Name: Imaging di HIV-1 Envelope indotta Synapse virologica e segnalazione sui doppi strati lipidici sintetici (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 45 s
Description: Scopri come visualizzare la sinapsi virologica indotta dall'HIV-1 usando microscopia TIRF su doppi strati lipidici sintetici. Questo metodo permette di analizzare il reclutamento di molecole di segnalazione come LCK.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni NIH AI071815 (CEH) e la tabella di marcia Nanomedicina premio Development Center PN2EY016586 (MLD).

<ol><li>Bastiani, L., Laal, S., Kim, M., Zolla-Pazner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+cell-dependent+alterations+in+envelope+components+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+virions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Host cell-dependent alterations in envelope components of human immunodeficiency virus type 1 virions.</a> J. Virol. 71, 3444-3450 (1997).</li>
<li>Dimitrov, D. S., Willey, R. L., Sato, H., Chang, L. J., Blumenthal, R., Martin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+infection+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Quantitation of human immunodeficiency virus type 1 infection kinetics.</a> J. Virol. 67, 2182-2190 (1993).</li>
<li>Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesive+Bond+Dynamics+in+Contacts+between+T+Lymphocytes+and+Glass-supported+Planar+Bilayers+Reconstituted+with+the+Immunoglobulin-related+Adhesion+Molecule+CD58%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Adhesive Bond Dynamics in Contacts between T Lymphocytes and Glass-supported Planar Bilayers Reconstituted with the Immunoglobulin-related Adhesion Molecule CD58.</a> J. Biol. Chem. 272, 15782-15788 (1997).</li>
<li>Fortin, J. F., Cantin, R., Lamontagne, G., Tremblay, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host-derived+ICAM-1+glycoproteins+incorporated+on+human+immunodeficiency+virus+type+1+are+biologically+active+and+enhance+viral+infectivity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Host-derived ICAM-1 glycoproteins incorporated on human immunodeficiency virus type 1 are biologically active and enhance viral infectivity.</a> J. Virol. 71, 3588-3596 (1997).</li>
<li>Frank, I., Stoiber, H., Godar, S., Stockinger, H., Steindl, F., Katinger, H. W., Dierich, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acquisition+of+host+cell-surface-derived+molecules+by+HIV-1%5BTitle%5D)+AND+%22Aids%22%5BJournal%5D)">Acquisition of host cell-surface-derived molecules by HIV-1.</a> Aids. 10, 1611-1620 (1996).</li>
<li>Hioe, C. E., Bastiani, L., Hildreth, J. E., Zolla-Pazner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+cellular+adhesion+molecules+in+HIV+type+1+infection+and+their+impact+on+virus+neutralization%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS+Res.+Hum.+Retroviruses%22%5BJournal%5D)">Role of cellular adhesion molecules in HIV type 1 infection and their impact on virus neutralization.</a> AIDS Res. Hum. Retroviruses. 14, Suppl 3. S247-S254 (1998).</li>
<li>Hioe, C. E., Chien, P. C., Lu, C., Springer, T. A., Wang, X. H., Bandres, J., Tuen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LFA-1+expression+on+target+cells+promotes+human+immunodeficiency+virus+type+1+infection+and+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">LFA-1 expression on target cells promotes human immunodeficiency virus type 1 infection and transmission.</a> J. Virol. 75, 1077-1082 (2001).</li>
<li>Jolly, C., Kashefi, K., Hollinshead, M., Sattentau, Q. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+cell+to+cell+transfer+across+an+Env-induced%2C+actin-dependent+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">HIV-1 cell to cell transfer across an Env-induced, actin-dependent synapse.</a> J. Exp. Med. 199, 283-293 (2004).</li>
