Name: Imaging quantitativa di Lineage specifici Toll-like receptor-mediate Signaling in monociti e cellule dendritiche da piccoli campioni di sangue umano (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: Scopri l'imaging quantitativo dei meccanismi cellulari nei monociti e nelle cellule dendritiche utilizzando la tecnologia ImageStream. Questo metodo consente l'analisi di piccoli campioni di sangue per la ricerca traslazionale in immunologia.

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Questo lavoro è stato supportato in parte dal NIH (N01 HHSN272201100019C, U19 AI 089.992, e il NCRR / GCRC Programma M01-RR00125). Gli autori dichiarano di non conflitto di interessi finanziari e ringraziare il Dr. Mark Shlomchik, direttore del Fondo Anima a celle Yale Sorter.

1. L&#39;isolamento e la stimolazione delle cellule immunitarie <ol><li> Ottenere 10-50 ml di sangue eparinizzato da volontari sani, dopo consenso informato scritto in base alle direttive del consiglio locale Institutional Review. Per gli studi di invecchiamento o di malattia patogenesi, criteri di esclusione e di inclusione per ciascun volontario o il paziente deve essere esplicitamente determinato. </li><li> Isolate cellule mononucleari del sangue periferico (PBMC) che utilizzano tubi o CPT Ficoll-Paque Inoltre secondo le istruzioni del produttore (GE Healthcare, NJ) e condurre esperimenti nel giorno di isolamento 7 (reagenti, Tabella 1). </li><li> Incubare PBMC (3 x 10 6 / provetta) in provette da 1,5 ml a 0,6 ml di mezzo da solo o stimolate con ligandi TLR o agenti attivanti, quali per esempio la TLR7 / 8 ligando R848 (0,6 ml di terreno più 0,6 microlitri di 10 mM TLR7 / 8 ligando R848, concentrazione finale 10 uM) a 37 ° C per 10-60 minuti (InvivoGen, CA) 9. </li></ol> 2. LaboratorioEling delle cellule <ol><li> Etichetta linea cellulare e altri marcatori di superficie sulle sospensioni di cellule in vivo utilizzando anticorpi coniugati fluorescenza. Etichetta 3 x 10 6 PBMC per 20 min a 4 ° C in 100 pl di PBS / 2% FBS in una provetta Eppendorf da 1,5 ml con un cocktail di anticorpi specifici di superficie per lignaggi monociti o DC (Tabella 2). Diluizioni ottimali di anticorpo può essere determinata in esperimenti preliminari ei campioni devono essere trattati in lotti per ridurre al minimo da lotto a lotto variazione. Per magazzino anticorpi fornitore di 0,1 mg / ml utilizzare 5 microlitri di anticorpo (diluizione 1:20). Utilizzare un tubo separato di cellule marcate con un solo coniugato singolo colore per impostare i canali fluorescenti sullo strumento. </li><li> Dopo l&#39;etichettatura di superficie, fissare le cellule in 4% PFA / PBS per 10 min a RT. Per la conservazione fino al momento dell&#39;analisi, cellule centrifugare a 500 xg e risospendere le cellule in tampone di congelamento (90% FBS contenente il 10% DMSO) a -80 ° C fino al giorno di dosaggio. </li><li> Per la valutazione, il processo batch of cellule non trattate e stimolato da un gruppo di donatori insieme per minimizzare la variabilità. Il giorno di analisi, cellule scongelamento rapidamente a 37 ° C bagnomaria, centrifugare a 500x g per rimuovere buffer di congelamento. </li><li> Per permeabile celle per il rilevamento di citochine intracellulari o altri indicatori, le sospensioni cellulari risospendere in 100 pl BD Perm / tampone di lavaggio (BD Biosciences, NJ). Etichetta per i componenti di segnalazione intracellulare con ad esempio, 1:20 diluizione di coniglio anti-NF-kB (p65) di anticorpi (concentrazione finale 10 pg / ml, Santacruz Biotechnology, CA) per 20 minuti a RT, centrifugare a 500 xg, Aspirare il surnatante e risospendere le cellule in 100 Perm BD pl / Tampone di lavaggio contenenti la diluizione 1:250 di capra anti-IgG di coniglio-Alexa647 (Invitrogen, CA) e incubare per 20 minuti a RT. </li><li> Immediatamente prima di imaging, di contrasto nuclei con DAPI (0,2 pg / ml, Invitrogen, CA) o ioduro di propidio (PI; 20 ng / ml, Invitrogen, CA). </li></ol> 3. Analisi ImageStream <ol><li>Condurre imaging ImageStream su campioni in batch per ridurre