Name: Preparazione di un mouse Awake per la registrazione di risposte neurali e iniezione Tracers (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-26T12:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 6 s
Description: Impara a registrare risposte neuronali in topi svegli per studi di neurofisiologia. Questa tecnica consente l'iniezione di traccianti e registrazioni stabili su più giorni senza effetti anestetici.

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Supportato da NSF concessione 0920060, NIH concessione DC004395, NHMRC concessione 1009482, NSW Office of Science and Medical Research, e il Passe Garnett e Rodney Williams Memorial Foundation.

1. Poggiatesta Panoramica <ol><li> Per assemblare una custom-built testa-post, inserire un 1/16 &quot;in acciaio inox roll-pin perpendicolarmente in un foro praticato in un 3/32&quot; tondino di acciaio inox in modo da formare una croce. Il pezzo verticale della testa post dovrebbe essere circa 20 mm e il pezzo trasversale orizzontale di circa 15 mm. Toccare un&#39;estremità dello stelo verticale ad accettare un # 1-72 vite. (Fig. 1). </li><li> Durante l&#39;intervento chirurgico e la registrazione, il capo-post è fissato in un custom-built in ottone o barra di alluminio di montaggio con un # 1-72 vite (Fig. 2). Il pezzo lungo la barra di montaggio dovrebbero essere circa 90 mm di lunghezza e 5-10 mm di larghezza. Il capo-post si inserisce in un taglio in una scanalatura di estensione 15 millimetri fuori dal lungo bancone che è inclinata a 45 gradi. Per evitare la rotazione della testa, la traversa di testa post incastonato in una piccola scanalatura sulla parte inferiore della barra di montaggio. </li><li> La barra di montaggio in poi attaccato ad una misura blocco di montaggio in alluminiok (Fig. 3). Il blocco di montaggio è di circa 30 mm x 30 mm x 25 mm. Questo blocco di montaggio è fissata ad un micromanipolatore modo che la posizione della testa-post può essere accuratamente posizionato lungo la linea mediana e Bregma. Il blocco di montaggio è formata da due pezzi fissati insieme con viti. Un cut-out nel blocco permette la barra di montaggio a scorrere in ed essere fissato con le viti. La barra di montaggio è parallela al piano del tavolo. Durante la registrazione, fissare la barra in una cornice personalizzata stereotassico (Fig. 4). Il stereotax è progettato per montare la barra nella stessa posizione nel blocco di montaggio durante l&#39;intervento chirurgico. Questa disposizione assicura che il mouse sarà sempre allineato al telaio stereotassico tra le sessioni sperimentali. </li><li> Tagliare un&#39;asta di tungsteno (diametro .010 &quot;) a circa 5 mm di lunghezza, con circa 1 millimetro piegato a 45 °. Questa canna funge da perno di terra (Fig. 1). </li></ol> 2. Al stereotassicaneamento per Craniotomia Nota: Tutte le procedure descritte di seguito sono tecniche standard di asepsi chirurgiche e sono stati approvati dalla Washington State Animal Care University e del Comitato d&#39;uso e l&#39;animale Comitato Etico dell&#39;Istituto Garvan. <ol><li> Anestetizzare il mouse mettendo in una camera di induzione con il 5% isoflurano. La mancanza di una reazione a coda e / o presa punta assicura che l&#39;animale è anestetizzato completamente. </li><li> Posizionare il mouse in una cornice stereotassico roditore dotato di un adattatore per mouse (Stoelting). Per orientare il mouse in modo corretto, posizionare i denti all&#39;interno del foro della barra morso e stringere la fascetta naso in modo che sia aderente. Posizionate il mouse il più diritto possibile nella barra morso e pinza il naso. Posizionare una maschera fatta da un pezzo di guanto di lattice sul naso del mouse, e mantenere la isoflurano al 5% fino al tasso di respirazione del mouse è di circa 1 respiro / sec. Ruotare il isoflurano a 1,5 - 2,0%. Fissare la testa con tha orecchie-bar facendo attenzione a non forare il timpano. Bar deve essere aderente ma non penetra troppo in profondità nel canale uditivo. </li><li> Posizionare una piastra elettrica sotto il mouse. </li><li> Applicare una pomata oftalmica per evitare che gli occhi si asciughi. </li><li> Shave il cuoio capelluto dalle tra le orecchie fino agli occhi con un piccolo rasoio o forbici a punta fine. </li><li> Pulire e disinfettare il cuoio capelluto strofinando con cloro-hexidine (o Betadine) scrub seguito da alcol risciacquo ripetuto per 3 volte. </li><li> Per rimuovere la pelle sopra la parte superiore del cranio praticare un&#39;incisione lungo la linea mediana dalla parte posteriore della testa per gli occhi. </li><li> Raschiare periostio ai bordi della incisione con un bisturi. Se necessario (a seconda del bersaglio sperimentale), accuratamente ritrarre la muscolatura sul retro del collo con una pinza, permettendo al muscolo di strappare lungo fascicoli per minimizzare sanguinamento. Applicare Gelfoam sotto il tessuto del cuoio capelluto per ridurre al minimo l&#39;umidità ed evitare la pelle si muova sopra il cranio. </li><li> Asciugare la superficie del cranio con un cotton-punta applicatore inumidito con alcool isopropilico per migliorare la visualizzazione dei punti di riferimento del cranio. </li><li> Allineare