Misurazione della pressione ventricolare sinistra nel tardo Mice embrionali e neonatale
23 febbraio 2012
Misurazione della pressione ventricolare sinistra (LV) nei topi embrionali e neonatale è descritto. La pressione è misurata inserendo un ago connesso ad un trasduttore riempito di fluido nella LV sotto guida ecografica. Si deve prestare attenzione a mantenere una normale funzione cardiaca durante il protocollo sperimentale.
L'obiettivo generale di questa procedura è misurare la pressione del ventricolo sinistro o pressione VS in topi embrionali tardivi e neonati. Innanzitutto, si prepara l'attrezzatura. Un ago collegato a un trasduttore di pressione deve essere allineato con una sonda ecografica.
Quindi si prepara un topo e il suo ventricolo sinistro (LV) viene visualizzato mediante ultrasuoni. Successivamente l'ago viene avanzato all'interno della cavità del ventricolo sinistro e vengono registrate misurazioni della pressione pulsatile. Infine, i risultati mostrano le pressioni sistoliche nei topi embrionali tardivi e nei neonati precoci mediante questa cateterizzazione guidata da ultrasuoni con catetere riempito di liquido.
Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come il servocatetere, i cateteri senza misurazione della pressione o quelli a stato solido, è che la pressione può essere misurata in modo robusto e ripetibile nei topi embrionali e neonatali in fase avanzata. In generale, chi si approccia per la prima volta a questa tecnica potrebbe incontrare difficoltà, poiché è complesso mantenere l'orientamento dell'embrione all'interno della sacca embrionale, dato che l'embrione tende a ruotare. Dopo aver applicato la sonda ecografica, a seconda dello stadio del topo da analizzare, selezionare e riempire una sonda con acqua distillata.
Posizionare la sonda nel supporto regolabile del sistema ecografico. Regolare il supporto in modo da ottenere una vista dell'asse lungo del ventricolo sinistro (LV) di un topo montato sulla piattaforma, con l'apice del LV rivolto verso il braccio di iniezione. Il sistema di pressione è costituito da un trasduttore di pressione riempito di liquido, un amplificatore e un sistema di acquisizione dati con software di registrazione in laboratorio.
Per svuotare il tubo, si utilizza un pacchetto software e una siringa da 20 millilitri riempita con soluzione salina eparinizzata al 10%. Assicurarsi che non rimangano bolle d'aria intrappolate nel tubo o sopra il trasduttore. Il collegamento del tubo al trasduttore avviene mediante rubinetti a tre vie, connettori a baionetta e raccordi a innesto.
Calibrare il sistema del trasduttore di pressione con un manometro montando il tubo dell'ago e la guaina sul braccio di iniezione. Sostituire il manometro con una guaina per fissare il tubo al braccio di iniezione. La guaina è semplicemente un corpo di siringa modificato da tre millilitri.
Fissare il trasduttore di pressione a un anello. Posizionarsi all'altezza approssimativa della piattaforma di imaging per evitare ostruzioni. Applicare l'ago della dimensione più grande possibile al tubo dell'ago e iniettare ulteriore soluzione salina eparinizzata fino a quando non escono alcune gocce.
Estrai nuovamente l'ago. Assicurati che non siano rimaste bolle intrappolate nel tubo o sopra il trasduttore. Ora, posiziona un mucchio di gel ecografico sulla piattaforma di imaging.
Ruotare l'ago rispetto al corpo della siringa da tre millilitri in modo che il bordo smussato dell'ago sia rivolto verso l'alto. Quindi, utilizzando il supporto regolabile, allineare con attenzione la sonda in modo che l'ago possa essere avanzato direttamente nel gel. Al centro della sonda di imaging, l'ago deve trovarsi sufficientemente al di sotto della sonda da non perforare la copertura della sonda, ma abbastanza vicino da rientrare nel campo focale della sonda.
Se necessario, l'ago può essere piegato manualmente in modo che rimanga nel piano corretto per tutta la sua traiettoria. Mantenendo l'allineamento, ritrarre l'ago e sollevare la sonda di imaging per posizionare un topo sulla piattaforma di imaging. Sostituire l'ago prima di procedere con l'anestesia del topo.
Una madre gravida o un topo neonato possono essere sottoposti a inalazione continua di 1,5% di isoflurano mediante un tubicino inserito in un cono nasale standard, adatto alla piccola testa di un topo neonato precoce. Per i topi neonati, fissare l'animale sulla piattaforma di imaging del sistema ecografico in posizione supina, con l'apice del ventricolo sinistro rivolto verso il braccio di iniezione. Per i topi neonati, mantenere la temperatura corporea con una lampada riscaldante esterna.
I topi gravidi richiedono una preparazione più accurata. Applicare del gel ecografico alle estremità per garantire un'accoppiatura con il rilevatore di ECG collegato e monitorare la frequenza cardiaca. Inserire il termometro rettale per il feedback.
Controllo della temperatura corporea. Rimuovere i peli dall'addome con la crema depilatoria e risciacquare con acqua. Aprire l'addome utilizzando forbici da dissezione e pinze curve.