<li>Jolly, C., Mitar, I., Sattentau, Q. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+for+an+intact+T-cell+actin+and+tubulin+cytoskeleton+for+efficient+assembly+and+spread+of+human+immunodeficiency+virus+type+1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Requirement for an intact T-cell actin and tubulin cytoskeleton for efficient assembly and spread of human immunodeficiency virus type 1.</a> J. Virol. 81, 5547-5560 (2007).</li>
<li>McDonald, D., Wu, L., Bohks, S. M., KewalRamani, V. N., Unutmaz, D., Hope, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recruitment+of+HIV+and+its+receptors+to+dendritic+cell-T+cell+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Recruitment of HIV and its receptors to dendritic cell-T cell junctions.</a> Science. 300, 1295-1297 (2003).</li>
<li>Pearce-Pratt, R., Malamud, D., Phillips, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+cytoskeleton+in+cell-to-cell+transmission+of+human+immunodeficiency+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Role of the cytoskeleton in cell-to-cell transmission of human immunodeficiency virus.</a> J. Virol. , 682898-682905 (1994).</li>
<li>Rasband, W. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRasband%2C+WS+%22ImageJ%22">ImageJ</a>. , National Institutes of Health. Bethesda, Maryland, USA. (1997).</li>
<li>Rizzuto, C. D., Sodroski, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+virion+ICAM-1+to+human+immunodeficiency+virus+infectivity+and+sensitivity+to+neutralization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Contribution of virion ICAM-1 to human immunodeficiency virus infectivity and sensitivity to neutralization.</a> J. Virol. 71, 4847-4851 (1997).</li>
<li>Vardhana, S., Dustin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supported+Planar+Bilayers+for+the+Formation+of+Study+of+Immunological+Synapses+and+Kinapse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Supported Planar Bilayers for the Formation of Study of Immunological Synapses and Kinapse.</a> J. Vis. Exp. (19), e947-e947 (2008).</li>
<li>Vasiliver-Shamis, G., Cho, M. W., Hioe, C. E., Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+immunodeficiency+virus+type+1+envelope+gp120-induced+partial+T-cell+receptor+signaling+creates+an+F-actin-depleted+zone+in+the+virological+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Human immunodeficiency virus type 1 envelope gp120-induced partial T-cell receptor signaling creates an F-actin-depleted zone in the virological synapse.</a> J. Virol. 83, 11341-11355 (2009).</li>
<li>Vasiliver-Shamis, G., Tuen, M., Wu, T., Starr, T., Cameron, T., Thomson, R., Kaur, G., Liu, J., Visciano, M., Li, H., Kumar, R., Ansari, R., Han, D., Cho, M., Dustin, M. L., Hioe, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+immunodeficiency+virus+type+1+envelope+gp120+induces+a+stop+signal+and+virological+synapse+formation+in+noninfected+CD4%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Human immunodeficiency virus type 1 envelope gp120 induces a stop signal and virological synapse formation in noninfected CD4+ T cells.</a> J. Virol. 82, 9445-9457 (2008).</li>
<li>Zhu, P., Liu, J., Bess, J., Chertova, E., Lifson, J., Grise, H., Ofek, G., Taylor, K., Roux, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+and+three-dimensional+structure+of+AIDS+virus+envelope+spikes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Distribution and three-dimensional structure of AIDS virus envelope spikes.</a> Nature. 441, 847-852 (2006).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano assenza di conflitto di interessi.