il cranio allo standard stereotassico coordinate 13. Inserire un fine-point sonda nel portaelettrodo e allegarlo al micromanipolatore stereotassica. Una barra di metallo affilata funziona bene per questo scopo (Fig. 5). </li><li> Usare il punto per identificare Bregma (Fig. 5A) e Lambda (Fig. 5B) sul cranio. Spostare la sonda avanti e indietro tra questi punti, controllando che la laterale-mediale coordinate per ogni posizione differisce da non più di 50 micron. Riposizionare la testa in base alle esigenze allentando i bar orecchio, spostando la testa e auricolari bar lateralmente, e stringere le barre dell&#39;orecchio. </li><li> Verificare che il dorso-ventrale altezza in ogni posizione differisce da non più di 50 micron. L&#39;altezza del naso-clamp, che ruoterà il cranio attorno all&#39;asse delle barre auricolari,per livellare il passo del cranio, se necessario. L&#39;altezza dell&#39;orecchio-bar potrebbe anche bisogno di essere regolati. </li><li> Utilizzare un atlante 13 per identificare le coordinate del bersaglio di interesse (Fig. 5C) rispetto al Bregma. Segna il teschio sopra il target (ad esempio, una &quot;X&quot; oppure utilizzare inchiostro di china per dot quattro angoli di un quadrato), dove una craniotomia verrà effettuato (Fig. 5D). </li></ol> 3. Head-post e Pin installazione a terra <ol><li> Utilizzare gel etch per pulire cranio. Usare l&#39;applicatore e la diffusione a macchia gel etch su tutta la superficie (10 sec). Lavare con acqua e asciugare completamente. Applicare il primer per cemento dentale alla superficie cranio con applicatore. Stendere l&#39;adesivo con nuovo applicatore. Curare l&#39;adesivo con una luce UV-gun (1 ciclo). </li><li> Scegliete una posizione per il perno di terra che è distale al sito di destinazione. Con attenzione portava un piccolo foro nel cranio con la punta di un bisturi miniblade # 65 ampio abbastanza per la fine del breve p terraper entrare e riposare sulle meningi. Il pin di terra deve essere orientata in modo che punta lontano dalla Bregma e futuro testa post (Fig. 6A). </li><li> Fissare la testa-post alla barra di montaggio e bloccare e fissare al micromanipolatore. Spostando il micromanipolatore in tre dimensioni, posizione della testa-post sul Bregma, sfiora il cranio (Fig. 6B). La base del testa-post deve essere ben disteso sul cranio. </li><li> Utilizzando sonde dissezione, applicare una piccola quantità di cemento dentale intorno alla testa-post e pin di terra (Fig. 6C). Premere il cemento verso il basso per assicurare un buon contatto con il cranio. Nota: non utilizzare il cemento troppo o non si indurisce in modo uniforme. Curare il cemento con un UV light-gun (3-4 cicli da più angolazioni). </li><li> Applicare la seconda fase di cemento e costruire la base intorno alla testa post e coprono le scanalature della testa post (Fig. 6D). </li></ol> 4. Craniotomia <ol><li> Individuare la craniotomia tacca di riferimento, che sarà parzialmente oscurata dal primer. Utilizzare un bisturi # 65 a segnare da 3 mm x 3 mm quadrati intorno a questo sito e applicare una goccia di lidocaina per ridurre la sensibilità e ridurre al minimo il sanguinamento. </li><li> Fai punteggi più su ogni lato del quadrato (fino a 10), facendo attenzione a non tagliare l&#39;osso e nel cervello (Fig. 7A). </li><li> Una volta che il lembo osseo si allenta, utilizzare la punta del bisturi per sollevare in su, lasciando intatta la dura madre (Fig. 7B). </li><li> Coprire con cera ossea. </li></ol> 5. Post-operatorio <ol><li> Spegnere l&#39;anestesia gas e togliere il mouse dal telaio stereotassico. </li><li> Usare un applicatore con punta di cotone per applicare una pomata lidocaina intorno pelle esposta per attutire la sensazione intorno ferita. Utilizzare un altro cotone punta applicatore per applicare Neosporin sulla pelle esposta. Iniettare ketoprofene (5 mg / kg IM o IP in base alle preferenze dei singoli veterinari IACUC) comeun post-chirurgico analgesico. Mouse sarà generalmente alto e che si spostano all&#39;interno minuti di cessazione gas. </li><li> Posizionare il mouse in una gabbia caldo e il monitor fino a quando non è pronto a tornare alla casa degli animali. </li><li> L&#39;animale deve essere controllata almeno una volta al giorno dopo ha recuperato da un intervento chirurgico. Attenzione ai segni di mangiare poveri e / o bere e il comportamento apatico. Se il dolore si sospetta, fornire ketoprofene ogni 24 ore (stessa dose alla fine della post-chirurgico) fino alleviata. Lidocaina possono essere applicati localmente sulla ferita se l&#39;animale si gratta o mostra segni di disagio. Gli animali in genere riprendersi da un intervento chirurgico senza complicazioni o dolore. </li></ol> 6. Registrazione e Dye iniezione <ol><li> Attendere almeno un giorno dopo la testa-post intervento chirurgico prima di usare il mouse per le registrazioni. </li><li> Posizionare il mouse in una schiuma di ritenuta del dispositivo modellato al corpo del mouse. Il mouse è già stato adattato per questo dispositivo, riducendo così la sua ansia. Tipico è l&#39;adattamentoper gestire il mouse ogni giorno dopo lo svezzamento e per circa una settimana prima dell&#39;intervento e