Esternare un corno uterino e posizionarlo su un pad di garza inumidito con soluzione salina calda. Durante tutta la procedura, mantenere umidi tutti gli embrioni e l'addome della madre. Con aggiunte periodiche di soluzione salina calda, manipolare con attenzione un embrione fino a posizionarlo correttamente per ottenere una vista paraesternale lungo l'asse del ventricolo sinistro (LV). Utilizzando la sonda ecografica, si può usare un rotolo di garza per aiutare a mantenere l'orientamento dell'embrione.
Procedere misurando la pressione in tutti gli embrioni di un corno uterino prima di ripetere il processo sull'altro corno uterino. Iniziare applicando del gel ecografico Degas preriscaldato su un topo embrionale o neonatale. Abbassare la sonda di imaging e regolare l'angolazione della piattaforma di imaging per ottenere una vista ottimale dell'asse lungo del ventricolo sinistro in proiezione parasternale.
Non regolare l'angolo della sonda perché si perderebbe l'allineamento dell'ago. Mentre si monitora l'immagine del VE sullo schermo dell'ecografo, avanzare lentamente l'ago fino a quando non si trova vicino alla base della sonda. Regolare la posizione dell'ago e della sonda, se necessario, per correggere eventuali spostamenti di allineamento.
L'immagine del topo neonato mostra un'orientazione ideale per il ventricolo sinistro, difficile da ottenere con un embrione. Iniziare a registrare i dati di pressione. Lavare delicatamente l'ago con soluzione salina e chiudere il rubinetto a tre vie rispetto alla siringa da 20 millilitri e rispetto all'atmosfera.
Osservare la pressione. Aumentare nel programma per assicurare che venga applicata una pressione minima all'ago. Avanzare lentamente l'ago fino a quando non sarà visibile al bordo dell'immagine ecografica, ma non ancora nel ventricolo sinistro.
Se necessario, regolare la posizione dell'ago per entrare nel VS all'apice. Regolare la posizione della sonda, se necessario, per mantenere un'immagine chiara dell'ago. Avanzare l'ago nel lume del VS mentre si registrano i dati di pressione e si monitora la posizione dell'ago sull'immagine ecografica.
L'inizio delle registrazioni pulsanti del trasduttore di pressione conferma la posizione all'interno della cavità del ventricolo sinistro. Se l'ago sembra trovarsi nella cavità del ventricolo sinistro, ma le registrazioni di pressione non sono pulsanti, lavare l'ago con un leggero tocco sullo stantuffo della siringa fino a quando non si rileva un aumento della pressione. Il lavaggio con fluido deve essere minimo per evitare di alterare il comportamento del cuore durante le misurazioni della pressione.
Se le letture della pressione non sono ancora pulsanti, l'ago potrebbe trovarsi al di sopra o al di sotto del piano corretto e non essere inserito nella cavità del ventricolo sinistro. Arretrare l'ago, sciacquarlo con soluzione fisiologica e avanzarlo nuovamente.
Se non si ottengono ancora letture pulsanti, passare al topo successivo e utilizzare sempre un ago nuovo per ogni topo. L'intera procedura deve essere eseguita nel modo più rapido possibile per minimizzare lo stress subito dagli embrioni e dai neonati durante l'esperimento. La pressione ventricolare di topi C 57 Black six J è stata misurata in un topo E 18.
Come previsto, la pressione era vicina a zero quando l'ago era al di fuori del ventricolo sinistro e mostrava una lettura pulsatile quando era all'interno del ventricolo sinistro per un topo P14 più anziano. La lettura della pressione era smorzata perché l'ampiezza della pressione era maggiore e la frequenza cardiaca era più elevata. Le frequenze cardiache sono state determinate a partire dalla frequenza delle letture di pressione pulsatile per diverse età comprese tra E18 e P14.
I ritmi cardiaci sono stati misurati e le pressioni sistoliche del ventricolo sinistro sono state calcolate. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordarsi di inumidire periodicamente gli embrioni e di verificare lo stato della madre. Questa tecnica apre la strada ai ricercatori in fisiologia cardiovascolare per esplorare le variazioni della pressione sanguigna nei topi in via di sviluppo.
Visualizza la trascrizione completa e accedi a migliaia di video scientifici
Panoramica
In questo articolo viene descritta una procedura per la misurazione della pressione del ventricolo sinistro (LV) in topi embrionali avanzati e neonati mediante guida ecografica. Il metodo prevede l'inserimento di un ago collegato a un trasduttore di pressione nel ventricolo sinistro, garantendo al contempo una funzione cardiaca normale.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Fisiologia cardiovascolare
- Sviluppo embrionale
- Ricerca neonatale
Sfondo
- Comprendere la pressione del ventricolo sinistro è fondamentale per lo studio della funzione cardiaca.
- Le fasi embrionale e neonatale sono cruciali per lo sviluppo del cuore.
- La guida ecografica migliora la precisione del posizionamento del catetere.
- È essenziale mantenere una funzione cardiaca normale durante le misurazioni.
Scopo dello studio
- Misurare accuratamente la pressione del ventricolo sinistro in topi embrionali e neonati.
