Name: Diffusione laterale e esocitosi delle proteine di membrana in neuroni in coltura valutata utilizzando Recovery fluorescenza e fluorescenza-loss photobleaching (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 58 s
Description: Scopri la dinamica dell'inserimento di proteine neuronali nella membrana plasmatica utilizzando tecniche di fotobleaching e imaging in cellule vive. Questo metodo permette di visualizzare eventi di esocitosi in neuroni ippocampali in coltura.

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Siamo grati al Wellcome Trust e del CER per il sostegno finanziario. IMGG è un EMBO Fellow. KLH è un BBSRC finanziato dottorando. Ringraziamo Filippo Rubin e Patrick Tidball per il supporto cultura tecnica e la cella e il dottor Andrew Doherty per la manutenzione e l&#39;assistenza con i microscopi.

1. Coltura cellulare, la trasduzione virale, e l&#39;espressione proteica <ol><li> Cultura neuroni dell&#39;ippocampo ad alta densità da embrionali cuccioli di ratto al giorno 18 (E18) su poli-L-lisina rivestite con vetrini per 14-25 giorni in vitro (DIV). </li><li> 6-24 ore prima degli esperimenti dal vivo, le cellule con virus attenuato trasducono Sindbis contenenti la proteina di membrana di interesse, contrassegnati con il super-dell&#39;eclittica pHluorin (SEP). </li><li> Aggiungere il pseudovirione mezzo contenente direttamente al vetrino contenente 1 ml di mezzo condizionato e restituito al incubatore cultura. Il titolo e il tempo per l&#39;espressione proteica dopo trasduzione virale varierà a seconda del lotto virus e deve essere determinata per ciascuna partita prima di iniziare esperimenti cellule vive. </li></ol> 2. FRAP-FLIP Live Cell Imaging <ol><li> Attrezzature set-up <ol><li> Trasferire il vetrino alla camera di imaging di un Axiovert META Zeiss LSM 510 microscopio confocale.Per minimizzare le fluttuazioni di potenza durante l&#39;imaging, garantire il microscopio è stato attivato, con uscita laser 100%, per almeno 20 minuti prima di imaging. </li><li> Immediatamente, sostituire il mezzo di coltura con pre-riscaldato (37 ° C) Soluzione di registrazione extracellulare contenente 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 15 mM glucosio, 1.5 mM CaCl 2, 1,5 mM MgCl 2, 20-25 mM HEPES (pH regolato 7,4 con NaOH) e posizionare la camera di pre-riscaldato fase (37 ° C) del Zeiss Axiovert. Assicurarsi che l&#39;osmolarità della soluzione registrazione extracellulare viene regolata entro 10 mOsm del terreno di coltura. Purché non evaporazione significativa si verifica durante il periodo di tempo l&#39;esperimento, questa CO 2 soluzione indipendente è adatta per esperimenti di breve (&lt;10 ore). Completando con 1-2 mM di bicarbonato di sodio è consigliabile. </li></ol></li><li> Definire i parametri di imaging di cattura <ol><li> In primo luogo, identificare un neurone esprime il pro ricombinanteproteina di interesse e metterla a fuoco. </li><li> Con un olio 63x opposta, acquisire un&#39;immagine della cellula intera utilizzando 488nm eccitazione luce laser a bassa potenza laser. Per ridurre al minimo photobleaching, utilizzare una velocità elevata nominale (7-9) e la risoluzione pixel bassa (512-512) mantenendo la velocità di scansione totale &lt;1 secondo. </li><li> Selezionare una parte di dendrite di immagine e zoom per catturare un frame contenente il ROI (~ x 1,5-2,5 zoom ottico). Ove possibile, garantire il campo visivo contiene diversi processi modo che le misurazioni di dendriti di riferimento può essere ottenuta, per determinare se non specifico fotodegradazione dovuta all&#39;acquisizione sta avvenendo. </li><li> Regolare i filtri, il foro stenopeico, velocità di scansione e il guadagno del rivelatore a fluorescenza per consentire la massima dall&#39;eccitazione laser minimal ma con saturazione limitata. Un diametro foro di grandi dimensioni si consiglia, per massimizzare la raccolta di fotoni (2μm è adatta per spine e dei dendriti ternari). Il guadagno rilevatore dovrebbe essere abbastanza forte per rilevare piccoli incrementi di fluorescenza,tale che le prime immagini, prima della fotodecolorazione non superare il 10% di pixel saturi. </li><li> Salvare questa configurazione da utilizzare per la pre / post-candeggina e fasi di recupero dell&#39;esperimento. </li><li> Avanti definiscono le regioni fotosbiancante; la selezione di un ROI per il fotosbiancante iniziale e regioni fiancheggianti per la successiva fase photobleaching