Preparazione di un mouse Awake per la registrazione di risposte neurali e iniezione Tracers

L'obiettivo generale di questa procedura è registrare le risposte di singoli neuroni in un topo sveglio. Questo viene raggiunto anestetizzando innanzitutto il topo mediante inalazione di isoflurano, posizionando il topo in un apparato stereotassico per roditori ed esponendo il cranio. Il secondo passaggio consiste nell'individuare la regione cerebrale di interesse utilizzando coordinate stereotassiche e nel segnare questa regione per una successiva craniotomia.

Successivamente, un attacco per la testa su misura viene montato sul cranio e l'attacco viene posizionato su una barra di montaggio collegata a un micromanipolatore dell'apparato stereotassico. L'ultimo passaggio consiste nell'eseguire una craniotomia per consentire l'inserimento di un elettrodo nel cervello. Una volta che il topo si è ripreso dall'intervento chirurgico, viene immobilizzato in un blocco di schiuma.

Il supporto per la testa viene riposizionato sulla barra di montaggio e fissato a un apparato stereotassico su misura, e un elettrodo a micropipetta può essere inserito nel cervello. Questa procedura consente l'isolamento di unità singole. Risposte intense agli stimoli possono essere registrate dalla stessa struttura cerebrale per diversi giorni consecutivi, e i tracciati possono essere utilizzati per esaminare proiezioni ascendenti o discendenti verso regioni fisiologicamente identificate, senza alterare le risposte mediante l'uso di anestetici.

Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti è che le proprietà di risposta dei neuroni non sono influenzate dagli anestetici. A dimostrare questa procedura sarà Zachary Mako, uno studente laureato del mio laboratorio. Per preparare il fissaggio della testa, assemblare innanzitutto un supporto per la testa su misura praticando un foro in una barra di acciaio inossidabile lunga 15 millimetri, tre trentaduesimi di pollice. Successivamente, inserire perpendicolarmente nel foro un perno cilindrico in acciaio inossidabile da 20 millimetri.

Per realizzare un attacco a croce, intagliare un'estremità della barra verticale in modo da accogliere una vite numero 1 72, come mostrato qui. Successivamente, preparare la barra di montaggio. Questo componente è costituito da una barra più lunga in ottone o alluminio, di circa 90 millimetri di lunghezza e da 5 a 10 millimetri di larghezza, e da una barra più corta lunga 15 millimetri, collegata all'estremità della barra lunga con un angolo di 45 gradi.

La barra più corta presenta una scanalatura ricavata sul fondo e una scanalatura più corta lungo la larghezza; inserire il supporto della testa in queste scanalature in modo che il pezzo trasversale si adatti nella scanalatura più corta. Il blocco di montaggio è composto da due pezzi di alluminio uniti con delle viti per formare un blocco di circa 30 millimetri per 30 millimetri per 25 millimetri, con un ritaglio per alloggiare la barra di montaggio; inserire la barra di montaggio nel ritaglio del blocco di montaggio in posizione parallela alla superficie del tavolo. Fissare il blocco di montaggio a un micromanipolatore in modo che la posizione del supporto della testa possa essere posizionata con precisione lungo la linea mediana e un brima.

Infine, tagliare una barretta di tungsteno del diametro di 0,01 pollici a una lunghezza di circa cinque millimetri, con circa un millimetro piegato a 45 gradi. Questa barretta funge da perno di massa. Dopo aver posizionato l'animale in una camera di induzione con il 5% di fluoruro, assicurarsi che l'animale sia completamente anestetizzato eseguendo una compressione del dito del piede e verificando l'assenza di reazione.

Dopo aver anestetizzato completamente, posizionare il topo nel telaio stereotassico per roditori dotato di adattatore per topo inserendo innanzitutto i denti nel foro della barra bite e stringendo delicatamente la pinza nasale fino a quando non risulta ben aderente. Per assicurare che l'animale rimanga anestetizzato, posizionare una maschera facciale realizzata con un pezzo di guanto in lattice sul naso del topo e mantenere l'isoflurano al 5% fino a quando la frequenza respiratoria non raggiunge circa un respiro al secondo.

Dopo questo periodo, ridurre la concentrazione di isoflurano a 1,5-2%. Ora fissare la testa inserendo delicatamente le barre auricolari in ciascun condotto uditivo. Avendo cura di non perforare il timpano, posizionare le barre auricolari in modo che siano ben aderenti, senza penetrare troppo in profondità nei condotti uditivi. Posizionare una borsa riscaldante a gel sotto il topo.

Quindi applicare delicatamente un unguento oftalmico per prevenire l'essiccamento degli occhi. Utilizzare un piccolo rasoio o forbici a punta fine. Rimuovere i peli dalla zona compresa tra le orecchie fino agli occhi.

Ora pulire e sterilizzare il cuoio capelluto con una soluzione di clorhexidina o Betadine, seguita da un risciacquo con alcol ripetuto tre volte. Praticare un'incisione lungo la linea mediana, dalla nuca fino agli occhi. Se necessario, raschiare il periostio fino ai margini dell'incisione con un bisturi.

Ritirare con attenzione la muscolatura nella parte posteriore del collo con pinze, permettendo al muscolo di strapparsi lungo i solchi per minimizzare il sanguinamento. Applicare della schiuma gel sotto il tessuto cutaneo del cuoio capelluto per ridurre l'umidità e impedire alla pelle di scivolare sul cranio. Quindi inumidire un applicatore di cotone con alcol isopropilico e asciugare la superficie del cranio per migliorare la visualizzazione dei punti di repère ossei.