esperimenti, posizionare il mouse nel dispositivo schiuma per 1-5 minuti. Sospendere dispositivo nel telaio stereotassico (Fig. 4). </li><li> Sicura testa posta a barra di montaggio, che è ora fissato al telaio stereotassico (Fig. 4). </li><li> Collegare al pin terra con un filo terminato con un blunt 22-gauge punta dell&#39;ago ipodermico. </li><li> Rimuovere cera ossea sopra il craniotomia. Rimuovere dura, se necessario, con la punta di un bisturi miniblade. </li><li> Guidare elettrodo alla corretta posizione stereotassica e iniziare la registrazione (Fig. 8). Per solo registrazioni elettrofisiologiche, una serie di elettrodi può essere utilizzata. La scelta di elettrodo dipende dalla posizione e il tipo di registrazioni richieste. La scelta di elettrodo per le registrazioni del mouse veglia sarà lo stesso di quello ricercatore utilizza in un mouse anestetizzato. Per combinati con le registrazioni elettrofisiologichecolorante / tracciante iniezioni, un elettrodo micropipetta viene utilizzato 10. La micropipetta è riempito con il colorante / tracciante di scelta in modo che possa essere iontophoretically iniettato alla fine degli esperimenti elettrofisiologici. Multibarrel elettrodi possono anche essere utilizzati in modo che manipolazioni farmacologiche possono essere fatte. L&#39;elettrodo multibarrel è montato su una micropipetta singola registrazione (Fig. 8). Queste tecniche sono standard in letteratura e non sono diversi per le registrazioni anestetizzati rispetto sveglio. </li><li> Le registrazioni possono essere effettuate per 4-5 ore per 3-4 giorni consecutivi. </li><li> Al termine della sessione di registrazione, il colorante / tracciante può essere iniettato. Poiché non ci sono recettori del dolore nel cervello, l&#39;iniezione iontoforetico del colorante o tracciante nel cervello è improbabile da causare fastidio. Tuttavia, una volta che le proprietà elettrofisiologiche di risposta della regione dove l&#39;iniezione è da effettuare sono caratterizzati, l&#39;animale può essere anestetizzato con f isofluranoo l&#39;iniezione. Questo eliminerebbe i potenziali sensazioni indesiderate. Poiché il colorante / tracciante è già in micropipetta, i conduttori attivi e terra può essere commutato dalla registrazione elettrofisiologica set-up al generatore di corrente per iniettare iontophoretically il colorante / tracciante. Utilizzare protocollo appropriato per il colorante / tracciante in dell&#39;elettrodo. Rimuovere l&#39;animale dal vincolo headpost e moderazione del corpo e ritornare alla sua gabbia a casa. </li><li> Alla fine dell&#39;esperimento, seguite protocollo appropriato per eutanasia e lavorazione dei tessuti per recuperare sito di iniezione e di etichettatura. </li></ol> 7. Risultati rappresentativi Corretta installazione della testa-post consente lo sperimentatore per registrare le risposte singole e multipla da una non anestetizzato, mouse sveglio più giorni. Il sistema di ritenuta consente stabili registrazioni elettrofisiologiche di singoli neuroni nel cervello. Eccellente isolamento delle singole unità e risposte forti tstimoli o possono essere registrati dalla struttura stessa del cervello più giorni, per esempio nel topo collicolo inferiore (Fig. 9A, giorno uno; Figura 9B, secondo giorno). Con un buon capo-post installazione, ogni mouse verrà costantemente allineato l&#39;apparato stereotassico e il mouse atlante stereotassico, 13 con conseguente localizzazione affidabile di nuclei particolare cervello. Questa localizzazione permette affidabile per l&#39;iniezione di coloranti e traccianti in strutture specifiche, dopo giorni di registrazione multipli. Ad esempio, per valutare proiezioni discendenti dal mesencefalo uditivo al tronco cerebrale uditivo, biotinilato destrano ammina (diaminobenzidina visualizzato utilizzando come cromogeno) può essere iniettato nel topo collicolo inferiore (Fig. 10A) dopo elettrofisiologicamente identificare proprietà di risposta neuronali nel sito di iniezione (in fig. 10A, un neurone è stato registrato con un miglior frequenza di 51 kHz), e dopo la lavorazione del tessuto, unoetichettatura nterograde nel controlaterale nucleo cocleare dorsale può stati visualizzati e stampati (Fig. 10B). Microfotografie a più alta risoluzione può essere ottenuto anche per visualizzare assoni anterogradely etichettati e terminali (Fig. 10C). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3755/3755fig1.jpg" /> Figura 1. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3755/3755fig2.jpg" /> Figura 2. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3755/3755fig3.jpg" /> Figura 3. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3755/3755fig4.jpg" /> Figura 4. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3755/3755fig5.jpg" /> Figura 5. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/3755/3755fig6.jpg" /> <sTrong&gt; Figura 6. <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/3755/3755fig7.jpg" /> Figura 7. <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/3755/3755fig8.jpg" /> Figura 8. <img alt="Figura 9" src="/files/ftp_upload/3755/3755fig9.jpg" /> Figura 9. <img alt="Figura 10" src="/files/ftp_upload/3755/3755fig10.jpg" /> Figura 10.

