Diffusione laterale e esocitosi delle proteine ​​di membrana in neuroni in coltura valutata utilizzando Recovery fluorescenza e fluorescenza-loss photobleaching

L'obiettivo generale di questa procedura è visualizzare l'inserzione nella membrana plasmatica di proteine neuronali. Questo viene ottenuto innanzitutto infettando neuroni ippocampali in coltura con il virus sindbis per esprimere la proteina di interesse, che è marcata con super eclittico, florina o sep. Successivamente, una regione di interesse, o ROI, viene sbiancata fotochimicamente.

Successivamente, i segmenti laterali vengono ripetutamente sottoposti a fotobleaching mentre alla regione di interesse originale è consentito di ripristinare la fluorescenza. Infine, viene analizzato il recupero della fluorescenza nella regione di interesse. In definitiva, questa variante degli esperimenti FRAP convenzionali viene utilizzata per mostrare il modello di eventi di esocitosi della proteina bersaglio nella membrana plasmatica.

Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la bio-tonazione superficiale o l'alimentazione con anticorpi, è che consente di visualizzare la dinamica degli eventi di inserimento nella membrana. Questi metodi possono contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo del traffico proteico, come dove e come avvengono gli eventi di esocitosi. Ebbi per la prima volta l'idea di questo metodo quando stavo cercando un'alternativa al turfe-aging, al fine di poter studiare gli eventi di esocitosi nelle spine dendritiche in esperimenti su cellule vive. Per iniziare, coltivare neuroni ippocampali ad alta densità provenienti da cuccioli al diciottesimo giorno embrionale su coprivetri rivestiti con polilisina per un periodo di 14-25 giorni in vitro, da 6 a 24 ore prima dell'esperimento su cellule vive.

Trasduci le cellule con il virus symbis che codifica per la proteina di membrana di interesse, marcata con il fluoroforo eclittico SUP osep. Aggiungi il pseudovirione, contenente mezzo, direttamente sul coverslip contenente un millilitro di mezzo condizionato e rimetti le cellule nell'incubatore per la coltura. Per l'acquisizione delle immagini, accendi un microscopio confocale Zeiss Axio Vert LSM 510 Meta con uscita laser al 100% per almeno 20 minuti prima dell'acquisizione.

Per ridurre al minimo le fluttuazioni di potenza durante l'acquisizione delle immagini e preriscaldare il piatto. Quando il microscopio è pronto, selezionare l'obiettivo 63x, quindi trasferire il vetrino coprioggetto nella camera di acquisizione e sostituire immediatamente il mezzo di coltura con soluzione di registrazione extracellulare preriscaldata.

Posizionare la camera sul palchetto del microscopio preriscaldato. L'aspetto più difficile di questa procedura consiste nell'assicurare che lo stato di salute delle cellule non venga compromesso durante il processo di acquisizione. Poiché questo protocollo richiede un intenso sbiancamento fotoindotto per garantirne il successo, verificare che tutti i parametri di acquisizione siano ottimizzati prima di iniziare esperimenti su larga scala e privilegiare un'acquisizione rapida rispetto a immagini di alta qualità.

Per definire i parametri di acquisizione dell'immagine, identificare un neurone che esprime una proteina ricombinante di interesse e metterlo a fuoco. Scansionare l'intera cellula utilizzando un laser a 488 nanometri a bassa potenza, per minimizzare il fotobiancamento.

Utilizzare una velocità nominale elevata e una risoluzione dei pixel bassa. Mantenere la velocità totale di scansione inferiore a un secondo. Selezionare una porzione del dendrite da immagine e utilizzare un ingrandimento ottico compreso tra 1,5 e 2,5.

Acquisire un fotogramma contenente la regione di interesse per determinare se si verifica un'illuminazione fotostatica non specifica. Provare a garantire che il campo visivo contenga diversi processi in modo da poter ottenere misurazioni da dendriti di riferimento. Utilizzando una tavolozza indicatrice di intervallo, regolare i parametri di acquisizione immagini per consentire una fluorescenza massima con un'eccitazione laser minima, ma con saturazione limitata.

Si consiglia un diametro del pinhole di grandi dimensioni per massimizzare la raccolta di fotoni. Il guadagno del rivelatore deve essere sufficientemente elevato da rilevare piccoli incrementi di fluorescenza, in modo che le prime immagini acquisite prima del fotoblesamento non superino il 10% di pixel saturi. Regolare la messa a fuoco per assicurare che venga raggiunto il piano focale mediano.

Dopo aver impostato la configurazione, salvarla per utilizzarla nelle fasi di recupero pre e postle dell'esperimento. Successivamente, definire le regioni di fotobleaching. Selezionando una regione di interesse (ROI) per il fotobleaching iniziale e regioni laterali per la fase successiva di fotobleaching ripetitivo.

Per la foto-sbiancatura iniziale, sia la ROI centrale che quelle laterali verranno foto-sbiancate. Per la foto-sbiancatura ripetitiva, invece, vengono selezionate solo le ROI laterali. Assicurarsi che le regioni laterali siano abbastanza ampie da impedire il recupero per diffusione tra una scansione e l'altra.