Studi precedenti hanno VS visualizzato nella cellula-cellula sistema coniugato, tuttavia questi studi non hanno fornire immagini di alta risoluzione sufficiente per visualizzare le strutture supramolecolari alla sinapsi. Nel nostro laboratorio, abbiamo utilizzato il vetro supportato sistema bistrato planare per rappresentare la superficie di cellule infettate esprimono gp120 il virus e la molecola di adesione cellulare ICAM-1. In combinazione con la microscopia TIRF, che rileva segnali di fluorescenza entro 100-200 nm dalla superficie doppio strato con un alto rapporto segnale-rumore, siamo stati in grado di rilevare la segregazione supramolecolare di gp120 da ICAM-1 a VS. Inoltre, il metodo immunostaining standard può essere applicato al sistema doppio strato ed è stato usato qui per rilevare e quantificare il reclutamento specifico di Lck attivo, ma non Fyn, la gp120-area di contatto a VS 15. Quindi, il bistrato planare offre un sistema sperimentale per immagini ad alta risoluzione dell&#39;interfaccia sinapsi in un piano 2D TIRF microscopia, così come i metodi di illuminazione a largo campo o confocale. Tuttavia, il sistema presenta anche limitazioni regolazione mobilità ligando, fuori piano di piegatura, e le fluttuazioni di membrane biologiche non riprodotta da doppi strati planari. Inoltre, questo è un sistema in-vitro e quindi ha limitazioni, quali la mancanza di altre molecole di membrana che sarebbe presente in una cellula infettata e la macchina citoscheletro che regola la mobilità molecolare e la motilità cellulare. Inoltre, la dinamica e la distribuzione delle molecole, come trimeri rispetto monomeri di gp120, non può essere rappresentato fisiologicamente sul doppio strato. Tuttavia, anche con queste limitazioni, questo sistema è ancora molto utile per studiare virus-cellula o interazioni cellula-cellula, e questi metodi possono servire come guida utile per i ricercatori che ricercano immagini ad alta risoluzione per rilevare organizzazione supramolecolare che non è distinguibile nel convenzionale cellula-cellula sistema coniugato.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Comments </td></tr><tr><td> Il suo tag HIV gp120 </td><td> Regalo da Dr. Cho </td><td></td><td> DH12 </td></tr><tr><td> Il suo tag HIV gp120 </td><td> Tecnologia Immune </td><td></td><td> Vari X4 o R5 tropico </td></tr><tr><td> HSA </td><td> Williams Medical Company </td><td> 521302 </td><td> Albumina di siero umano al 25% </td></tr><tr><td> Amicon Filtri ultracentrifugo </td><td> Millipore </td><td> UFC803024 </td><td> Ultracel-30K </td></tr><tr><td> Lck Coniglio mAb </td><td> Segnalazione cellulare </td><td> 2787 </td><td></td></tr><tr><td> p-Lck Coniglio pab </td><td> Santa Cruz Biotechnology Inc. </td><td> Sc-101728 </td><td> Tyr 394 </td></tr><tr><td> Fyn Coniglio mAb </td><td> Millipore </td><td> 04-353 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor 568 2 °; Ab </td><td> Molecular Probes </td><td> A11034 </td><td> Capra anti-coniglio IgG (H + L) </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 </td><td> Molecular Probes </td><td> A-20000 </td><td> carbossilico succinimmidil estere </td></tr><tr><td> FCS2 Camera </td><td> Bioptechs </td><td> 060319-2-03 </td><td></td></tr><tr><td> Microaqueduct diapositive </td><td> Bioptechs </td><td> 130119-5 </td><td></td></tr><tr><td> 30 millimetri rotonda w / fori </td><td> Bioptechs </td><td> 1907-08-750 </td><td> 0,75 millimetri di spessore </td></tr><tr><td> Rettangolo Guarnizione </td><td> Bioptechs </td><td> 1907-1422-250 </td><td> 14x24 0,25 millimetri di spessore </td></tr><tr><td> Tygon Tubing </td><td> Bioptechs </td><td> 20202275 </td><td> 1/16 &quot;(25 piedi) </td></tr><tr><td> Valvola a tre vie </td><td> BioRad </td><td> 7328103 </td><td></td></tr><tr><td> Rubinetto a due vie </td><td> BioRad </td><td> 7328102 </td><td></td></tr><tr><td> Presentazione Sticky I 0,2 Luer </td><td> Ibidi </td><td> 80168 </td><td></td></tr><tr><td> Coprire gli occhiali </td><td> Ibidi </td><td> 10812 </td><td></td></tr><tr><td> Siringa da 1 ml </td><td> BD </td><td> 309659 </td><td></td></tr><tr><td> CANI-NTA </td><td> Avanti Polar Lipids </td><td> 790404C </td><td></td></tr><tr><td> DOPC </td><td> Avanti Polar Lipids </td><td> 850375C </td><td></td></tr><tr><td> Vetrino coprioggetto </td><td> Bioptechs </td><td> 40-1313-0319 </td><td> 40 millimetri </td></tr><tr><td> TIRF microscopio </td><td> Nikon </td><td></td><td></td></tr><tr><td> ImageJ </td><td> National Institutes of Health </td><td></td><td> <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/~~V</a> </td></tr></tbody></table>