<ol><li>Evans, E. F., Nelson, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+responses+of+single+neurones+in+the+cochlear+nucleus+of+the+cat+as+a+function+of+their+location+and+the+anaesthetic+state%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">The responses of single neurones in the cochlear nucleus of the cat as a function of their location and the anaesthetic state.</a> Exp. Brain Res. 17, 402-427 (1973).</li>
<li>Joris, P. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+classes+in+the+dorsal+cochlear+nucleus+and+its+output+tract+in+the+chloralose-anesthetized+cat%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Response classes in the dorsal cochlear nucleus and its output tract in the chloralose-anesthetized cat.</a> J. Neurosci. 18, 3955-3966 (1998).</li>
<li>Populin, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anesthetics+change+the+excitation%2Finhibition+balance+that+governs+sensory+processing+in+the+cat+superior+colliculus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Anesthetics change the excitation/inhibition balance that governs sensory processing in the cat superior colliculus.</a> J. Neurosci. 25, 5903-5914 (2005).</li>
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<li>Westby, G. W., Wang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+floating+microwire+technique+for+multichannel+chronic+neural+recording+and+stimulation+in+the+awake+freely+moving+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">A floating microwire technique for multichannel chronic neural recording and stimulation in the awake freely moving rat.</a> J. Neurosci. Methods. 76, 123-133 (1997).</li>
<li>Suga, N., O'Neill, W. E., Manabe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+neurons+sensitive+to+combinations+of+information-bearing+elements+of+biosonar+signals+in+the+mustache+bat%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cortical neurons sensitive to combinations of information-bearing elements of biosonar signals in the mustache bat.</a> Science. 200, 778-781 (1978).</li>
<li>O'Neill, W. E., Suga, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target+range-sensitive+neurons+in+the+auditory+cortex+of+the+mustache+bat%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Target range-sensitive neurons in the auditory cortex of the mustache bat.</a> Science. 203, 69-73 (1979).</li>
<li>Suga, N., O'Neill, W. E., Manabe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harmonic-sensitive+neurons+in+the+auditory+cortex+of+the+mustache+bat%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Harmonic-sensitive neurons in the auditory cortex of the mustache bat.</a> Science. 203, 270-274 (1979).</li>
<li>Portfors, C. V., Felix, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2nd+Spectral+integration+in+the+inferior+colliculus+of+the+CBA%2FCaJ+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">2nd Spectral integration in the inferior colliculus of the CBA/CaJ mouse.</a> Neuroscience. , 136-1159 (2005).</li>
<li>Felix, R. A. 2nd, Portfors, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitatory%2C+inhibitory+and+facilitatory+frequency+response+areas+in+the+inferior+colliculus+of+hearing+impaired+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Excitatory, inhibitory and facilitatory frequency response areas in the inferior colliculus of hearing impaired mice.</a> Hear Res. 228, 212-229 (2007).</li>
<li>Portfors, C. V., Jonson, K. G., Roberts, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Over-representation+of+species-specific+vocalizations+in+the+awake+mouse+inferior+colliculus%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Over-representation of species-specific vocalizations in the awake mouse inferior colliculus.</a> Neuroscience. 162, 486-500 (2009).</li>
<li>Franklin, K. B. J., Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFranklin%2C+KBJ+%22The+Mouse+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates%22">The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates</a>. , 3rd edn, Academic Press. NY. (2007).</li>
</ol>

