L'analisi fenotipica e l'isolamento di murini cellule staminali ematopoietiche e Lineage-committed progenitori

Questo video illustra un protocollo per l'isolamento e la caratterizzazione fenotipica di progenitori ematopoietici mediante separazione basata su microsfere magnetiche e selezione cellulare attivata da fluorescenza. In primo luogo, la zampa posteriore, il femore, la tibia e il midollo spinale vengono dissecati da un topo e omogeneizzati per generare una sospensione cellulare di midollo osseo. La popolazione viene quindi arricchita per le cellule che esprimono C kit utilizzando un flusso di microsfere magnetiche.

L'analisi citometrica della popolazione arricchita dimostra che questo metodo consente di ottenere cellule ematopoietiche altamente purificate, progenitori e cellule staminali ematopoietiche, che possono quindi essere utilizzate per studi funzionali in vitro e in vivo. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come il lavaggio osseo, è che permette un recupero più efficiente e rapido delle cellule del midollo osseo. Le implicazioni di questa tecnica riguardano la terapia o la diagnosi di infiammazione, autoimmunità, immunodeficienze, malattie degenerative, disturbi metabolici e modelli di cancro immunitario, poiché consente la caratterizzazione fenotipica e l'analisi funzionale ex vivo dei progenitori ematopoietici.

Pertanto, questo metodo può fornire informazioni utili per il monitoraggio dell'emopoiesi in diverse condizioni fisiologiche e patologiche. Può inoltre essere utilizzato per studiare la trasduzione dei segnali di biologia cellulare e l'espressione genica regolata nello sviluppo in distinti sottoinsiemi di progenitori. Iniziare posizionando un topo eutanasizzato in un contenitore di acciaio inossidabile.

Spruzzare l'addome e la schiena con etanolo al 70% per raccogliere le ossa che verranno utilizzate come fonte di cellule. Utilizzare le forbici per praticare due piccole aperture nella pelle alle zampe posteriori; con l'aiuto di pinze, dislocare il femore, quindi capovolgere il topo e tagliare la pelle longitudinalmente. Per esporre la colonna vertebrale, rimuovere la colonna vertebrale.

Quindi, utilizzando forbici con punta affilata, rimuovere con attenzione tutti i residui di tessuto molle dalla colonna vertebrale. Utilizzare garza per rimuovere i residui di tessuto molle da femore e tibia.

Quindi posizionare le ossa in un tubo conico da 50 millilitri contenente 30 millilitri di RPMI.Medium integrato. Posizionare diversi filtri sterili quattro-quinti in un mortaio sterile. Quindi, utilizzando pinze, trasferire le ossa nel mortaio e coprirle con un altro strato di filtri per assemblare una superficie di frizione.

Successivamente, posizionare un filtro con maglia da 40 micron in un tubo conico da 50 millilitri. Quindi, utilizzando un pestello, frantumare le ossa fino a ottenere una sospensione cellulare omogenea. E, utilizzando una pipetta, trasferire la sospensione nel filtro cellulare.

Successivamente, aggiungere cinque millilitri di RPMI fresco supplementato nel mortaio per lavare e raccogliere le cellule residue, aspirando e dispensando con la pipetta. Quindi aggiungere il RPMI nel tubo contenente il filtro. Ripetere questi ultimi due passaggi finché le ossa omogeneizzate non appaiono limpide.

Dopo che la soluzione è passata attraverso il filtro, trasferirla in un nuovo tubo da 50 millilitri e filtrare, ripetendo il processo per eliminare i residui di tessuto rimanenti. Centrifugare. Utilizzare il tubo a 500 ×g per cinque minuti a quattro gradi Celsius e rimuovere con attenzione il soprannatante mediante aspirazione. Assicurarsi di non disturbare il pellet cellulare.

Il passo successivo della procedura consiste nel caratterizzare i fenotipi dei progenitori ematopoietici. Iniziare risospendendo il pellet cellulare di ogni topo in 15 millilitri di PBS e 2% FBS. Quindi centrifugare il tubo a 500 ×g per cinque minuti a quattro gradi Celsius ed eliminare con attenzione il sopranatante mediante aspirazione.

Non disturbare il pellet. Reese ha sospeso il pellet in cinque millilitri di PBS e 2% FBS e ha contato le cellule utilizzando un emocitometro. Una volta determinata la concentrazione cellulare, trasferire un milione di cellule in ciascun pozzetto di una piastra rotonda a 96 pozzetti.

Quindi centrifugare la piastra a 500 ×g per cinque minuti. Durante la centrifugazione, preparare una miscela di anticorpi monoclonali diretti contro i marcatori di superficie elencati qui in PBS e 2% di FBS per colorare le cellule. Al termine della centrifugazione, eliminare il soprannatante capovolgendo la piastra e aggiungere 50 microlitri della miscela di anticorpi in ogni pozzetto.

Quindi, utilizzando una pipetta multicanale, aspirare e dispensare più volte per dissociare le cellule in sospensione singola. Incubare le cellule per 20 minuti al buio a quattro gradi Celsius; al termine dell'incubazione, lavare le cellule due volte con 150 microlitri di PBS e FBS al 2%. Successivamente, centrifugare la piastra a 500 ×g per cinque minuti.

Quindi scartare la senna capovolgendo la piastra. Successivamente, aggiungere 50 microlitri di streptavidina AP diluita 1:300, dimensione 7, in PBS con 2% di FBS in ogni pozzetto, quindi dissociare in sospensione di singole cellule mediante pipettaggio. Incubare le cellule per 10 minuti al buio a quattro gradi Celsius, successivamente all'incubazione.

