazione di anticorpi monoclonali (MAb) basati su saggi in grado di rilevare marker surrogati di infezione 1,5. Thornton 5 recentemente descritta la generazione di un Aspergillus-MAb specifico (JF5) usando la tecnologia degli ibridomi e suo uso per sviluppare un immunocromatografico a flusso laterale dispositivo (LFD) per la point-of-care (POC) diagnosi di IPA. Un importante vantaggio della LFD è la capacità di rilevare l&#39;attività dal MAb JF5 lega ad un antigene glicoproteina extracellulare che viene secreto durante la crescita attiva del fungo solo 5. Questa è una considerazione importante quando si utilizza fluidi come BAL polmonare per la diagnosi di IPA in quanto le spore di Aspergillus sono una componente comune di aria inalata. L&#39;utilità del dispositivo nella diagnosi IPA è stata dimostrata utilizzando un modello animale di infezione, in cui il LFD visualizzato sensibilità e specificity rispetto al GM Platelia e Fungitell (1 → 3)-β-D-glucano saggi 7. Qui vi presentiamo una semplice procedura LFD per rilevare l&#39;antigene Aspergillus nel siero e fluidi umani BAL. La sua velocità e la precisione fornisce una nuova aggiunta point-of-care test per la diagnosi di IPA nei pazienti con neoplasie ematologiche maligne.

Una rapida e accurata point-of-care test per aspergillosi polmonare è presentato. Esso si avvale di flusso laterale tecnologia utilizza uno specifico anticorpo monoclonale che si lega ad uno<em&gt; Aspergillus</emAntigene&gt; secreto durante le infezioni polmonari. Il saggio è compatibile con lavaggio siero e brochoalveolar e rappresenta un nuovo test aggiunta per la diagnosi della malattia.

Rilevamento di aspergillosi polmonare in pazienti con neoplasie ematologiche maligne utilizzando la tecnologia a flusso laterale

L'aspergillosi polmonare invasiva (IPA) è una delle principali cause di morbilità e mortalità nei pazienti con neoplasie ematologiche e tra coloro sottoposti a trapianto di cellule staminali emopoietiche...