Non abbiamo nulla da rivelare.

Il vantaggio del capo-post sistema di ritenuta per esperimenti elettrofisiologici e neuroanatomici in mouse è che gli esperimenti possono essere condotti con sveglio non anestetizzati, topi, eliminando una potenziale contaminazione risposta dovuta ai farmaci anestetici. Inoltre, l&#39;allestimento può essere utilizzato per più giorni per consentire l&#39;uso animale più efficiente. La maggior parte dei componenti per la testa-post sono disponibili off-the-shelf. Soltanto il capo-post ed appa...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Comments </td></tr><tr><td> Etch gel per la pulizia cranio prima cemento dentale </td><td> Henry Schein </td><td> 101-5396 </td><td> 12/pk con 1.2 ml siringhe </td></tr><tr><td> Primer per cemento dentale </td><td> Kerr OptiBond </td><td> 25881 </td><td> 8 mL bottiglia </td></tr><tr><td> Adesivo per cemento dentale </td><td> Kerr OptiBond </td><td> 25882 </td><td> 8 mL bottiglia </td></tr><tr><td> Applicatori di cemento dentale </td><td> Kerr OptiBond </td><td> 24680 </td><td> 200/pk </td></tr><tr><td> Dental Cement </td><td> Charisma, Heraeus Kulzer </td><td> 66000085 </td><td> Siringa Refill 4GM </td></tr><tr><td> Tungsten Rod (Pin terra) </td><td> Sistemi AM </td&gt; <td> 717200 </td><td> 0.010 &quot;di diametro </td></tr><tr><td> Economia leggera polimerizzazione UV </td><td> Henry Schein </td><td> CU-80 </td><td></td></tr><tr><td> Testa-post </td><td> Costruito in-house </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Barra di montaggio </td><td> Costruito in-house </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Blocco di montaggio </td><td> Costruito in-house </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Frame stereotassico </td><td> David Kopf Instruments </td><td> 902 </td><td></td></tr><tr><td> Mouse e adattatore Rat neonatale </td><td> Stoelting </td><td> 51625 </td><td></td></tr><tr><td> DeltaPhase Pad isotermico </td><td> Braintree Scientific, Inc. </td><td> 39DP </td><td></td></tr></tbody></table>