imaging di hiv-1 envelope indotta synapse virologica e segnalazione sui doppi strati lipidici sintetici

Imaging of HIV-1 Envelope-induced Virological Synapse and Signaling on Synthetic Lipid Bilayers

Virus dell&#39;immunodeficienza umana di tipo 1 (HIV-1) l&#39;infezione si verifica in modo più efficiente per la trasmissione via cellulare delle cellule 2,10,11. Questa cellula di trasferimento di celle tra cellule T CD4 + comporta la formazione di una sinapsi virologica (VS), che è un F-actina-dipendente cellula-cellula giunzione formata per l&#39;impegno di HIV-1 gp120 busta sulla cellula infettata con CD4 e il recettore di chemiochina (CKR) CXCR4 o CCR5 sulla cellula bersaglio 8. Oltre a gp120 e suoi recettori, proteine ​​di membrana altri, in particolare la molecola di adesione LFA-1 e dei suoi ligandi, la famiglia ICAM, giocano un ruolo importante nella formazione VS e la trasmissione del virus come sono presenti sulla superficie di cellule infettate da virus donatore e cellule bersaglio, nonché sulla busta di HIV-1 virioni 1,4,5,6,7,13. Formazione VS è accompagnata anche da eventi intracellulari di segnalazione che sono trasdotti come risultato di gp120-impegno dei suoi recettori. Infatti, abbiamo recentemente dimostrato che i CD4 &lt;sup&gt; + l&#39;interazione delle cellule T con gp120 induce il reclutamento e la fosforilazione di molecole di segnalazione associate al TCR signalosome compresa Lck, CD3ζ, ZAP70, LAT, SLP-76, ITK, e PLCγ 15. In questo articolo, vi presentiamo un metodo per visualizzare arrangiamento supramolecolare e membrana-prossimali segnalazione eventi che si svolgono durante la formazione VS. Prendiamo vantaggio del vetro supportato planare bi-strato come sistema modello riduzionista per rappresentare la superficie di cellule infettate da HIV recanti l&#39;involucro virale gp120 e la molecola di adesione cellulare ICAM-1. Il protocollo descrive procedure generali per monitorare HIV-1 gp120 indotta VS assemblaggio e gli eventi di attivazione del segnale che comprendono i) bi-strato di preparazione e di montaggio in una cella di flusso, ii) iniezione di cellule e immunofluorescenza per rilevare molecole di segnalazione intracellulare in cellule interagenti con HIV-1 gp120 di acquisizione immagini e ICAM-1 in bi-strati, iii) da microscopia TIRF, unond iv) l&#39;analisi dei dati. Questo sistema genera immagini ad alta risoluzione di interfaccia VS al di là di quello ottenuto con la tradizionale cellula-cellula del sistema in quanto permette di individuare gruppi distinti di singoli componenti molecolari di VS insieme con le molecole di segnalazione specifici assunti a queste sub-domini.

Questo articolo descrive un metodo per visualizzare la formazione di una sinapsi HIV-1 busta-indotta virologici vetro bistrati planari supportate da fluorescenza riflessione interna totale (TIRF) microscopia. Il metodo può anche essere combinato con immunofluorescenza per rilevare l&#39;attivazione e ridistribuzione di molecole di segnalazione che si verificano durante HIV-1 busta indotta la formazione di sinapsi virologica.