ripetitivo. Assicurarsi che le regioni fiancheggianti sono larghi abbastanza per prevenire il recupero per diffusione tra le scansioni (in genere 5 micron, vedi fig. 2). </li><li> Regolare i parametri di candeggina per entrambi ROI fotosbiancante. Il fotosbiancante iniziale deve essere rapida (0,1-0,5 secondi) richiedendo tra 1-5 iterazioni, a seconda del zoom ottico e il volume della ROI. Per le regioni fiancheggianti, l&#39;eccitazione laser dovrebbe essere regolato per garantire photobleaching continuo delle regioni fiancheggianti, ma senza danni fototossico. </li><li> Come linea guida, usiamo l&#39;eccitazione laser 100% per il fotosbiancante iniziale, e il 10% per il ph ripetitiva photobleachingase. </li></ol></li><li> Acquisizione di immagini <ol><li> Una volta che tutti i parametri sono stati impostati, eseguire l&#39;esperimento di FRAP-FLIP come una variabile di time-lapse sequenza di immagini, delineato nelle 4 blocchi di seguito: BLOCCO 1: 3-10 pre-candeggina le immagini di base, a bassa potenza del laser, nessun ritardo BLOCCO 2: fotosbiancante la ROI centrale a piena potenza del laser, 1-5 iterazioni BLOCCO 3: 3-10 post-candeggina immagini di ripristino BLOCCO 4: fotosbiancante ripetitiva di regioni fiancheggianti di potenza del laser di media con la cattura delle immagini in un intervallo di tempo tipico di 1 - 5 secondi, a seconda del tasso di recupero della proteina in esame. </li><li> Infine, sostituire la soluzione extracellulare di registrazione con una soluzione tamponata a pH 6 registrazione contenente 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 15mm glucosio, 1.5 mM CaCl 2, 1,5 mM MgCl 2, 20-25 mM MES (per spegnere fluorescenza) o integrato con 50 mM NH4Cl contenente 90 mM NaCl, 5 mM KCl, 15 mM di glucosio, 1,8 mM CaCl 2, 0,8 mMMgCl 2, 20-25 mM di HEPES, pH 7,4 (per rivelare le proteine ​​nei negozi di basso pH intracellulari), (vedi Fig. 2). </li><li> Raccogliere almeno 10 a 20 gruppi di dati di ciascuna proteina ricombinante, per consentire l&#39;analisi statistica. Per evitare risultati di polarizzazione, garantiscono condizioni di ripresa sono mantenuti coerenti in replica. Eliminare qualsiasi serie di dati incompleti, dove il candeggio, deviazioni significative sul piano focale o danni alle cellule fototossico siano rispettate. </li></ol></li></ol> 3. Analisi dei dati <ol><li> Aprire le immagini con il software ImageJ. </li><li> Allineare le pile per conto di piccole fluttuazioni nel piano xy che possono essersi verificati in tutta la serie temporale utilizzando il plugin Stackreg (plugins → stackreg → trasformazione: corpo rigido → <ok> ). </ok></li><li> Per le immagini scattate sul confocale Zeiss, utilizzare il plugin Toolbox LSM per segnalare i valori di tempo come un file di testo (plugins → LSM Strumenti → Mostra LSM Toolbox → <apply stamps=""> → <apply t-stamp=""> ),e importare questi valori in un foglio di analisi. </apply></apply></li><li> Per misurare le fluttuazioni di fluorescenza durante l&#39;esperimento di FRAP-FLIP, dividere il segmento fotodecolorate in regioni dei singoli pixel (circa 20pixels) e misurare la fluorescenza media di questi ROI in ogni punto (F). Per ottenere rapidamente questi valori, selezionare ROI multiple utilizzando lo strumento di analisi del ImageJ &#39;ROI Manager&#39; (Analizza → Strumenti → ROI Manager) e segnalare la fluorescenza media per pixel utilizzando la &#39;Plot asse Z profile&#39; di comando (Immagine → Stacks → Plot Z asse profilo). </li><li> Ripetere questo passaggio per misurare l&#39;intensità di fluorescenza di uno, regione di sfondo non fluorescente. </li><li> Normalizzare l&#39;intensità di fluorescenza ad ogni tempo sottraendo i valori di fondo per rimuovere il rumore sperimentale, e dividere tutti i valori dalla media pre-sbiancato misura basale. </li><li> Misurare l&#39;intensità di fluorescenza adiacenti non fotodecolorate dendriti per valutare il livello di non-specificaphotobleaching durante l&#39;acquisizione. Correzione per il non-specifica photobleaching è sconsigliato per l&#39;interpretazione di &#39;FRAP-FLIP&#39; dei dati e deve essere evitato quando è possibile. </li><li> Per calcolare se il recupero significativo ha avuto luogo in una ROI, sottrarre la media degli ultimi provvedimenti 5-10 della sequenza dalla media delle prime misure 5-10 (Af) e determinare la significatività statistica. Categorizzare il ROI di recupero e non di recupero per valutare la configurazione della esocitosi (hotspot esocitosi cioè o di recupero vs spina dorsale dell&#39;albero). </li></ol> 4. Risultati rappresentativi Il risultato di tipica FRAP FLIP-esperimento è mostrato in fig. 2. Qui, un neurone che esprime il GluA2 subunità del recettore del glutammato di tipo AMPA, con etichetta settembre è stata selettivamente fotodecolorate lungo una regione di dendrite. Fig 2.A illustra la regione di dendrite che è stato ripreso e indica la ROI che sono state selezionate per fotodecolorazione (regioni riquadro bianco). The ampio spazio bianco in scatola è stata sbiancata volta, seguita da ripetitivo sbiancamento delle regioni fiancheggianti in scatola, evidenziati con una freccia doppia blu. La freccia rossa indica la ROI misurato, mostrata in alto ingrandimento nei pannelli inferiori. Fig. 2.B, mostra l&#39;intensità di fluorescenza nella ROI misurata nel corso del tempo dell&#39;esperimento. In questo esempio, un periodo di recupero uno minuti è stata registrata dopo il fotosbiancante iniziale per consentire recettori greggio di entrare nel ROI per diffusione laterale. Quando le regioni fiancheggianti sono fotodecolorate, il segnale di fluorescenza da questa frazione altamente mobili di recettori è occluso dalla regione centrale, e quelli nella regione vengono diluiti out. L&#39;aumento della fluorescenza (Af), osservato per la sequenza di &#39;FLIP&#39; può quindi essere attribuita a inserimento di SEP-GluA2 nel vano dendritica. Il lavaggio pH basso e pH 7,4 + aggiunta NH4Cl rispettivamente confermare che la fluorescenza misurata è derivato dalla superficieproteine ​​e rivelano la proporzione di proteine ​​intracellulari, sequestrati all&#39;interno del ROI misurato. In contrasto FRAP, questa metodologia isolati recupero a causa di esocitosi, risultante in un livello molto ridotto di recupero fluorescenza nella regione fotodecolorate. Ad oggi nessun modello matematico affidabile è stato sviluppato per adattarsi e analizzare il recupero tracciati registrati con questa tecnica selettiva sbiancante. E &#39;comunque possibile inserire la traccia di recupero con una ripresa mono esponenziale: F (t) = A s - A 0 e (-t / τ) Dove F (t) è fluorescenza al tempo t, s è un valore di stato stazionario, A è l&#39;offset 0 al tempo 0, τ è la costante di tempo. La crescita di recupero è fissato con un dato tasso di raggiungere un equilibrio, corrispondente ad uno stato stabile tra l&#39;inserimento e la diffusione. È importante sottolineare che la costante di tempo estratto da questo unNALISI non riflette la costante di tempo di esocitosi e può essere utilizzato solo per trattamenti comparativi per una singola proteina. Inoltre, il profilo previsto di recupero fluorescenza può essere osservato in sottodomini lungo la regione fotodecolorate. Analisi del ROI piccola all&#39;interno di un segmento fotodecolorate può essere essenziale per rivelare esocitosi &quot;hotspots&quot;, ed è consigliabile analizzare regioni di lunghezze comparabili come la variabilità della densità di questi luoghi tra i dendrite influirà sul tasso calcolato. Fig 3 mostra un prolungamento di questo protocollo, applicando il fotosbiancante di ROI sezione più grande con dendriti nel campo di vista, seguito da sbianca ripetitiva selettiva di uno solo dendrite. Questo approccio consente tradizionale &#39;FRAP&#39; e &#39;FRAP-FLIP&#39; dati che devono essere acquisiti in parallelo. In questo esempio, i neuroni dell&#39;ippocampo sono stati infettati con una subunità del recettore del glutammato della classe kainate; settembre-tagged GluK2. Prior per imaging, questi neuroni sono stati trattati con cylcohexamide (2 ore a 200μg/ml), per bloccare la sintesi proteica. Come tale, il recupero di fluorescenza nella ROI in questione misurata (Fig 3.B) rivela la percentuale di recupero a causa di diffusione laterale e riciclaggio nel dendrite FRAP standard di rispetto al riciclaggio solo nel dendrite sottoposto al &#39;FRAP-FLIP&#39; protocollo. Confrontando i valori Af dal FRAP contro &#39;FRAP-FLIP&#39; curve di recupero, i contributi relativi di riciclaggio (Af rec = 11,05%) rispetto laterali diffusione (Af diff = 9,35%) si può dedurre. A differenza di figura 2, il recupero non mantiene un livello di stato stazionario, ma piuttosto, a causa l&#39;inibizione della sintesi proteica, mostra un aumento transitorio e conseguente calo dei segnali, corrispondente esaurimento del pool recettore disponibile (circa il 20% diminuzione osservata nel periodo di registrazione). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3747/3747fig1.jpg" /></p&gt; Figura 1. Schematica dei principi di FRAP vs FRAP-FLIP protocolli Questo schema illustra i risultati di un protocollo di FRAP regolare rispetto a &#39;FRAP-FLIP&#39;, usando sep-tagged recettori. Recupero fluorescenza in FRAP tradizionale viene visualizzata sulla sinistra. Misurato il recupero di fluorescenza nella centralissima ROI è attribuito ad una combinazione di laterali di diffusione f recettori SEP-tag non-fotodecolorate al di fuori del ROI fotodecolorate e l&#39;inserimento di recettori attraverso il riciclaggio e / o de novo esocitosi nel pozzo dendritica. Al contrario, la fotodecolorate ripetitiva del ROI accompagnamento illustrato nella destra, mostra come questa modifica &#39;FRAP-FLIP&#39; protocollo di silenzi recupero a causa di diffusione laterale. Come tale, qualsiasi recupero fluorescenza misurata può essere attribuito al inserimento diretto nella ROI. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3747/3747fig2.jpg" /> Figura 2.Inserimento di SEP-GluA2 nella membrana plasmatica sull&#39;albero dendritico A) Un neurone dell&#39;ippocampo esprime SEP-GluA2, selettivamente fotodecolorate lungo una regione di dendrite. Lo schema illustra la regione di dendrite che è stato ripreso, mentre il pannello superiore sinistra evidenzia la ROI che sono state selezionate per photobleaching. La grande area bianca in scatola è stata sbiancata volta, seguita da ripetitivo sbiancamento delle regioni fiancheggianti in scatola, evidenziati con una freccia doppia blu. Questo pannello mostra la dendrite prima photobleaching. La freccia rossa indica la ROI misurato, mostrata in alto ingrandimento nei pannelli inferiori. B) mostra l&#39;intensità di fluorescenza della ROI misurata nel corso del tempo dell&#39;esperimento, tracciati come livello di grigio della ROI (non normalizzato). La freccia nera evidenziare la timepoint del fotosbiancante iniziale e freccia verde indica l&#39;inizio del photobleaching ripetitivo. Af indica °e aumento della fluorescenza osservata nel corso del periodo di recupero, grazie all&#39;inserimento di settembre-GluA2 nel pozzo dendritica. Successivamente pH basso e pH 7,4 + NH 4 Cl lavaggi confermare che la fluorescenza recuperato riguarda superficie recettori espressi. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3747/3747fig3.jpg" /> Figura 3. Riciclaggio Riciclaggio e laterali vs diffusione del SEP-GluK2 sull&#39;albero dendritico in seguito al trattamento cyclohexamide A) Un neurone dell&#39;ippocampo esprime SEP-GluK2, selettivamente fotodecolorate con FRAP parallelo e &#39;FRAP-FLIP&#39; protocolli di recupero eseguiti lungo separata ROI dendritica. Il neurone è stato oggetto di pretrattamento con cyclohexamide, per bloccare la sintesi proteica (2 ore a 200 pg / ml). Lo schema illustra la regione di dendrite che è stato ripreso, mentre il pannello di sinistra evidenziando la ROI che sono state selezionate per photobleaching. The ampio spazio bianco in scatola è stata sbiancata volta, seguita da ripetitivo sbiancamento delle regioni fiancheggianti in scatola, del dendrite inferiore solo, evidenziata con una freccia doppia blu. Questo pannello mostra i dendriti prima photobleaching. Le frecce rosse evidenziare il ROI mostrato in alto ingrandimento in B) che illustra il recupero di fluorescenza in FRAP tradizionale contro il protocollo del &#39;FRAP-FLIP&#39;. Il confronto dei livelli di intensità di fluorescenza nella fase tardiva di recupero (pannelli terzi) mostrano il contributo di diffusione laterale e riciclaggio rispetto riciclaggio sola. C) mostra l&#39;intensità di fluorescenza della ROI misurata nel corso del tempo dell&#39;esperimento, tracciate come intensità normalizzate valori. La freccia nera evidenziare la timepoint del fotosbiancante iniziale e freccia verde indica l&#39;inizio del photobleaching ripetitivo. Af rec indica il recupero transitorio dovuto al riciclaggio recettore, determinato dal FRAP / FLIP dendrite mentre Afdiff misura il contributo di diffusione laterale della SEP-GluK2 nel pozzo dendritica nella &#39;FRAP solo&#39; ROI. L&#39;aumento transitorio è seguita da graduale diminuzione del segnale, corrispondente alla corsa verso il basso di recettori disponibili a seguito di trattamento cyclohexamide. Il pH basso e successiva pH 7,4 + NH 4 Cl lavaggi confermare che la fluorescenza recuperato riguarda superficie recettori espressi.