L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare l'utilizzo di un dispositivo a flusso laterale per la rilevazione rapida dell'antigene diagnostico di aspergillo nei campioni di siero umano e nei liquidi di lavaggio broncoalveolare (BAL). Questo viene realizzato applicando innanzitutto il campione di siero o BAL alla porta di rilascio del dispositivo a flusso laterale. Il secondo passaggio consiste nel permettere alla soluzione di migrare lungo la membrana.Il passaggio successivo consiste nel determinare se il test è valido esaminando la linea di controllo interna. L'ultimo passaggio consiste nell'interpretare il risultato del test esaminando la linea di test. In definitiva, il dispositivo a flusso laterale viene utilizzato per rilevare la presenza dell'antigene diagnostico di Aspergillus nei fluidi sierici o nel lavaggio broncoalveolare (BAL).Il test LFD per Aspergillus può essere utilizzato come test complementare per la diagnosi di aspergillosi polmonare invasiva. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come l'immunoassay enzimatico per galactomanna di Aspergillus, il test panf, fundal, beta-glucano e il test PCR per Aspergillus è che si tratta di un test diagnostico rapido effettuabile al letto del paziente, che richiede minime strutture di laboratorio e formazione. Sebbene il LFD sia stato sviluppato per il rilevamento di specie di Aspergillus, la tecnologia a flusso laterale può essere applicata anche al rilevamento di altri agenti patogeni infettivi come Cetosporium, Fusarium e specie di Riser.Incorporando anticorpi monoclonali specifici per questi organismi, la dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale. Poiché l'interpretazione dei risultati del test immunocromatografico richiede familiarità con il formato del saggio, per raccogliere il siero da campioni di sangue non trattati, lasciare coagulare il sangue a quattro gradi Celsius. Il siero e i campioni di lavaggio broncoalveolare, o fluidi BAL, devono essere conservati in aliquote a meno 20 gradi Celsius prima dell'uso; la conservazione in aliquote limita il potenziale degrado dell'antigene bersaglio dovuto al ripetuto congelamento e scongelamento dei campioni durante test ripetuti. Per preparare i campioni di siero e BAL per l'analisi, scongelare i campioni a temperatura ambiente, quindi mantenerli sul ghiaccio. Mescolare accuratamente mediante vortex e quindi centrifugare per un minuto a 14.000 RPM. Per l'analisi di routine di campioni umani, diluire il siero uno a uno con mezzo per colture cellulari; in alternativa, per dissociare l'antigene bersaglio dai complessi immunitari sierici, diluire il siero uno a due con PBS contenente 4% EDTA, riscaldare per tre minuti in un bagno d'acqua in ebollizione e centrifugare per cinque minuti a 14.000 RPM.I fluidi BAL umani non richiedono pretrattamenti. Un campione di BAL, dopo essere stato scongelato, agitato in vortex e centrifugato, è un campione limpido che può essere applicato direttamente sul dispositivo a flusso laterale. Per i test, i dispositivi a flusso laterale (LFD) sono conservati a temperatura ambiente o a 23 gradi Celsius, condizioni alle quali rimangono stabili per 12 mesi.Per iniziare il saggio, rimuovere i dispositivi dalle loro confezioni e posizionarli su una superficie piana. Utilizzando una punta di pipetta sterile, applicare 100 microlitri di siero pretrattato nel porto di rilascio del dispositivo entro pochi secondi. Il liquido dovrebbe migrare per azione capillare lungo la membrana di cellulosa nitrata nella finestra di osservazione.Nello stesso modo, applicare 100 microlitri di un campione di BAL non diluito alla porta di rilascio del dispositivo. Lasciare procedere il saggio per 15 minuti a temperatura ambiente, momento in cui i risultati del test devono essere registrati. Il test non deve essere lasciato per più di 15 minuti prima della registrazione dei risultati.Poiché ciò potrebbe influenzare l'interpretazione dei risultati, una reazione settimanale non verrà potenziata prolungando il periodo di incubazione. Il LFD è costituito da una linea di controllo interno indicata dalla lettera C sulla carcassa in plastica e da una linea di test indicata dalla lettera T. La linea di controllo deve sempre apparire, indipendentemente dalla presenza dell'antigene aspergillo nel siero o nel campione di BAL. Ciò indica che il saggio è stato eseguito correttamente se l'antigene aspergillo è presente nel siero o nel campione di BAL.La linea di test apparirà anche entro 15 minuti dall'applicazione del campione. L'intensità delle reazioni di test per la malattia di Lyme è proporzionale alle concentrazioni dell'antigene bersaglio nei campioni di siero e VAL. L'aspetto più complesso di questa procedura è l'interpretazione dei risultati del test.I risultati del test immunocromatografico devono essere letti dopo 15 minuti e il risultato del test deve essere confrontato con l'esempio rappresentativo mostrato qui. In questa figura sono mostrati esempi rappresentativi di risultati deboli positivi, moderatamente positivi e fortemente positivi del test immunocromatografico con campioni di lavaggio broncoalveolare e siero. Qualsiasi linea di test positiva nel campione di siero, indipendentemente dall'intensità, indicherebbe aspergillosi polmonare invasiva o malattia IPA a causa della presenza di antigene di Aspergillus in circolo nel torrente ematico. Reazioni positive nel lavaggio broncoalveolare, indipendentemente dall'intensità, indicherebbero germinazione delle spore e sviluppo di ife potenzialmente patogene nei polmoni.In assenza di antigene aspergillo, non apparirà alcuna linea di test e il risultato viene registrato come negativo. Questa tabella mostra i risultati dei test LFD effettuati utilizzando fluidi BAL provenienti da pazienti affetti da leucemia mieloide acuta o da pazienti con ML, diagnosticati secondo i criteri diagnostici del gruppo di studio dell'Organizzazione Europea per la Ricerca e il Trattamento del Cancro e dell'Istituto Nazionale per le Allergie e le Malattie Infettive. Nella tabella sono inclusi i corrispondenti dati clinici e psicologici, nonché i risultati di un test PCR specifico per ASPERIA per ciascun paziente.Secondo le linee guida E-O-R-T-C-M-S-G del 2002, i pazienti 12, 13 e 16 sono stati diagnosticati con aspergillosi invasiva possibile sulla base di fattori legati all'ospite e criteri clinici oppure della positività al GM. Secondo le linee guida E-O-R-T-C-M-S-G riviste del 2008, i fattori legati all'ospite e la positività al GM da soli, oppure i fattori legati all'ospite e i criteri clinici da soli, non indicherebbero un'infezione fungina invasiva possibile, a meno che non siano accompagnati da evidenze di supporto provenienti rispettivamente dai dati clinici e dalla micologia. Il paziente sei è stato diagnosticato con aspergillosi invasiva probabile secondo entrambe le linee guida del 2002 e del 2008, a causa di fattori legati all'ospite, caratteristiche cliniche maggiori e minori e positività al GM.Infine, si noti che, sebbene attualmente né il saggio LFD né il saggio PCR siano inclusi nelle linee guida E-O-R-T-C-M-S-G nei campioni di lavaggio broncoalveolare (BAL) dei pazienti sei e dodici, esiste un forte accordo tra i due saggi e il test commerciale per la gala manin, che indica la presenza di antigene e acido nucleico di aspergillus. Seguendo questa procedura, altri metodi come il saggio enzimatico per la glattomanina (Pella Glactomannan), il test panf, il test per il beta-glucano fungino o i test PCR per aspergillus possono essere eseguiti in parallelo per confermare la malattia fungina invasiva. Non dimenticare che lavorare con siero umano e fluidi di BAL può essere estremamente pericoloso e gli operatori del dispositivo dovrebbero sempre essere vaccinati contro malattie come l'epatite B e la tubercolosi.I.