Lavare le cellule due volte con 150 microlitri di PBS e 2% di FBS. Dopo aver centrifugato la piastra per recuperare, eliminare il soprannatante S e risospendere le cellule in 100 microlitri di PBS e 2% di FBS; analizzare i campioni mediante citometria. Successivamente, per separare sottoinsiemi selezionati di cellule ematopoietiche, si esegue un arricchimento magnetico sul midollo osseo per arricchire le cellule positive al marcatore. Risospendere il pellet cellulare ottenuto dal midollo osseo derivante da almeno 10 topi in un millilitro di soluzione tampone contenente l'anticorpo monoclonale anti-C kit coniugato a PC, diluito 1:50.

Incubare le cellule per 20 minuti al buio a quattro gradi Celsius dopo l'incubazione. Lavare le cellule due volte con 40 millilitri di soluzione tampone. Dopo la centrifugazione, rimuovere con attenzione il sopranatante per aspirazione.

Quindi aggiungere 50 microlitri di microperle anti A PC per topo direttamente al pellet. Mescolare bene e incubare per 20 minuti al buio a quattro gradi Celsius; dopo l'incubazione, lavare e centrifugare le cellule come in precedenza. Successivamente, risospendere il pellet cellulare in quattro millilitri di soluzione tampone per ogni tre topi, posizionare le colonne LS max nel campo magnetico di un separatore max adatto.

Preparare le colonne lavando con quattro litri di soluzione tampone. Quindi applicare la sospensione cellulare e raccogliere le cellule non marcate che passano attraverso in un tubo di raccolta. Lavare la colonna con quattro litri di soluzione tampone per tre volte.

Aggiungere nuovo buffer quando il serbatoio della colonna si svuota. Una volta che tutta la soluzione è passata, scartare il flusso in eccesso, rimuovere le colonne dal separatore e posizionare ciascuna su una provetta conica da 15 millilitri. Pipettare quattro millilitri di soluzione tampone su ciascuna colonna e immediatamente eluire le cellule marcate magneticamente spingendo lo stantuffo all'interno della colonna.

Centrifugare i tubi a 500 ×g per cinque minuti. Rimuovere con attenzione il sopranatante mediante aspirazione. Risospendere ogni pellet con un millilitro di soluzione tampone e raccogliere i pellet in un singolo tubo conico da 15 millilitri.

Dopo aver arricchito la popolazione di cellule positive per il kit marino, colorare e separare le cellule mediante facts. I progenitori ematopoietici e le cellule staminali ematopoietiche provenienti da una sospensione di midollo osseo arricchita per cellule positive al kit marino, utilizzando perline magnetiche, e le LT HSC e le THSC sono state separate in base all'espressione di molecole di superficie come descritto in questo video. Questa figura mostra un esempio della procedura di selezione elettronica per identificare i progenitori linfoidi comuni come linin.

Visualizzare cellule con bassa espressione di interleuchina sette R positive. Lin negativo, cellule positive per SEE kit e positive per scar uno, e lin negativo, cellule positive per SEE kit e positive per scar uno. Cellule a bassa espressione provenienti dalla popolazione positiva per SEE kit.

I progenitori mieloidi comuni sono identificati come cellule FC gamma R.Low CD34 positive. Inoltre, a partire dal C-kit positivo, i progenitori granulocito-monociti sono identificati come cellule FC gamma high CD34 positive, mentre i progenitori megacariocito-eritrocitari sono identificati come cellule FC gamma low CD34 negative. Da LKS otto L-T-H-S-C e S-T-H-S-C sono identificati rispettivamente come cellule CD34 negative e CD34 positive. Pertanto, si ottengono due popolazioni arricchite e altamente purificate, fisiologicamente presenti in numero ridotto, per valutare l'impatto dell'autoimmunità sull'ematopoiesi delle cellule staminali ematopoietiche provenienti da topi di controllo e da topi con malattia infiammatoria intestinale.

Sono stati colorati con l'anticorpo anti-KI 67 e con DPI, come si può vedere qui. Le cellule in ciclo sono appena percettibili, se non addirittura assenti, nel compartimento delle cellule staminali ematopoietiche LKS CD34 negative dei controlli sani. Al contrario, lo stesso sottoinsieme cellulare è significativamente aumentato durante la malattia infiammatoria intestinale (IBD) e un numero consistente di CSC viene rilevato nelle fasi S e G2/M del ciclo cellulare.

Ciò suggerisce che l'infiammazione cronica mediata da linfociti T determina l'ingresso delle HSC nel ciclo cellulare. Per valutare la presenza di ATP immagazzinato in vescicole, le cellule CD34 negative provenienti da topi sani sono state marcate con il composto legante i nucleotidi chinino e l'analisi con rosso nucleare mediante microscopia confocale su cellule vive rivela che nel citoplasma delle HSC, ma non dei GMP, sono visibili vescicole positive al chinino. Per determinare se le HSC rispondono all'ATP extracellulare, è stata analizzata la risposta al calcio delle cellule staminali ematopoietiche purificate caricate con 4 0 2 e stimolate con ATP e ionomicina, come mostrato qui. I tracciati di aumento del calcio a livello singola cellula indicano un incremento del calcio citosolico nelle LT-HSC mediante l'attivazione di recettori purinergici anergici di tipo P2.

All'esposizione a un TP, poiché l'aumento del calcio citosolico induce il rilascio di ATP vescicolare. Questo esperimento suggerisce che un TP possa regolare il proprio rilascio dalle CSC e dimostra che questa procedura può essere utilizzata per studi funzionali delle CSC. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare cellule staminali topo neurali e progenitori impegnati nella linea cellulare per saggi funzionali. Successivamente a questa procedura, altri metodi come il ripristino di topi riceventi non irradiati possono essere eseguiti per rispondere ad ulteriori domande, come il potenziale di ripristino delle cellule staminali ematopoietiche purificate da uno stato C o da un ambiente infiammatorio.