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</ol>

Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

Abbiamo descritto una strategia innovativa per visualizzare le componenti di traffico proteina di membrana plasmatica. L&#39;approccio combinatorio di photobleaching tecniche con proteine ​​SEP-tag permette selettivamente l&#39;inserimento della membrana plasmatica eventi da valutare. Continuamente photobleaching le proteine ​​di membrana nelle regioni fiancheggianti durante il recupero, il metodo &#39;FRAP-FLIP&#39; valuta il contributo del traffico vescicolare al recupero fluorescenza. Questo nuovo approccio permette la registrazione diretta di inserimento proteina di membrana, permettendo sia il numero di sotto-compartimenti dove si osserva il recupero e l&#39;ampiezza del recupero (Af) allo stato stazionario da determinare. Inoltre, il confronto di FRAP con e senza FLIP permette la percentuale di recupero imputabile diffusione laterale da calcolare. Inoltre, nello stesso esperimento, le regioni di non-fotodecolorate dendrite adiacente alle regioni fiancheggianti fotodecolorate può esserequalitativamente valutati durante il recupero, la perdita di fluorescenza osservata in queste regioni sarà a causa della diffusione laterale dei recettori fotodecolorate in questi non-fotodecolorate segmenti del dendrite. Questo protocollo selettivo photobleaching può essere utilizzato per indagare su una serie di processi cellulari come il traffico che caratterizza excocytosis nella membrana plasmatica nelle sottozone definite (ad esempio, dendriti e spine) FRAP o valutare il contributo di inserimento laterale vs diffusione conducendo FRAP parallelo e &#39; -FLIP &#39;protocolli lungo dendriti adiacenti (Fig. 3). Chiaramente, mentre le linee guida specifiche sono state presentate, ogni laboratorio sarà necessario ottimizzare i parametri di imaging in base agli esemplari ed attrezzature specifiche. È importante sottolineare che tutti i recettori di superficie della ROI devono essere fotodecolorate, indipendente dal asse z piano focale, ma senza danni significativi fototossico o non-specifici photobleaching. NoiERS deve esercitare cautela quando si tenta questo protocollo al soma cella, come l&#39;alta percentuale di compartimenti pH relativamente bassi intracellulari genere si traduce in fluorescenza di fondo ad alto contenuto di queste regioni. Inoltre, mentre abbiamo dimostrato come questa tecnica può essere applicata in svariati modi, prima di iniziare selettivi photobleaching esperimenti su un nuovo SEP-tagged costruire, vi consigliamo una prima caratterizzazione dei recettori tag viene prima effettuata, come descritto da Ashby et al 2. In generale, questo metodo è un adattamento potente e versatile del protocollo FRAP standard, consentendo eventi di inserzione in membrana plasmatica da valutare in tempo reale.

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strongNome&gt; del reagente</strong</td&gt;<td<strong&gt; Azienda</strong</td&gt;<td<strong&gt; Numero di catalogo</strong</td&gt;<td<strong&gt; Commenti (opzionale)</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Coprioggetto di vetro 24mm</td&gt;<td&gt; VWR International</td&gt;<td&gt; 631-0161</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Poly-L-lisina</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; P2636</td&gt;<td&gt; 1mg/ml in tampone borato per coprioggetti cappotto</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Medio Neurobasal</td&gt;<td&gt; Invitrogen</td&gt;<td&gt; 21.103</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; B27</td&gt;<td&gt; Invitrogen</td&gt;<td&gt; 17504-044</td&gt;<td&gt; 2% in placcatura neuronale e alimentazione medie</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Penicillina Streptomicina</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; P0781</td&gt;<td&gt; 1% in media placcatura neuronale e l&#39;alimentazione</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; L-Glutammina</td&gt;<td&gt; Invitrogen</td&gt;<td&gt; 25.030</td&gt;<td&gt; 2mm / 0,8 mm in placcatura / alimentazione media</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Horse Serum</td&gt;<td&gt; Biosera</td&gt;<td&gt; DH-291H</td&gt;<td&gt; 10% in terreni in piastra neuronali solo</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; PSIN ReP5 vettore di clonazione</td&gt;<td&gt; Invitrogen</td&gt;<td&gt; K75001</td&gt;<td&gt; Per la produzione di virus Sindbis</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; LSM510 sistema META confocale</td&gt;<td&gt; Zeiss</td&gt;<td&gt;</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Immagine J Software</td&gt;<td&gt; NIH</td&gt;<td&gt;</td&gt;<td&gt; Software di accesso aperto. Tutti i plugin qui descritti sono disponibili all&#39;indirizzo<a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/"&gt; Http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/</a</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