Regolare i parametri di sbiancamento per entrambe le aree di interesse (ROI) da fotobleachare. Lo sbiancamento iniziale deve essere rapido e richiede da una a cinque iterazioni, a seconda dell'ingrandimento ottico e del volume dell'area di interesse (ROI). Per le regioni laterali, l'eccitazione laser deve essere regolata per garantire uno sbiancamento continuo, ma senza causare danni fototossici. Una volta impostati i parametri, eseguire un esperimento FRA flip come sequenza temporale a intervalli variabili, acquisendo innanzitutto da tre a dieci immagini di base pre-bleach con potenza laser bassa e senza ritardo temporale.

Successivamente, effettuare il fotoblanco della regione centrale di interesse (ROI) alla massima potenza del laser per uno a cinque iterazioni. Quindi acquisire da tre a dieci immagini di recupero post fotoblanco. Eseguire un fotoblanco ripetitivo delle regioni laterali con potenza media del laser, acquisendo le immagini a un intervallo di tempo tipico compreso tra uno e cinque secondi, a seconda della velocità di recupero della proteina in esame.

Infine, per eliminare la fluorescenza, sostituire la soluzione extracellulare di registrazione con una soluzione tampone a pH sei oppure, per rivelare la proteina nei depositi intracellulari a basso pH, utilizzare un tampone arricchito con cloruro di ammonio 50 millimolari. Raccogliere almeno da 10 a 20 set di dati per ciascuna proteina ricombinante al fine di consentire un'analisi statistica che eviti risultati distorti; assicurarsi che le condizioni di acquisizione delle immagini siano mantenute costanti tra i replicati. Per analizzare le immagini, aprirle.

Utilizzando il software ImageJ, allineare gli stack per compensare le piccole fluttuazioni nel piano XY che potrebbero essersi verificate durante la serie temporale. Per immagini acquisite con un microscopio confocale ZES, utilizzare il plugin stack reg insieme al plugin LSM toolbox per esportare i valori temporali in un file di testo e importare tali valori in un foglio di calcolo per analizzare le fluttuazioni della fluorescenza. Durante l'esperimento FRA flip, suddividere il segmento di fotobleaching in regioni individuali di pixel utilizzando lo strumento di analisi Image ROI Manager per selezionare più ROI.

Successivamente, utilizzare il comando profilo dell'asse Z del grafico per misurare la fluorescenza media per pixel in ogni punto temporale. Ripetere il processo per misurare l'intensità media della fluorescenza di una regione di fondo non fluorescente. Normalizzare l'intensità della fluorescenza in ogni punto temporale sottraendo i valori di fondo per eliminare il rumore sperimentale e dividere tutti i valori per la misura media del valore iniziale pre-bleaching o per il valore immediatamente successivo al bleaching.

Esaminare il tracciato di recupero per ciascuna ROI in funzione del tempo per determinare se è avvenuto un recupero significativo. In una ROI, calcolare il delta F sottraendo la media delle prime cinque-dieci misure della sequenza di recupero dopo la fotobleach dalla media delle ultime cinque-dieci misure. Quindi, determinare la significatività statistica del delta F e caratterizzare le ROI con recupero e quelle senza recupero per valutare il modello di esocitosi.

Questi sono i punti caldi dell'esocitosi o il recupero tra spina e asse. Questo video mostra il risultato rappresentativo di un tipico esperimento FRAP FLIP utilizzando la colla SERP. Una due.

Una regione del dendrite viene sottoposta a foto-sbiancamento una sola volta, seguita da un periodo di recupero di un minuto. Successivamente viene avviato il foto-sbiancamento ripetitivo delle regioni laterali, indicato dalle frecce blu. La freccia rossa evidenzia una piccola regione di interesse in cui viene osservato il recupero della fluorescenza, mostrato ingrandito nel pannello destro dello schermo.

Il recupero è monitorato nel grafico sottostante, con un aumento complessivo della fluorescenza indicato come delta F. L'aumento della fluorescenza osservato durante questa sequenza può essere attribuito all'inserzione della colla A due nel tratto dendritico. I grandi cambiamenti nell'intensità della fluorescenza alla fine dell'esperimento mostrano l'effetto dei lavaggi a pH basso e a pH 7,4 in presenza di cloruro di ammonio sul segnale di fluorescenza di sep. In questo esempio, i neuroni sono stati infettati con la colla SEP K due.

Qui, un'area di interesse (ROI) di grandi dimensioni contenente numerosi dendriti nel campo visivo è stata sottoposta a fotobleaching, seguita da un fotobleaching ripetitivo selettivo di un singolo dendrite. Questi neuroni sono stati trattati con cicloesimide per due ore prima dell'acquisizione delle immagini, al fine di bloccare la sintesi proteica. Pertanto, il recupero della fluorescenza nelle rispettive aree di interesse misurate rivela la proporzione di recupero dovuta alla diffusione laterale e al riciclo nel dendrite standard sottoposto a protocollo FRAP, rispetto al solo riciclo nei dendriti sottoposti al protocollo FRAP-FLIP.

Confrontando i valori di delta F delle curve di recupero FRAP e FRAP flip, è possibile dedurre i contributi relativi del riciclo rispetto alla diffusione laterale a causa dell'inibizione della sintesi proteica. Il recupero mostra un successivo calo del segnale man mano che il pool disponibile di recettori si esaurisce. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come impostare, eseguire e analizzare esperimenti di imaging con successo nei neuroni.

Utilizzando questa combinazione di tecniche di fotobleaching, è possibile studiare le evidenze di inserimento nella membrana per la proteina di interesse.