Imaging di HIV-1 Envelope indotta Synapse virologica e segnalazione sui doppi strati lipidici sintetici

L'infezione da virus dell'immunodeficienza umana di tipo 1 (HIV-1) avviene in modo più efficiente tramite la trasmissione da cellula a cellula2,10,11. Questo trasferimento da cellula a cellula tra ...

Questo metodo crea bilayer lipidici che imitano la superficie di una cellula infetta. Per studiare la sinapsi virologica dell'HIV formata con linfociti T CD4 primari umani, etichettare innanzitutto le proteine di interesse con coloranti fluorescenti, quindi creare bilayer lipidici e permettere alle cellule di formare sinapsi, fissare e colorare le cellule con anticorpi fluorescenti per la visualizzazione delle molecole di segnalazione. Successivamente, mediante microscopia a fluorescenza con riflessione totale interna o microscopia TIRF, acquisire immagini delle molecole di segnalazione all'interno delle cellule in formazione della sinapsi.Analizzare le immagini del coltame per delimitare la localizzazione delle molecole di segnalazione attive in relazione alla struttura della sinapsi virologica. Questo approccio sperimentale può indicare se proteine cellulari come la tirosina chinasi specifica dei linfociti LCK vengono reclutate nella sinapsi virologica dell'HIV. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nella virologia e nell'immunologia dell'HIV, come ad esempio quali componenti cellulari sono coinvolti nella sinapsi virologica.Qual è il ruolo nella formazione della sinapsi e in che modo potrebbe influenzare il trasferimento dell'HIV da cellula a cellula. Questo sistema bier fornisce una visione finale della sinapsi con il vantaggio di visualizzare la sinapsi con elevata risoluzione spaziale in un singolo piano. I risultati rappresentano chiaramente la struttura sinaptica, formando il bier e assemblando la cella a flusso è un kinter, un'arte.Qui mostriamo la preparazione del bilar sulla cella ottica biflussuale per studi che utilizzano virus infettivi o cellule infette, o quando è necessario utilizzare piccoli volumi a causa della limitata disponibilità di reagenti. Le celle a flusso monouso OB possono essere utilizzate con la stessa procedura di preparazione del bilar. Michael Kramer e io dimostreremo una procedura per marcare le proteine.Selezionare coloranti fluorescenti come LOR 4 88 che siano efficaci nell'associarsi alle proteine, sufficientemente fotostabili per l'immagine al microscopio e compatibili con le lunghezze d'onda di eccitazione dei laser disponibili sull'apparecchiatura microscopica. Iniziare con la proteina purificata GP one 20 DH 12 con tag his. Scambiare il tampone della proteina con PBS sterile utilizzando un filtro centrifugo con cutoff di peso molecolare di 50 kilodalton.Successivamente, verificare il pH e aggiungere bicarbonato di sodio a pH 9,0 per ottenere una concentrazione finale di 50 millimolari di bicarbonato di sodio con un pH di circa 8,5. Quindi aggiungere un colorante fluorescente LOR 4 88 reattivo medio in eccesso molare dieci volte. Incubare questa miscela al buio per 45 minuti fino a un'ora.Procedere alla rimozione del colorante in eccesso utilizzando un'unità filtrante centrifuga. Aggiungere PBS sterile fresco alla colonna e continuare a lavare la proteina dal colorante libero. Quindi concentrare la proteina GP one 20 a circa un milligrammo per millilitro.Misurare la concentrazione del colorante fluorescente a 488 nanometri. Determinare inoltre la concentrazione proteica mediante uno spettrofotometro NanoDrop, utilizzando l'impostazione per proteine ed etichette.Dividere i due numeri per determinare l'intensità di fluorescenza per molecola di proteina. Preparare una soluzione di piranha con 45 millilitri di acido solforico e 15 millilitri di perossido di idrogeno al 30% utilizzando pinze di plastica. Immergere i coprioggetti per 15 minuti.Trasferire le lamelle in un becher riempito con acqua purificata PIKA. Lavare ogni lamella sotto acqua corrente per due minuti, un minuto per ciascun lato, e posizionarle su un supporto per farle asciugare. Procedere quindi a montare, mediante ottica F CS, due camere come precedentemente descritto da Varona et al. 2008. Successivamente, catturare e presentare il segnale GP one 20 sulla superficie del doppio strato lipidico senza far toccare la punta al vetro.Usare una pipetta per depositare cinque gocce da un microlitro di miscela di liposomi su un vetrino con microcanale per preparare cinque bicapati per ogni camera di flusso. Posizionare ora un coprioggetto sopra i lipidi. Successivamente, coprire l'anello di ritenzione bianco con una base di fissaggio in acciaio inossidabile.Ruotare l'intero apparato e sigillare. Quindi segnare la posizione dei bilayer e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, collegare un tubo con un rubinetto a due vie al tubo di perfusione sinistro.Riempire il tubo collegato a un rubinetto a tre vie con albumina sierica umana al 1% in soluzione salina tamponata con eparina e verificare che l'allestimento sia privo di bolle. Collegare ora questo tubo al tubo di perfusione destro e generare un menisco positivo. Spingere delicatamente il tampone attraverso la cella a flusso per bloccare il bilayer.Collegare una siringa da un millilitro contenente 300 microlitri di caseina al cloruro di nichel 100 micromolare al rubinetto a tre vie, spingere delicatamente il tampone attraverso entrambi i rubinetti prima di staccare la siringa. Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente.Ora caricate 250 molecole di LOR 4 88 marcate con hiss e GP uno 20 per micron per mimare la densità locale di aggregati presenti sulla superficie di HIV V uno. Incubate per 30 minuti al buio a temperatura ambiente, lavate per strati con cinque millilitri di tampone H-B-S-H-S-A. Equilibrate la cella a flusso a 37 gradi Celsius.Utilizzando una siringa da un millilitro, aggiungere le cellule T attivate CD4 positive in 400 microlitri di soluzione al 1% di albumina sierica umana e incubare per 45 minuti in un incubatore a 37 gradi Celsius per consentire l'adesione delle cellule allo strato lipidico. Successivamente, per fissare le cellule, aggiungere paraformaldeide al 2%, quindi incubare per 10 minuti a 37 gradi Celsius. Lavare tre volte con un millilitro.Successivamente permeabilizzare le cellule aggiungendo 0,1% di Triton X-100 per cinque minuti a temperatura ambiente, dopo aver eseguito tre lavaggi con un millilitro di PBS. Bloccare con caseina contenente siero di capra al 5% per 25 minuti a temperatura ambiente, quindi lavare tre volte con PBS. Aggiungere quindi l'anticorpo primario e 300 microlitri di tampone per ogni camera di flusso, per un periodo compreso tra 20 minuti e un'ora.A temperatura ambiente, dopo tre lavaggi con PBS, aggiungere l'anticorpo secondario marcati con fluorocromo appropriato nel buffer. Nell'esperimento, il campione di controllo per strato viene trattato solo con l'anticorpo secondario per determinare il livello di segnale non specifico proveniente da questo reagente. Incubare per 20 minuti a temperatura ambiente, quindi lavare tre volte con un millilitro.Acquisire immagini di tutti i campioni mediante riflessione totale interna in PBS. Microscopia a fluorescenza. Eseguire un'analisi quantitativa delle immagini con un pacchetto applicativo di analisi delle immagini, come ImageJ nella scheda Analizza Impostazioni Misurazioni.Selezionare le caselle per l'area e il valore medio di grigio. Selezionare una regione di interesse nell'immagine che sia un poligono o una forma chiusa tracciata a mano libera. Quindi selezionare la scheda analizza misura affinché il software registri i dati da questa misurazione.In una tabella dei risultati, impostare le misurazioni su media e area, quindi aprire le immagini per una condizione sperimentale per ogni tracciato cellulare e misurare la regione di interesse e il tracciato, oltre a misurare una regione di fondo per ogni condizione sperimentale. Copiare le misurazioni e incollarle in Excel. Una volta raccolti tutti i dati, calcolare l'intensità media in unità arbitrarie.Sottrarre l'intensità di fondo dalla media, quindi moltiplicare per l'area per ottenere l'intensità integrata della proteina in unità arbitrarie, al fine di misurare l'attivazione e il reclutamento delle molecole iniziali di segnalazione prossimali alla membrana. A seguito dell'interazione con GP120 alla sinapsi virologica, linfociti T primari umani positivi per CD4 sono stati aggiunti su bistrati contenenti G120 e ICAM1; le cellule aggiunte su bistrati contenenti solo ICAM1 sono state utilizzate come controllo per definire i livelli basali di segnalazione. Dopo che le cellule hanno interagito con bistrati contenenti GP120 e ICAM1, la proteina LCK è stata reclutata all'interfaccia della sinapsi virologica ed è risultata colocalizzata con GP120.L'intensità media della LCK totale era più elevata sul bistrato contenente sia GP uno 20 che ICAM uno rispetto a ICAM uno da solo. Curiosamente, i livelli di intensità integrata erano simili. Nel complesso.Questi dati suggeriscono che LCK viene ridistribuito in un aggregato centrale. Dopo il legame delle cellule T CD4 positive a GP120, qui sono state immaginate e quantificate le intensità medie e integrate della tirosina 394 fosforilata di LCK rilevate mediante microscopia TURF.I risultati indicano che il legame di GP120 ha aumentato la fosforilazione del residuo tirosina 394 nel loop di attivazione di LCK. Al contrario, era presente una maggiore quantità di Finn nell'area di contatto delle cellule su bilayer contenenti solo ICAM-1 rispetto ai bilayer contenenti sia GP120 che ICAM-1. Pertanto, Finn non è stato reclutato nella sinapsi virologica.Di conseguenza, concludiamo che LCK, e non Finn, è la chinasi attiva nella sinapsi virologica indotta dall'HIV-1 GP-120. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione su come preparare bilayer arricchiti con proteine specifiche, eseguire una colorazione immunofluorescente sulle interazioni tra cellule e bilayer mediante microscopia a riflessione totale interna e condurre un'analisi di base. Questo sistema bilayer è inoltre utile per l'immagineggiamento di cellule vive, in cui è possibile monitorare la dinamica della formazione delle sinapsi virologiche.Inoltre, le cellule possono essere trasfettate con proteine marcate con fluorocromo come GFPs Z 70. Ciò consente di seguire in tempo reale i cambiamenti nella distribuzione e il reclutamento di molecole di segnalazione alla sinapsi.