diffusione laterale e esocitosi delle proteine ​​di membrana in neuroni in coltura valutata utilizzando recovery fluorescenza e fluorescenza-loss photobleaching

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

<p class="jove_content"&gt; Proteine ​​di membrana, quali recettori e canali ionici subiscono traffico attivo nei neuroni, che sono altamente polarizzato e morfologicamente complesso. Il traffico diretto è di fondamentale importanza per fornire, mantenere o eliminare le proteine ​​sinaptiche.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Super-dell&#39;eclittica pHluorin (SEP) è un pH-sensibile al derivato di eGFP che è stato ampiamente utilizzato per l&#39;imaging cellulare dal vivo di proteine ​​di membrana plasmatica<sup&gt; 1-2</sup&gt;. A pH basso, protonazione di SEP diminuisce l&#39;assorbimento di fotoni ed elimina emissione di fluorescenza. Come eventi di traffico più intracellulari si verificano in scompartimenti con pH basso, dove viene eclissato settembre fluorescenza, il segnale di fluorescenza dal set-tag proteine ​​è prevalentemente dalla membrana plasmatica, dove è esposto il settembre ad un ambiente extracellulare pH neutro. Quando viene illuminato a settembre ad alta intensità, come ogni colorante fluorescente, è irreversibile fotodanneggiata (fotodecolorate)<sup&gt; 3-5</sup&gt;. È importante sottolineare che, poiché pH basso placa l&#39;assorbimento di fotoni, in superficie espressa settembre può essere fotodecolorate settembre intracellulare, mentre non è influenzato dalla illuminazione ad alta intensità<sup&gt; 6-10</sup&gt;.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; FRAP (recupero di fluorescenza dopo photobleaching) di set-tagged proteine ​​è una tecnica utile e potente per la valutazione delle dinamiche di proteine ​​a livello della membrana plasmatica. Quando le proteine ​​fluorescenti sono contrassegnati fotodecolorate in una regione di interesse (ROI) il recupero della fluorescenza si verifica a causa del movimento delle proteine ​​gregge SEP-tag nella regione sbiancato. Questo può avvenire per diffusione laterale e / o da esocitosi di non-fotodecolorate recettori fornita tramite<em&gt; De novo</em&gt; Sintesi o riciclo (vedi fig. 1). La frazione di proteina immobile e mobile può essere determinato e la mobilità e la cinetica della frazione diffusibile può essere interrogato in condizioni basali e stimolati, come l&#39;applicazione agonista o stimoli attivazione neuronale come NMDA o KCl domanda<sup&gt; 8,10</sup&gt;.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Si descrivono tecniche fotodecolorazione progettate per visualizzare selettivamente il recupero di fluorescenza attribuibile esocitosi. In breve, un ROI è fotodecolorate una volta, come con i protocolli standard FRAP, seguita, dopo una breve ripresa, con ripetitiva sbiancamento delle regioni fiancheggianti. Questo protocollo &#39;FRAP-FLIP&#39;, sviluppato nel nostro laboratorio, è stato utilizzato per caratterizzare il traffico dei recettori AMPA a spine dendritiche<sup&gt; 10</sup&gt;, Ed è applicabile ad una vasta gamma di studi di traffico per valutare il traffico intracellulare e esocitosi.</p

Questo rapporto descrive l&#39;uso di imaging cellulare dal vivo e le tecniche di fotosbiancante per determinare l&#39;espressione di superficie, vie di trasporto e la cinetica di traffico esogeno espresso, sensibile al pH GFP-tagged proteine ​​a livello della membrana plasmatica dei neuroni.

Diffusione laterale e esocitosi delle proteine ​​di membrana in neuroni in coltura valutata utilizzando Recovery fluorescenza e fluorescenza-loss photobleaching

Le proteine di membrana, come i recettori e i canali ionici, sono soggette a un traffico attivo nei neuroni, che sono altamente polarizzati e morfologicamente complessi. Questo ...