Una volta preparato l'animale, inserire una punta fine, ad esempio una bacchetta metallica affilata, nel supporto dell'elettrodo e fissarla al micromanipolatore stereotassico. Spostare la punta avanti e indietro tra bgma e Lambda, assicurandosi che la coordinata latero-mediale per ciascuna posizione differisca di non più di 50 micron.

Riposizionare delicatamente la testa utilizzando i supporti auricolari secondo necessità. Verificare che la differenza di altezza dorso-ventrale tra Bgma e Lambda non superi i 50 micrometri. Regolare l'altezza della pinza nasale per livellare l'inclinazione del cranio, se necessario; potrebbe essere necessario regolare anche l'altezza del supporto auricolare.

Utilizzare un atlante del cervello del mouse per identificare le coordinate della regione di interesse rispetto al bgma. Usare l'inchiostro di china per segnare il cranio sopra la regione di interesse dove verrà eseguita una craniotomia. Per prima cosa, pulire il cranio stendendo un gel mordente dentale sulla superficie e spazzolare per circa 10 secondi.

Quindi lavare con acqua ed asciugare completamente. Successivamente, applicare il primer adesivo per il cemento dentale sulla superficie del cranio. Utilizzando l'applicatore, usare quindi un nuovo applicatore per distribuire l'adesivo e polimerizzare l'adesivo con un ciclo di una lampada a luce UV.

Identificare una posizione distale rispetto al sito bersaglio. Per l'inserimento del perno di terra, utilizzare la punta di un bisturi miniaturizzato di numero 65 per praticare con attenzione un piccolo foro nel cranio. A questo punto, il foro dovrebbe essere abbastanza ampio da ospitare l'estremità corta del perno di terra.

Inserire il perno di messa a terra in modo che poggio sulle meningi. Assicurarsi che il perno sia orientato in modo da puntare lontano dal bgma e dal sito di attacco del supporto per la testa. Ora, spostare il micromanipolatore in modo che il supporto per la testa sia posizionato sopra il bgma, toccando appena il cranio.

La base del supporto per la testa deve aderire bene al cranio. Utilizzare quindi delle sonde da dissezione per applicare una piccola quantità di cemento dentale intorno al supporto per la testa e al perno di massa. Premere il cemento per assicurare un buon contatto con il cranio.

Quindi polimerizzare con tre o quattro cicli di una lampada a raggi UV. Infine, applicare un secondo strato di cemento per costruire la base intorno al perno della testa e coprire le scanalature del perno stesso, quindi polimerizzare. Prima di iniziare, individuare il segno di riferimento della craniotomia, che sarà parzialmente oscurato dal primer.

Quindi utilizzare un bisturi miniaturizzato numero 65 per delimitare un quadrato di tre millimetri per tre millimetri intorno a questa zona. Applicare una goccia di soluzione di lidocaina per ridurre la sensibilità. Effettuare ora diversi tagli su ciascun lato del quadrato, avendo cura di non recidere l'osso e di non penetrare nel cervello.

Una volta che la falda ossea diventa mobile, utilizzare la punta del bisturi per sollevarla, lasciando intatta la dura madre. Quindi coprire l'area con cera per ossa. Al termine dell'intervento chirurgico, spegnere l'isoflurano e rimuovere il topo dallo stereotassico.

Applicare lidocaina sulla cute esposta, seguita dall'applicazione di neomicina, somministrare analgesia post-chirurgica secondo le indicazioni del veterinario e restituire il topo alla gabbia di mantenimento. Dopo 24 ore, il topo può essere utilizzato per registrazioni elettrofisiologiche. Questa figura dimostra che l'installazione corretta del supporto cranico permette all'operatore di registrare risposte di unità singole e multiple da un topo sveglio per diversi giorni.

Il sistema di fissaggio consente registrazioni elettrofisiologiche stabili di singoli neuroni nel cervello. È possibile registrare un'eccellente isolazione di unità singole e risposte robuste agli stimoli dalla stessa struttura cerebrale per diversi giorni consecutivi. Ad esempio, nel collicolo inferiore del topo per un periodo di due giorni, il pannello a sinistra mostra le registrazioni ottenute nel primo giorno e il pannello a destra nel secondo giorno, al fine di valutare le proiezioni discendenti dal mesencefalo uditivo al tronco encefalico uditivo; la dextranina biotinilata e l'ammina possono essere iniettate nel collicolo inferiore del topo e visualizzate utilizzando la Dino Benadine come cromogeno, come mostrato qui dopo l'identificazione elettrofisiologica delle proprietà di risposta neuronale nel sito di iniezione e a seguito dell'elaborazione del tessuto.

È possibile visualizzare e tracciare l'etichettatura anterograda nel nucleo cocleare dorsale controlaterale, come mostrato qui. Possono essere ottenute anche microfotografie ad alta risoluzione per osservare gli assoni e le terminazioni marcati anterograda. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come registrare le proprietà di risposta da singoli neuroni e iniettare coloranti o traccianti per studi neuroanatomici in un topo sveglio.

Questa preparazione elimina l'influenza degli anestetici sulle proprietà delle risposte neurali e consente di eseguire esperimenti su più giorni utilizzando lo stesso animale. La chiave della procedura consiste nell'assicurare che il supporto per la testa sia fissato saldamente al cranio e che il topo sia adeguatamente immobilizzato. Sebbene questo video abbia illustrato come utilizzare questa procedura per effettuare registrazioni da singoli neuroni del sistema uditivo, altre aree del cervello possono essere studiate mediante questa tecnica.