imaging-hiv-1-envelope-induced-virological-synapse-signaling-on

Research

Ricerca

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Supportati doppi strati planari sono strumenti potenti che possono essere utilizzati per modellare le interazioni molecolari in una sinapsi immunologica. Qui vi mostriamo i metodi per l'ancoraggio delle proteine ​​di adesione cellulare conosciuto per modulare la formazione di sinapsi il foglio superiore della bilyer lipidi e visualizzare formazione di sinapsi usando la microscopia TIRF.

Supportato bilayers Planar per la formazione degli Studi di sinapsi immunologica e Kinapse

Il protocollo descrive un approccio high-throughput per determinare le strutture di proteine ​​di membrana con crio-elettroni tomografia ed elaborazione delle immagini 3D. Esso copre i dettagli della preparazione dei campioni, raccolta, elaborazione e interpretazione dei dati, e si conclude con la produzione di un bersaglio rappresentante per l'approccio, l'HIV-1 glicoproteina Busta. Queste procedure di calcolo sono stati progettati in un modo che consente ai ricercatori e agli studenti di...

Determinazione di strutture molecolari di glicoproteine ​​dell&#39;HIV Busta con Cryo-Electron Positron e automatizzato Sub-tomogramma Averaging

Source: Olety, B., et. al., Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle (GUV) Membranes. J. Vis. Exp. (2016)This study demonstrates a fluorescence-based assay to observe the membrane-binding behavior of human immunodeficiency virus type-1 structural protein. Using synthetic giant unilamellar vesicles as model membranes, the assay visualizes protein recruitment and assembly, mimicking early steps of viral particle formation.