L'obiettivo generale di questa procedura è visualizzare l'inserzione nella membrana plasmatica di proteine neuronali. Questo viene ottenuto innanzitutto infettando neuroni ippocampali in coltura con il virus sindbis per esprimere la proteina di interesse, che è marcata con super eclittico, florina o sep. Successivamente, una regione di interesse, o ROI, viene sbiancata fotochimicamente.Successivamente, i segmenti laterali vengono ripetutamente sottoposti a fotobleaching mentre alla regione di interesse originale è consentito di ripristinare la fluorescenza. Infine, viene analizzato il recupero della fluorescenza nella regione di interesse. In definitiva, questa variante degli esperimenti FRAP convenzionali viene utilizzata per mostrare il modello di eventi di esocitosi della proteina bersaglio nella membrana plasmatica.Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la bio-tonazione superficiale o l'alimentazione con anticorpi, è che consente di visualizzare la dinamica degli eventi di inserimento nella membrana. Questi metodi possono contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo del traffico proteico, come dove e come avvengono gli eventi di esocitosi. Ebbi per la prima volta l'idea di questo metodo quando stavo cercando un'alternativa al turfe-aging, al fine di poter studiare gli eventi di esocitosi nelle spine dendritiche in esperimenti su cellule vive. Per iniziare, coltivare neuroni ippocampali ad alta densità provenienti da cuccioli al diciottesimo giorno embrionale su coprivetri rivestiti con polilisina per un periodo di 14-25 giorni in vitro, da 6 a 24 ore prima dell'esperimento su cellule vive.Trasduci le cellule con il virus symbis che codifica per la proteina di membrana di interesse, marcata con il fluoroforo eclittico SUP osep. Aggiungi il pseudovirione, contenente mezzo, direttamente sul coverslip contenente un millilitro di mezzo condizionato e rimetti le cellule nell'incubatore per la coltura. Per l'acquisizione delle immagini, accendi un microscopio confocale Zeiss Axio Vert LSM 510 Meta con uscita laser al 100% per almeno 20 minuti prima dell'acquisizione.Per ridurre al minimo le fluttuazioni di potenza durante l'acquisizione delle immagini e preriscaldare il piatto. Quando il microscopio è pronto, selezionare l'obiettivo 63x, quindi trasferire il vetrino coprioggetto nella camera di acquisizione e sostituire immediatamente il mezzo di coltura con soluzione di registrazione extracellulare preriscaldata.Posizionare la camera sul palchetto del microscopio preriscaldato. L'aspetto più difficile di questa procedura consiste nell'assicurare che lo stato di salute delle cellule non venga compromesso durante il processo di acquisizione. Poiché questo protocollo richiede un intenso sbiancamento fotoindotto per garantirne il successo, verificare che tutti i parametri di acquisizione siano ottimizzati prima di iniziare esperimenti su larga scala e privilegiare un'acquisizione rapida rispetto a immagini di alta qualità.Per definire i parametri di acquisizione dell'immagine, identificare un neurone che esprime una proteina ricombinante di interesse e metterlo a fuoco. Scansionare l'intera cellula utilizzando un laser a 488 nanometri a bassa potenza, per minimizzare il fotobiancamento.Utilizzare una velocità nominale elevata e una risoluzione dei pixel bassa. Mantenere la velocità totale di scansione inferiore a un secondo. Selezionare una porzione del dendrite da immagine e utilizzare un ingrandimento ottico compreso tra 1,5 e 2,5.Acquisire un fotogramma contenente la regione di interesse per determinare se si verifica un'illuminazione fotostatica non specifica. Provare a garantire che il campo visivo contenga diversi processi in modo da poter ottenere misurazioni da dendriti di riferimento. Utilizzando una tavolozza indicatrice di intervallo, regolare i parametri di acquisizione immagini per consentire una fluorescenza massima con un'eccitazione laser minima, ma con saturazione limitata.Si consiglia un diametro del pinhole di grandi dimensioni per massimizzare la raccolta di fotoni. Il guadagno del rivelatore deve essere sufficientemente elevato da rilevare piccoli incrementi di fluorescenza, in modo che le prime immagini acquisite prima del fotoblesamento non superino il 10% di pixel saturi. Regolare la messa a fuoco per assicurare che venga raggiunto il piano focale mediano.Dopo aver impostato la configurazione, salvarla per utilizzarla nelle fasi di recupero pre e postle dell'esperimento. Successivamente, definire le regioni di fotobleaching. Selezionando una regione di interesse (ROI) per il fotobleaching iniziale e regioni laterali per la fase successiva di fotobleaching ripetitivo.Per la foto-sbiancatura iniziale, sia la ROI centrale che quelle laterali verranno foto-sbiancate. Per la foto-sbiancatura ripetitiva, invece, vengono selezionate solo le ROI laterali. Assicurarsi che le regioni laterali siano abbastanza ampie da impedire il recupero per diffusione tra una scansione e l'altra.Regolare i parametri di sbiancamento per entrambe le aree di interesse (ROI) da fotobleachare. Lo sbiancamento iniziale deve essere rapido e richiede da una a cinque iterazioni, a seconda dell'ingrandimento ottico e del volume dell'area di interesse (ROI). Per le regioni laterali, l'eccitazione laser deve essere regolata per garantire uno