preparazione di un mouse awake per la registrazione di risposte neurali e iniezione tracers

Preparation of an Awake Mouse for Recording Neural Responses and Injecting Tracers

È ben noto che l&#39;anestesia altera proprietà di risposta neurali in diverse regioni del cervello. 13. Nel sistema uditivo, le proprietà fondamentali di risposta dei neuroni del tronco encefalico compresa una soglia, la specificità frequenza e bande laterali inibitorie sono alterate in modo significativo sotto anestesia 1-2. Queste osservazioni richiesto fisiologi a cercare modi per registrare da singoli neuroni senza gli effetti contaminanti di anestesia. Un risultato era una preparazione decerebrate, dove il tronco è stato completamente recisi a livello del mesencefalo 4. Gli svantaggi di questa preparazione sono un formidabile intervento chirurgico, l&#39;eliminazione di scendere proiezioni del prosencefalo, e l&#39;incapacità di utilizzare la stimolazione sensoriale per esaminare le strutture al di sopra del mesencefalo. Una strategia diversa è stata quella di impiantare cronicamente schiere di elettrodi per registrare da singoli neuroni e cluster multipla mentre l&#39;animale è sveglio e / o si comporta 5,6 </sup&gt;. Queste tecniche, tuttavia, non sono compatibili con l&#39;iniezione di coloranti traccianti dopo la prima elettrofisiologico che caratterizza una struttura cerebrale. Per evitare di alterare le proprietà di risposta neurale con anestetici durante la registrazione di proprietà di risposta elettrofisiologiche da singoli neuroni, abbiamo adattato una tecnica poggiatesta a lungo utilizzato nei pipistrelli 7-9 al mouse 10-12. Utilizzando questo metodo, siamo in grado di effettuare registrazioni elettrofisiologiche per diversi giorni nel topo non anestetizzato. Al termine delle sessioni di registrazione, si può iniettare un colorante per ricostruire posizioni elettrodi e siti di registrazione o iniettare un tracciante in modo che i percorsi da e verso i loci di registrazione può essere determinato. Questo metodo permette di ben isolate registrazioni singolo neurone per più giorni, senza l&#39;uso degli anestetici.