la variabilità tra i campioni umani. Impostazioni dello strumento di potenza del laser sono state le seguenti: 200 mW per 488 nm, 10 mW per 658 nm e 250 mW per 405 nm. </li><li> Per analizzare i file di dati (Fig. 1), in primo luogo, Porta a eventi con intensità PI normale e alto rapporto di aspetto PI (larghezza: rapporto di altezza) per distinguere le singole cellule (R1) da detriti (bassa intensità PI) o multi-cellulari (eventi PI alta intensità e basso rapporto d&#39;aspetto). I monociti sono all&#39;interno di un cancello per CD14 cellule positive. MDC sono all&#39;interno di un cancello per cellule che sono alta e bassa per CD11c per CD4 (R2) e bassa anche per Lin-1 marcatori (R3). </li><li> Utilizzare IDEE software (Amnis, WA) per fornire una misura efficace quantitativa del grado di attivazione di ciascuna cella. Determinare la similarità (o co-localizzazione) del fattore di trascrizione NF-kB citoplasmatico nucleare con colorante PI per indicare traslocazione nel nucleo (R4). Una correlazione elevata NF-κB/PI Localizazione si riflette in un punteggio di somiglianza elevata e indica il grado di attivazione 10. </li><li> Confronta i rapporti di somiglianza tra i diversi gruppi di trattamento o popolazioni di pazienti per indicare relativa efficienza funzionale delle cellule. Quantificare i dati tra i campioni attraverso il confronto statistico dei valori assoluti o differenze piega. Utilizzare il software IDEAS per visualizzare le immagini di cellule provenienti da segmenti chiave di istogrammi della popolazione (Fig. 2). </li></ol> 4. Risultati rappresentativi Abbiamo quantificato pathway del segnale in risposta ad un ligando modello virale stimolando PBMC con il TLR7 / 8 ligando, R848 (Fig. 1). Abbiamo raccolto sia le immagini di localizzazione cellulare e statistiche della popolazione nei nostri gruppi del campione (Fig. 2). ImageStream ci permette di sottoinsiemi di cellule cancello direttamente da PBMC e le risposte cellulari immagini da popolazioni di cellule chiuse, ma non differenziati. Qui abbiamo quantificato l&#39;effetto di TLR signaling sulla localizzazione nucleare di NF-kB (p65) in Lin1-, CD4 dim, CD11c + DC mieloidi (MDC). Al basale, abbiamo osservato una percentuale elevata di cellule non stimolate con il fattore di trascrizione NF-kB (p65) nel citoplasma. Dopo la stimolazione, le cellule trattate hanno un punteggio di somiglianza significativamente più alta di NF-B (p65) con nucleare PI macchia, indicando che NF-kB (p65) traslocata nel nucleo dopo stimolazione (punteggio di somiglianza medi sono 1,52 e 3,01, rispettivamente, fig. 2). Risultati simili sono noti in TLR5 monociti stimolati 9. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3741/3741fig1.jpg" /> Figura 1. La colorazione e la strategia di gating per quantificare gli effetti di stimolazione sul MDC umani. Il fattore NF-kB trascrizione regola l&#39;espressione di numerosi geni del sistema immunitario. Questo studio misura la localizzazione nucleare di NF-kB (p65) in MDC da un soggetto rappresentante dopo TLR7 / 8 Liga<html> ND stimolazione. In-fuoco cellule singole sono stati identificati mediante gating il PI eventi positivi ad alta proporzioni nucleari (R1). MDC (Lin1-, CD4dim, CD11c +) erano gated in R3. Localizzazione nucleare di NF-kB (p65) è tracciata in R4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3741/3741fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3741/3741fig2.jpg" /> Figura 2. . Traslocazione di NF-kB in MDC dopo la stimolazione La traslocazione di NF-kB (p65) nel nucleo dopo la stimolazione (R4) è raffigurata in popolazioni di MDC non trattati e stimolato, il punteggio di similitudine mediana è 1,52 nel campione non trattato e 3,01 in il campione stimolata (A). Le immagini digitali raccolte contemporaneamente delle popolazioni di cellule non trattate o R848-stimolato presentano cellule rappresentative e l&#39;intensità del NF-B traslocata nel nucleo della cellula (B)._upload/3741/3741fig2large.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Clicca qui per ingrandire la figura.