- Utilizzare l'ultrasuono per l'imaging in tempo reale durante la procedura.
- Contribuire alla comprensione della fisiologia cardiaca nello sviluppo precoce.
Metodi Utilizzati
- Preparazione dell'attrezzatura, inclusi un trasduttore di pressione e una sonda ecografica.
- Acquisizione di immagini del ventricolo sinistro del topo mediante ecografia.
- Avanzamento dell'ago all'interno della cavità del ventricolo sinistro.
- Registrazione delle misurazioni della pressione pulsatile.
Risultati principali
- Misurazione riuscita delle pressioni sistoliche nei topi embrionali tardivi e nei neonati precoci.
- Dimostrata la fattibilità della cateterizzazione guidata da ultrasuoni.
- Forniti approfondimenti sulla funzione cardiaca durante lo sviluppo iniziale.
Conclusioni
- Il metodo consente una misurazione precisa della pressione del ventricolo sinistro in modelli animali di piccola taglia.
- La guida ecografica è efficace per mantenere la funzione cardiaca durante la procedura.
- Questa tecnica può essere utile per ulteriori studi sulla fisiologia cardiaca in biologia dello sviluppo.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La misurazione quantitativa della pressione nel ventricolo sinistro nei topi in fase tarda embrionale e nei neonati consente un'analisi precisa dello sviluppo cardiovascolare e della meccanotrasduzione in modelli rilevanti per le malattie. Questa capacità garantisce una maggiore affidabilità predittiva nella validazione degli obiettivi nella ricerca vascolare e cardiaca, specialmente nei casi in cui sono coinvolti stress meccanici e difetti della matrice extracellulare. L'integrazione di misurazioni solide della pressione nelle fasi iniziali degli studi riduce i rischi associati alle decisioni traslazionali e precliniche successive nei programmi di ricerca cardiovascolare.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Consente il test diretto di ipotesi sulla meccanotrasduzione in modelli murini geneticamente modificati.
- Permette la validazione funzionale di bersagli coinvolti nello sviluppo e nel rimodellamento vascolare.
- Fornisce parametri quantitativi per valutare l'impatto di alterazioni geniche o di percorsi molecolari sulla dinamica della pressione cardiaca.
Sviluppo di screening e saggi
- Stabilisce letture fisiologiche validate per lo screening di interventi che influenzano la funzione cardiaca o vascolare.
- Facilita la standardizzazione dei saggi fornendo misurazioni quantitative e riproducibili della pressione in tutte le fasi dello sviluppo.
- Permette un confronto affidabile degli effetti di composti o alterazioni genetiche sui parametri cardiovascolari in modelli animali di piccole dimensioni.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea modelli preclinici a fenotipi di malattie umane che coinvolgono alterazioni della pressione sanguigna e della meccanica arteriosa.
- Supporta la continuità dalla scoperta alla validazione preclinica negli studi su disturbi cardiovascolari congeniti o acquisiti.
- Fornisce una riduzione del rischio meccanicistica per strategie terapeutiche mirate alla funzione della matrice extracellulare o delle cellule muscolari lisce.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo metodo collega la fase iniziale della scoperta alla ricerca preclinica, consentendo una valutazione quantitativa basata su ipotesi della funzione cardiaca in modelli murini sviluppativamente rilevanti.
- Biologia della scoperta: Facilita il test dell'ipotesi nulla riguardo al coinvolgimento di geni o vie metaboliche nella regolazione della pressione e nella meccanotrasduzione.
- Screening: Fornisce output standardizzati e quantitativi adatti per confronti tra studi e tra diversi composti.
- Analisi: Offre dati ad alta risoluzione sulla pressione e sulla frequenza cardiaca per un'analisi statistica solida delle condizioni sperimentali.
- Ricerca traslazionale: Modella variazioni di pressione rilevanti per le malattie osservate in disturbi genetici umani che interessano l'integrità vascolare.
- Riutilizzo aziendale: Offre una piattaforma riutilizzabile per la fenotipizzazione cardiovascolare in diversi studi genetici e farmacologici.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi cardiovascolari e negli studi meccanicistici.
- Valore operativo: Standardizza la misurazione della pressione in modelli animali di piccole dimensioni e con stadi di sviluppo definiti.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione dei progetti fornendo precocemente endpoint fisiologici solidi.
- Impatto sul portafoglio: Consente la priorizzazione dei programmi cardiovascolari in base a dati funzionali quantitativi, adeguata al livello di rischio.
Considerazioni sull'Implementazione
- Richiede competenze specifiche nell'uso dell'ecografia per microiniezioni e nella fisiologia cardiovascolare dei piccoli animali.
- Impone una calibrazione precisa e la manutenzione costante del trasduttore di pressione e dei sistemi di imaging.
- Necessita di una rigorosa standardizzazione tra i diversi gruppi di lavoro per garantire la riproducibilità delle misurazioni di pressione.
- Potrebbe essere necessaria un'adattamento per diverse ceppi di topi o stadi di sviluppo.
- Le difficoltà tecniche includono il mantenimento dell'orientamento dell'embrione e la riduzione al minimo dello stress procedurale, come indicato nel protocollo.