Caratterizzazione elettrofisiologica delle risposte neuronali è importante per comprendere le funzioni cerebrali e per guidare il posizionamento dei coloranti per via tracing. Tuttavia, molti studi sono effettuati in animali anestetizzati. Per capire la funzione del cervello senza anestesia, abbiamo sviluppato un metodo per registrare le proprietà di risposta dei neuroni e iniettare coloranti nel topo sveglio.

Preparazione di un mouse Awake per la registrazione di risposte neurali e iniezione Tracers

È noto che l'anestesia alteri le proprietà della risposta neurale in varie regioni del cervello.13. Nel sistema uditivo, la risposta fondamentale...

L'obiettivo generale di questa procedura è registrare le risposte di singoli neuroni in un topo sveglio. Questo viene raggiunto anestetizzando innanzitutto il topo mediante inalazione di isoflurano, posizionando il topo in un apparato stereotassico per roditori ed esponendo il cranio. Il secondo passaggio consiste nell'individuare la regione cerebrale di interesse utilizzando coordinate stereotassiche e nel segnare questa regione per una successiva craniotomia.Successivamente, un attacco per la testa su misura viene montato sul cranio e l'attacco viene posizionato su una barra di montaggio collegata a un micromanipolatore dell'apparato stereotassico. L'ultimo passaggio consiste nell'eseguire una craniotomia per consentire l'inserimento di un elettrodo nel cervello. Una volta che il topo si è ripreso dall'intervento chirurgico, viene immobilizzato in un blocco di schiuma.Il supporto per la testa viene riposizionato sulla barra di montaggio e fissato a un apparato stereotassico su misura, e un elettrodo a micropipetta può essere inserito nel cervello. Questa procedura consente l'isolamento di unità singole. Risposte intense agli stimoli possono essere registrate dalla stessa struttur

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Research

Ricerca

JoVE Journal

Neuroscience

Neuroscienze

Questo video dimostra lo studio dell'attività neuronale in una regione specifica del cervello del topo che elabora gli stimoli uditivi. La tecnica prevede l'applicazione di un bloccante inibitorio della neurotrasmissione e il confronto delle risposte neuronali con gli stimoli uditivi prima e dopo l'applicazione del farmaco alla regione cerebrale localizzata.

Indagine sulle risposte neuronali uditive in un topo sveglio in presenza di un bloccante inibitorio dei neurotrasmettitori

Questo video mostra una tecnica per impiantare un gruppo di elettrodi nel cervello di un topo. L'assemblaggio contiene elettrodi bipolari per registrare l'attività dall'ippocampo e un elettrodo di riferimento per ottenere l'attività di base dal cervelletto. Un topo anestetizzato viene posizionato su un telaio stereotassico e il gruppo elettrodo viene impiantato nella regione del cervello bersaglio. L'animale viene quindi lasciato riprendersi prima di eseguire la registrazione elettrofisiologica.

Impianto di un gruppo di elettrodi in un cervello di topo per la registrazione elettrofisiologica

Fonte: Moore, J. D., et al. Monitoraggio juxtacellulare e localizzazione di singoli neuroni all'interno di strutture cerebrali subcorticali di ratti allertati e con la testa trattenuta. J. Vis. Exp. (2015)Questo video mostra il metodo di registrazione e colorazione juxtacellulare in un ratto sveglio e trattenuto. La procedura prevede la registrazione dei segnali dai neuroni e l'iniezione di colorante per localizzare con precisione il sito di registrazione. Questa tecnica consente di mappare con...