detection-invasive-pulmonary-aspergillosis-haematological-malignancy

Research

Ricerca

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Questo metodo descrive l'utilizzo di Infrared sistema colorante di imaging based per il rilevamento di H1N1 in bronchioalveolar lavaggio (BAL) fluido di topi infettati ad una sensibilità elevata. Questa metodologia può essere eseguita in uno 96 - o 384-bene piastra, richiede &lt;10 volume pl di materiale di prova e ha il potenziale per lo screening concomitante di agenti patogeni multipli.

High-throughput Metodo di rilevazione per il virus dell&#39;influenza

Qui, descriviamo un protocollo per valutare l'attività antifungina di cellule immunitarie umane primarie in tempo reale utilizzando fluorescente Aspergillus conidi giornalista in combinazione con microscopia video live-cell e citometria a flusso. Dati generati forniscono informazioni sulle interazioni di accoglienza cellulo Aspergillus, come fungicida, fagocitosi, la migrazione delle cellule e l'inibizione della crescita di funghi.

Immagini dal vivo di antifungini attività da Human neutrofili e monociti primaria in risposta a<em&gt; A. fumigatus</em

Qui descriviamo un protocollo per determinare l'onere fungine polmonari nei topi con aspergillosi invasiva mediante la quantificazione di argento methanamine modificate di Gomori colorazione nelle sezioni istologiche. Utilizzo di questo metodo ha provocato risultati comparabili con meno animali rispetto alla valutazione dell'onere fungine mediante PCR quantitativa di DNA fungoso del polmone.

Istologico quantificazione per determinare il fardello fungine del polmone nell'aspergillosi sperimentale

Questo protocollo fornisce un metodo veloce e affidabile per misurare quantitativamente la fagocitosi di Aspergillus fumigatus conidia da fagociti primari umani utilizzando la citometria di flusso e per discriminare la fagocitosi di conidia dalla mera adesione ai leucociti.