sbiancamento continuo, ma senza causare danni fototossici. Una volta impostati i parametri, eseguire un esperimento FRA flip come sequenza temporale a intervalli variabili, acquisendo innanzitutto da tre a dieci immagini di base pre-bleach con potenza laser bassa e senza ritardo temporale.Successivamente, effettuare il fotoblanco della regione centrale di interesse (ROI) alla massima potenza del laser per uno a cinque iterazioni. Quindi acquisire da tre a dieci immagini di recupero post fotoblanco. Eseguire un fotoblanco ripetitivo delle regioni laterali con potenza media del laser, acquisendo le immagini a un intervallo di tempo tipico compreso tra uno e cinque secondi, a seconda della velocità di recupero della proteina in esame.Infine, per eliminare la fluorescenza, sostituire la soluzione extracellulare di registrazione con una soluzione tampone a pH sei oppure, per rivelare la proteina nei depositi intracellulari a basso pH, utilizzare un tampone arricchito con cloruro di ammonio 50 millimolari. Raccogliere almeno da 10 a 20 set di dati per ciascuna proteina ricombinante al fine di consentire un'analisi statistica che eviti risultati distorti; assicurarsi che le condizioni di acquisizione delle immagini siano mantenute costanti tra i replicati. Per analizzare le immagini, aprirle.Utilizzando il software ImageJ, allineare gli stack per compensare le piccole fluttuazioni nel piano XY che potrebbero essersi verificate durante la serie temporale. Per immagini acquisite con un microscopio confocale ZES, utilizzare il plugin stack reg insieme al plugin LSM toolbox per esportare i valori temporali in un file di testo e importare tali valori in un foglio di calcolo per analizzare le fluttuazioni della fluorescenza. Durante l'esperimento FRA flip, suddividere il segmento di fotobleaching in regioni individuali di pixel utilizzando lo strumento di analisi Image ROI Manager per selezionare più ROI.Successivamente, utilizzare il comando profilo dell'asse Z del grafico per misurare la fluorescenza media per pixel in ogni punto temporale. Ripetere il processo per misurare l'intensità media della fluorescenza di una regione di fondo non fluorescente. Normalizzare l'intensità della fluorescenza in ogni punto temporale sottraendo i valori di fondo per eliminare il rumore sperimentale e dividere tutti i valori per la misura media del valore iniziale pre-bleaching o per il valore immediatamente successivo al bleaching.Esaminare il tracciato di recupero per ciascuna ROI in funzione del tempo per determinare se è avvenuto un recupero significativo. In una ROI, calcolare il delta F sottraendo la media delle prime cinque-dieci misure della sequenza di recupero dopo la fotobleach dalla media delle ultime cinque-dieci misure. Quindi, determinare la significatività statistica del delta F e caratterizzare le ROI con recupero e quelle senza recupero per valutare il modello di esocitosi.Questi sono i punti caldi dell'esocitosi o il recupero tra spina e asse. Questo video mostra il risultato rappresentativo di un tipico esperimento FRAP FLIP utilizzando la colla SERP. Una due.Una regione del dendrite viene sottoposta a foto-sbiancamento una sola volta, seguita da un periodo di recupero di un minuto. Successivamente viene avviato il foto-sbiancamento ripetitivo delle regioni laterali, indicato dalle frecce blu. La freccia rossa evidenzia una piccola regione di interesse in cui viene osservato il recupero della fluorescenza, mostrato ingrandito nel pannello destro dello schermo.Il recupero è monitorato nel grafico sottostante, con un aumento complessivo della fluorescenza indicato come delta F. L'aumento della fluorescenza osservato durante questa sequenza può essere attribuito all'inserzione della colla A due nel tratto dendritico. I grandi cambiamenti nell'intensità della fluorescenza alla fine dell'esperimento mostrano l'effetto dei lavaggi a pH basso e a pH 7,4 in presenza di cloruro di ammonio sul segnale di fluorescenza di sep. In questo esempio, i neuroni sono stati infettati con la colla SEP K due.Qui, un'area di interesse (ROI) di grandi dimensioni contenente numerosi dendriti nel campo visivo è stata sottoposta a fotobleaching, seguita da un fotobleaching ripetitivo selettivo di un singolo dendrite. Questi neuroni sono stati trattati con cicloesimide per due ore prima dell'acquisizione delle immagini, al fine di bloccare la sintesi proteica. Pertanto, il recupero della fluorescenza nelle rispettive aree di interesse misurate rivela la proporzione di recupero dovuta alla diffusione laterale e al riciclo nel dendrite standard sottoposto a protocollo FRAP, rispetto al solo riciclo nei dendriti sottoposti al protocollo FRAP-FLIP.Confrontando i valori di delta F delle curve di recupero FRAP e FRAP flip, è possibile dedurre i contributi relativi del riciclo rispetto alla diffusione laterale a causa dell'inibizione della sintesi proteica. Il recupero mostra un successivo calo del segnale man mano che il pool disponibile di recettori si esaurisce. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come impostare, eseguire e analizzare esperimenti di imaging con successo nei neuroni.Utilizzando questa combinazione di tecniche di fotobleaching, è possibile studiare le evidenze di inserimento nella membrana per la proteina di interesse.

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