Registrazione e colorazione juxtacellulare per una mappatura precisa dell'attività neurale in un ratto sveglio 

La registrazione dell'elettroencefalogramma (EEG) e dell'elettromiogramma (EMG) nei topi che si comportano liberamente è un passo fondamentale per correlare il comportamento e la fisiologia con il sonno e la veglia. Il protocollo sperimentale qui descritto fornisce un sistema basato su cavo per l'acquisizione di registrazioni EEG ed EMG nei topi.

Procedura di registrazione poligrafica per la misurazione del sonno nei topi

Presentiamo metodi per la costruzione di elettrodi per registrare simultaneamente l'attività neurale extracellulare e rilasciare più sostanze neuroattive in prossimità dei siti di registrazione nei topi svegli. Questa tecnica consente l'analisi dettagliata di input sinaptici locali putativi al neurone di interesse.

Extracellulare La registrazione di un neurone attività combinata con Microiontophoretic applicazione di sostanze neuroattivi nei topi Awake

Questo lavoro introduce un metodo per eseguire un unitario optogenetica registrazione in modo affidabile da un mouse sveglio usando un optrode di vetro su misura.

Optogenetica identificazione di un tipo di un neurone con un Optrode di vetro in topi svegli

Qui descriviamo una procedura per tessuto di compensazione, l'etichettatura fluorescente e su larga scala di formazione immagine del tessuto di cervello di topo che, quindi, permette la visualizzazione dell'organizzazione tridimensionale dei tipi delle cellule nella neocorteccia.

Formazione immagine tridimensionale su larga scala di organizzazione cellulare nella neocorteccia Mouse

Questo protocollo descrive una tecnica cronica di impianto della finestra cranica che può essere utilizzata per l'imaging longitudinale di strutture neuro-glio-vascolari, interazioni e funzione sia in condizioni sane che malate. Serve come alternativa complementare all'approccio di imaging transcranico che, sebbene spesso preferito, possiede alcune limitazioni critiche.

Mappatura precisa del cervello per eseguire immagini ripetitive in vivo della dinamica neuroimmune nei topi

Qui, descriviamo un protocollo che combina l'iniezione di virus adeno-associato con l'impianto di finestre craniche per l'imaging simultaneo delle dinamiche microgliali e dell'attività neuronale nei topi svegli.

Imaging simultaneo delle dinamiche microgliali e dell'attività neuronale in topi svegli

Abbiamo sviluppato un approccio semplificato ed economico per la fabbricazione di elettrodi e condotto registrazioni di segnali su più regioni in topi che si muovono liberamente. L'utilizzo dell'optogenetica, insieme all'elettrofisiologia multiregionale e alla registrazione del segnale del calcio, ha permesso la rivelazione delle attività neuronali in tutte le regioni nel modello di accensione delle crisi.

Un metodo integrato per la creazione di optrodi elettrofisiologici flessibili e convenienti per la registrazione in vivo multi-regione

Questo protocollo descrive un metodo per ottenere registrazioni in vivo di singoli neuroni ad alta densità dal tronco encefalico di topi fissati alla testa. Questo approccio viene utilizzato per misurare l'attivazione del potenziale d'azione dei neuroni nel grigio periacqueduttale ventrolaterale - una regione del tronco encefalico inattiva durante il sonno REM (Rapid Eye Movement) - prima e durante l'anestesia generale.

Registrazioni acute multi-elettrodo a unità singola dal tronco encefalico di topi fissati alla testa

Impara a registrare risposte neuronali in topi svegli per studi di neurofisiologia. Questa tecnica consente l'iniezione di traccianti e registrazioni stabili su più giorni senza effetti anestetici.

Preparazione di un mouse Awake per la registrazione di risposte neurali e iniezione Tracers

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