<ol><li>Linton, P. J., Dorshkind, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+changes+in+lymphocyte+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Age-related changes in lymphocyte development and function.</a> Nat. Immunol. 5, 133-139 (2004).</li>
<li>Shaw, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysregulation+of+Human+Toll-like+Receptor+Function+in+Aging%5BTitle%5D)+AND+%22Ageing+Research+Reviews%22%5BJournal%5D)">Dysregulation of Human Toll-like Receptor Function in Aging.</a> Ageing Research Reviews. 10, 346-353 (2011).</li>
<li>Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptors+and+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptors and innate immunity.</a> Nature Rev. Immunol. 1, 135-145 (2001).</li>
<li>van Duin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-associated+Defect+in+Human+TLR1+Function+and+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Age-associated Defect in Human TLR1 Function and Expression.</a> J. Immunol. 178, 970-975 (2007).</li>
<li>Panda, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-associated+decrease+in+TLR+function+in+primary+human+dendritic+cells+predicts+influenza+vaccine+response%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Age-associated decrease in TLR function in primary human dendritic cells predicts influenza vaccine response.</a> J. Immunol. 184, 2518-2527 (2010).</li>
<li>Kong, K. -F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysregulation+of+TLR3+impairs+the+innate+immune+response+to+West+Nile+virus+in+the+elderly%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Dysregulation of TLR3 impairs the innate immune response to West Nile virus in the elderly.</a> J. Virol. 82, 7613-7623 (2008).</li>
<li>Qian, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+interferon+signaling+in+dendritic+cells+from+older+donors+infected+in+vitro+with+West+Nile+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Impaired interferon signaling in dendritic cells from older donors infected in vitro with West Nile virus.</a> J. Infect. Dis. 203, 1415-1424 (2011).</li>
<li>Hayden, M. S., Ghosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NF-kappaB+in+immunobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+research%22%5BJournal%5D)">NF-kappaB in immunobiology.</a> Cell research. 21, 223-244 (2011).</li>
<li>Qian, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-associated+elevation+in+TLR5+leads+to+increased+inflammatory+responses+in+the+elderly%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Age-associated elevation in TLR5 leads to increased inflammatory responses in the elderly.</a> Aging Cell. 11, 104-110 (2011).</li>
<li>George, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+measurement+of+nuclear+translocation+events+using+similarity+analysis+of+multispectral+cellular+images+obtained+in+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunological%22%5BJournal%5D)">Quantitative measurement of nuclear translocation events using similarity analysis of multispectral cellular images obtained in flow.</a> Journal of immunological. 311, 117-129 (2006).</li>
</ol>

Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

I passaggi critici in uso di ImageStream per gli studi traslazionali sono la selezione dei gruppi di confronto rilevanti e l&#39;ottimizzazione e la convalida delle specificità anticorpale. Le differenze tra i gruppi di soggetti nel bersaglio marcato saranno subito evidenti attraverso istogrammi e le immagini di cellule. In combinazione con un&#39;analisi approfondita dei cambiamenti nei recettori rilevanti e vie di segnalazione, questi dati forniranno informazioni preziose sui meccanismi che sono alla base disregolazio...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> Ficoll-Paque Plus. </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-1440-03 </td></tr><tr><td> R848 </td><td> Invivogen </td><td> tlrl-r848 </td></tr><tr><td> Paraformaldeide (16%) </td><td> Scienze della microscopia elettronica </td><td> 15710 </td></tr><tr><td> BD Perm / Wash </td><td> BD Biosciences </td><td> 554723 </td></tr><tr><td> CD14-PE </td><td> eBioscience </td><td> 12-0149-41 </td></tr><tr><td> CD4-PacBlue </td><td> BD Pharmingen </td><td> 68436 </td></tr><tr><td> Lineage cocktail 1 (lin 1)-FITC </td><td> BD Biosciences </td><td> 340546 </td></tr><tr><td> CD11c-PE </td><td> BD Biosciences </td><td> 347637 </td></tr><tr><td> CD123-PE </td><td> BD Biosciences </td><td> 340545 </td></tr><tr><td> coniglio anti-NF-kB (p65) </td><td> Santacruz </td><td> SC-372 </td></tr><tr><td> Alexa647 F (ab &#39;) 2 di capra anti-IgG di coniglio </td><td> Invitrogen </td><td> A21246 </td></tr><tr><td> DAPI </td><td> Invitrogen </td><td> D21490 </td></tr><tr><td> ImageStream X </td><td> Amnis </td><td></td></tr></tbody></table> Tabella 1. Reagenti e attrezzature specifiche. <table border="1"><tbody><tr><td> Tipo di cella </td><td> FITC </td><td> PE </td><td> Alexa 647 </td><td> PacBlue </td></tr><tr><td> Monociti </td><td></td><td> CD14 </td><td> NF-kB (p65) </td><td></td></tr><tr><td> mDC </td><td> Lin1 </td><td> CD11c </td><td> NF-kB (p65) </td><td> CD4 </td></tr><tr><td> pDC </td><td> Lin1</td><td> CD123 </td><td> NF-kB (p65) </td><td> CD4 </td></tr></tbody></table> Tabella 2. Pannello di anticorpi per la colorazione linea cellulare delle vie di segnalazione Monocyte: CD14 + MDC: Lin1-, CD4dim, CD11c + pDC: Lin1-, CD4dim, CD123 + Lin1 (lignaggio) comprende marker CD3, CD14, CD19, CD20, CD56 marcatori per i monociti, le cellule NK, le cellule T e B.

imaging quantitativa di lineage specifici toll-like receptor-mediate signaling in monociti e cellule dendritiche da piccoli campioni di sangue umano

Quantitative Imaging of Lineage-specific Toll-like Receptor-mediated Signaling in Monocytes and Dendritic Cells from Small Samples of Human Blood