Misurare la fagocitosi di Aspergillus fumigatus Conidia da parte dei Leucociti Umani utilizzando Flow Cytometry

Descriviamo il metodo per l'analisi quantitativa della distribuzione di Aspergillus fumigatus conidia (3 μm di dimensione) nelle vie aeree dei topi. Il metodo può anche essere utilizzato per l'analisi della distribuzione di microparticelle e agglomerato di nanoparticelle nelle vie aeree in vari modelli di condizioni patologiche.

Analisi quantitativa basata su microscopia a scansione laser confocale della distribuzione di conidi di Aspergillus fumigatus nel polmone di topo a montaggio intero otticamente cancellato

Vari agenti patogeni batterici possono causare infezioni del tratto respiratorio e portare a gravi problemi di salute se non rilevati con precisione e trattati tempestivamente. Il rilevamento rapido e accurato di questi patogeni tramite amplificazione isoterma mediata da loop fornisce una gestione e un controllo efficaci delle infezioni del tratto respiratorio in ambito clinico.

Rilevamento rapido di agenti patogeni batterici che causano infezioni del tratto respiratorio inferiore tramite amplificazione isotermica mediata da loop basata su chip microfluidico

Qui, descriviamo un non-invasiva a due fotoni (2P) approccio microscopia per lo studio dei leucociti homing nella zampa del mouse. Discutiamo gli aspetti tecnici della nostra preparazione dei tessuti di imaging e camminare il lettore attraverso un tipico esperimento di configurazione iniziale di esecuzione e di raccolta dei dati.

Non invasiva di imaging di homing dei leucociti e la migrazione In vivo</em

Questo protocollo descrive un semplice nastro adesivo a base di approccio per il campionamento di pomodoro e di altre superfici di prodotti freschi, seguita da una rapida individuazione cellule intere...

Combinazione di nastro adesivo a base di campionamento e di fluorescenza In situ</emIbridazione> per il rilevamento rapido di Salmonella Su prodotti freschi

Utilizzando luciferasi e sistemi di imaging in vivo (IVIS) come un nuovo mezzo per identificare terminazioni malattia prima sviluppi clinici verificarsi. IVIS ci ha permesso di visualizzare in tempo reale l'invasione di virus encefalitiche più giorni, fornendo un modello di malattia più accurato per lo studio futuro. E ci ha anche permesso di identificare le caratteristiche potenziali di protezione di antivirali e vaccini più veloce rispetto ai modelli animali attualmente utilizzati. La...

In Vivo Imaging Systems (IVIS) il rilevamento di un neuro-invasiva Virus encephalitic

Intatte classe I complessi HLA / peptide sono capannone dalle cellule tumorali, che rappresenta un potenziale biomarcatore cancro rilevante. Utilizzando la tecnologia dei sensori senza etichetta e il recettore delle cellule T mimando anticorpi monoclonali, rilevamento di capannone MIF / HLA-A * 02: 01 complessi in sovranatanti cellulari MDA-MB-231, spillo siero umano, e plasma del paziente è dimostrata, consentendo lo sviluppo di un romanzo cancro piattaforma diagnostica.

Rilevamento dei leucociti umani Antigen Biomarkers in Breast Cancer Utilizzando libero-Label Biosensor Tecnologia

Scopri il rilevamento rapido dell'aspergillosi polmonare invasiva utilizzando un dispositivo a flusso laterale per campioni di siero e BAL. Questo metodo offre una diagnosi in 15 minuti per pazienti con neoplasie ematologiche.

Rilevamento di aspergillosi polmonare in pazienti con neoplasie ematologiche maligne utilizzando la tecnologia a flusso laterale (Video) | JoVE Journal

Rilevamento di aspergillosi polmonare in pazienti con neoplasie ematologiche maligne utilizzando la tecnologia a flusso laterale

Esplora altri video