Imaging quantitativa di Lineage specifici Toll-like receptor-mediate Signaling in monociti e cellule dendritiche da piccoli campioni di sangue umano

L'obiettivo generale del seguente esperimento è dimostrare l'uso della tecnologia del flusso di immagini per quantificare i meccanismi cellulari delle cellule immunitarie primarie da coorti di pazienti ben definite. Ciò si ottiene isolando prima le cellule mononucleate del sangue periferico o pbmc da campioni di sangue acquisiti da pazienti o volontari sani. Dopo l'isolamento, le cellule vengono attivate e quindi marcate in modo fluorescente.

Successivamente, le cellule vengono focalizzate idrodinamicamente, eccitate con luce laser e visualizzate su un'integrazione ritardata. Telecamera CCD. Infine, sono necessarie immagini utilizzando il citometro a flusso di immagini e la quantificazione di NF kappa b.

La traslocazione in ogni immagine cellulare viene eseguita utilizzando il software ideas. In definitiva, le differenze tra ciascun gruppo di soggetti possono essere determinate attraverso l'analisi di grafici a punti, istogrammi e immagini cellulari. Il vantaggio del flusso di immagini è che combina fatti e immunofluorescenza.

Siamo in grado di esaminare le vie di segnalazione cellulare in un modo specifico per il lignaggio, sia a singola cellula che a popolazione, e iniziando con solo un piccolo campione di sangue. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nella conoscenza localizzando e quantificando gli intermedi di segnalazione. Ad esempio, può essere utilizzato per studiare la traslocazione nucleare mediata dall'azione di fattori trasparenti o per esaminare gli effetti dell'invecchiamento sulla biologia cellulare.

Il leader uno del mio laboratorio dimostrerà la tecnica dopo aver isolato le cellule mononucleate del sangue periferico ottenute da volontari umani. Resus risospendere le p BMC recuperate a tre volte da 10 alla sesta cellula per 0,6 millilitri di terreno, quindi trasferire la sospensione cellulare in provette da 1,5 millilitri. Successivamente, stimolare alcune delle cellule con un agente attivante come il TLR otto LA R 8 4 8 mostrato qui, quindi incubare tutte le cellule a 37 gradi Celsius per 10-60 minuti in un incubatore al 5% di anidride carbonica.

Dopo il periodo di incubazione, pellettare le cellule per cinque minuti a 500 volte G a temperatura ambiente, scartare il surnatante, etichettare le cellule con un cocktail di anticorpi di superficie specifici per monociti o linee DC per 20 minuti a quattro gradi Celsius, comprese le provette di cellule marcate con coniugati monocolore da utilizzare come controlli di compensazione. Quindi fissare le celle in 4%P-F-A-P-B-S per 10 minuti a temperatura ambiente. Dopo aver centrifugato le cellule per 10 minuti a 500 volte G a temperatura ambiente, risospendere il pbmc in un tampone di congelamento e conservare le cellule a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius fino a quando non saranno analizzate il giorno del saggio.

Scongelare rapidamente le cellule in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius, quindi dopo la centrifugazione per rimuovere il tampone di congelamento, permearle con 100 microlitri di tampone di lavaggio permanente BD. Quindi etichettare con anticorpi anti componenti di segnalazione intracellulare come gli anticorpi anti NF kappa BP 65 mostrati qui per 20 minuti a temperatura ambiente. Dopo la pellettatura, le cellule Resus le sospendono in 100 microlitri di tampone di lavaggio BD perm contenente IgG di capra anti coniglio.

Alexa 6 47 e incubare il pbmc per altri 20 minuti a temperatura ambiente. Immediatamente prima dell'imaging, la controcolorazione delle cellule con un colorante nucleare, inizia alimentando il flusso di immagini e quindi avviando il software inspire. Quindi, fare clic sul modello predefinito di caricamento e quindi selezionare Inizializza fluidica.

Quindi fare clic sul menu della galleria di immagini e selezionare tutto. Ora premere run set up per avviare l'imaging delle perline, quindi selezionare il canale del campo chiaro. Una volta che le perline di velocità sono in funzione, fare clic su Avvia tutto nella scheda di assistenza per calibrare e testare lo strumento.

Dopo che il sistema ImageStream è stato calibrato, premere il pulsante di riflusso, blocco e caricamento per caricare il campione più luminoso nella macchina. Quindi impostare la potenza del laser in modo tale che ogni cromo della flora abbia un valore massimo di pixel compreso tra 104.000 conteggi misurati nei grafici a punti. Quindi imposta i criteri di classificazione delle celle.

Ora fai clic su Esegui, acquisisci per raccogliere e salvare il file di dati dell'esperimento per analizzare prima i file di dati, aprire le idee. I software analitici creano file di immagine compensati e quindi eseguono il gate on degli eventi con un'intensità di colorante nucleare normale e un elevato rapporto di aspetto del colorante nucleare. Per distinguere le singole cellule nel gate R 1 dai detriti o dagli eventi multicellulari, i monociti si trovano all'interno del gate per le cellule positive al CD 14, le cellule dendritiche mieloidi, che sono alte per il CD 11 C e basse per il CD quattro e i marcatori lin uno si trovano nel gate R tre.

Infine, utilizzare il software ideas per determinare la colocalizzazione del fattore di trascrizione citoplasmatico NF kappa B con il colorante nucleare. Un'elevata correlazione del colorante nucleare NF kappa B che indica la colocalizzazione dei due marcatori si riflette in un alto punteggio di somiglianza e indica il grado di attivazione della cellula. La percentuale di eventi ad alta somiglianza tra diversi gruppi di trattamento o popolazioni di pazienti può essere confrontata per valutare l'efficienza funzionale relativa dell'idea delle cellule.

Il software può quindi essere utilizzato per visualizzare immagini di cellule da segmenti chiave di istogrammi di popolazione. ImageStream consente il gating di sottoinsiemi di cellule direttamente da pbmc e l'imaging delle risposte cellulari da popolazioni cellulari gated, ma non ordinate. Qui è stato quantificato l'effetto della segnalazione TLR sulla localizzazione nucleare di NF kappa BP 65 in lin uno, CD negativo quattro, CD debole 11 C dcs mieloide positivo.

È stata osservata un'alta percentuale di cellule non stimolate con il fattore di trascrizione NF kappa BP 65 nel citoplasma Dopo la stimolazione, è stato determinato che le cellule trattate avevano un punteggio di somiglianza significativamente più alto di NF Kappa BP 65 con la colorazione nucleare PI che indica che NF Kappa BP 65 trans si trova nel nucleo dopo la stimolazione. Le immagini digitali raccolte simultaneamente delle popolazioni cellulari stimolate non trattate, o R 8 48, mostrano cellule rappresentative e l'intensità di NF kappa B trans localizzata nel nucleo cellulare. Si noti l'intensità più luminosa della colorazione NF Kappa B e PI nel gruppo stimolato R 8 48 rispetto alle cellule non trattate.

Abbiamo utilizzato questa tecnica su cellule di donatori di età diverse e abbiamo mostrato differenze nelle vie di attivazione di NF kappa B mediate da TLR Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita entro un giorno con un tempo aggiuntivo per l'analisi delle immagini, consentendo sia diverse immagini di localizzazione che statistiche di popolazione. Inoltre, possiamo visualizzare le risposte direttamente da più popolazioni cellulari senza separazione fisica. Il flusso di immagini può essere ampiamente applicato a una serie di meccanismi cellulari e dovrebbe essere molto prezioso nella ricerca traslazionale.