Variazioni individuali nel determinare le risposte stato immunitario alle infezioni e contribuire alla gravità della malattia e il risultato. L&#39;invecchiamento è associato ad un aumento della suscettibilità alle infezioni virali e batteriche e diminuita capacità di risposta ai vaccini con un ben documentato calo umorale e cellulo-mediata 1,2 immune risposte. Abbiamo recentemente valutato gli effetti dell&#39;invecchiamento sulla recettori Toll-like (TLR), componenti chiave del sistema immunitario innato che rilevano l&#39;infezione microbica e di trigger antimicrobici risposte di difesa dell&#39;ospite 3. In un&#39;ampia coorte di donatori umani sani, abbiamo dimostrato che i monociti di sangue periferico di pazienti anziani hanno una ridotta espressione e la funzione di alcuni TLR 4 e simili livelli di TLR ridotti e le risposte di segnalazione nelle cellule dendritiche (DC), cellule presentanti l&#39;antigene che sono fondamentale nella il collegamento tra immunità innata e adattativa 5. Abbiamo dimostrato di disregolazione TLR3 nei macrofagi unod minore produzione di IFN da parte di DCS donatori anziani in risposta ad infezione da West Nile virus 6,7. Paramount alla nostra comprensione del immunosenescenza e di intervento terapeutico è una comprensione dettagliata di specifici tipi cellulari che rispondono e il meccanismo di (s) di trasduzione del segnale. Gli studi tradizionali di risposte immunitarie, attraverso l&#39;imaging di cellule primarie e marcatori cellulari di rilevamento di FACS o immunoblot hanno avanzato la nostra comprensione significativo, tuttavia, questi studi sono generalmente limitati tecnicamente dal volume piccolo campione a disposizione di pazienti e l&#39;incapacità di condurre complesse tecniche di laboratorio su più campioni umani. ImageStream combina citometria a flusso con quantitativa simultanea digitale ad alta risoluzione di immagini e quindi facilita indagine in popolazioni di cellule multiple contemporaneamente per una acquisizione efficace della sensibilità del paziente. Qui si dimostra l&#39;uso di ImageStream nei PVS per valutare TLR7 / 8attivazione-mediate aumento nella fosforilazione e traslocazione nucleare di un fattore di trascrizione chiave, NF-KB, che inizia la trascrizione di numerosi geni che sono critici per le risposte immunitarie 8. Grazie a questa tecnologia, abbiamo anche recentemente dimostrato una alterazione precedentemente non TLR5 di segnalazione e il pathway NF-kB nei monociti da donatori anziani, che possono contribuire a una risposta immunitaria alterata nell&#39;invecchiamento 9.

Descriviamo l&#39;uso della tecnologia ImageStream (<a href="http://www.amnis.com/" target="_blank"&gt; Www.amnis.com</a&gt;), Che combina quantitative citometria di flusso con simultanea alta risoluzione digital imaging, per quantificare i meccanismi cellulari di cellule immunitarie primarie da ben definiti coorti di pazienti. I nostri studi forniscono un modello per le indagini traslazionali quantificare lignaggio risposte specifiche cellulari a piccoli campioni di coorti di soggetti.

Imaging quantitativa di Lineage specifici Toll-like receptor-mediate Signaling in monociti e cellule dendritiche da piccoli campioni di sangue umano

Le variazioni individuali dello stato immunitario determinano le risposte all'infezione e contribuiscono alla gravità e all'esito della malattia. L'invecchiamento è associato a un...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è dimostrare l'utilizzo della tecnologia image stream per quantificare i meccanismi cellulari di cellule immunitarie primarie provenienti da coorti di pazienti ben definite. Questo viene raggiunto isolando innanzitutto le cellule mononucleate del sangue periferico, o pbmc, da campioni di sangue ottenuti da pazienti o da volontari sani. Dopo l'isolamento, le cellule vengono attivate e successivamente marcate con fluorescenza.Successivamente, le cellule vengono focalizzate idrodinamicamente, eccitate con luce laser e immaginate mediante integrazione temporale ritardata su una telecamera CCD. Infine, le immagini vengono acquisite utilizzando il citometro a flusso con acquisizione di immagini e la quantificazione di NF-kappa B.La traslocazione in ogni immagine cellulare viene eseguita utilizzando il software ideas. In definitiva, le differenze tra ciascun gruppo sperimentale possono essere determinate attraverso l'analisi di grafici a punti, istogrammi e immagini cellulari. Il vantaggio dell'immagine in flusso è che combina dati e immunofluorescenza.Siamo in grado di analizzare le vie di segnalazione cellulare in modo specifico per linea ce

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