Visualizing Viral Structural Protein Assembly on Giant Unilamellar Vesicle Membranes

Questo video mostra una tecnica per visualizzare la formazione della sinapsi immunologica nelle cellule natural killer (NK) su un doppio strato lipidico supportato (SLB). L'SLB viene prima marcato con un ligando del recettore attivante delle cellule NK marcato con fluoroforo, seguito dall'incubazione con cellule NK. Successivamente, le cellule vengono colorate per l'actina polimerizzata e i granuli litici perforin-positivi. Questo approccio consente la visualizzazione della formazione delle...

Imaging a super-risoluzione della formazione di sinapsi immunologiche delle cellule NK su un doppio strato lipidico supportato

Questo video dimostra una tecnica in vitro per studiare la formazione di sinapsi immunitarie tra le cellule T umane primarie e i doppi strati lipidici supportati (SLB). Le proteine della superficie delle cellule T interagiscono con i rispettivi ligandi immobilizzati su SLB per formare una sinapsi immunitaria, seguita dal movimento dei granuli litici verso la sinapsi, che viene visualizzato utilizzando la microscopia a fluorescenza.

Una tecnica in vitro per studiare l'interazione delle cellule T con i doppi strati lipidici planari supportati

Questo video mostra l'imaging di cellule vive della topologia immunologica delle sinapsi, studiando le interazioni tra i linfociti T e le cellule epiteliali che trasportano antigeni fluorescenti. La microscopia a fluorescenza rivela lo spostamento del citoplasma rosso e gli anelli gialli della membrana nelle cellule endoteliali, indicando la formazione di sinapsi immunologiche.

Valutazione della topologia immunologica delle sinapsi attraverso l'imaging di cellule vive

Comprendere le conformazioni degli antigeni di superficie virali è necessario per valutare la neutralizzazione degli anticorpi e guidare la progettazione di immunogeni efficaci per i vaccini. Qui descriviamo un test ELISA basato su cellule che consente lo studio del riconoscimento di HIV-1 Env trimero espresso sulla superficie di cellule trasfettate da specifici anticorpi anti-Env.

Valutazione conformazionale di HIV-1 trimeric busta glicoproteine ​​Utilizzando una base di Cell-ELISA Saggio

Descriviamo qui una combinazione della tecnica del doppio strato lipidico supportato da vetro per formare sinapsi immunologiche con la tecnica di imaging a super-risoluzione della microscopia STED (Stimulated Emission Depletion). L'obiettivo di questo protocollo è fornire agli utenti le istruzioni necessarie per eseguire con successo queste due tecniche.

Super-Resolution Imaging di cellule Natural Killer immunologica Sinapsi su un vetro supportato Planar doppio strato lipidico

L'immunità adattativa è controllata da 'sinapsi immunologiche' dinamiche formate tra le cellule T e le cellule presentanti l'antigene. Questo protocollo descrive i metodi per studiare le cellule endoteliali sia come APC fisiologiche poco studiate sia come un nuovo tipo di "modello di APC cellulare planare".

Un modello cellule endoteliali Planar for Imaging immunologiche Synapse Dynamics

Illustriamo qui un saggio di legame della membrana in vitro in cui le interazioni tra HIV-1 Gag e le membrane lipidiche vengono analizzate visivamente utilizzando Gag con tag YFP sintetizzato in un sistema di traduzione in vitro basato su germe di grano e GUVs preparati con una tecnica di elettroformazione.

Visualizzazione del virus HIV-1 gag rilegatura a Giant unilamellari vescicole (GUV) Membrane

Questo protocollo immagini sia la formazione di sinapsi immunologica che il successivo traffico secretoria polarizzato verso la sinapsi immunologica. I coniugati cellulari si formarono tra una cellula Raji dal polso superantigeno (che fungeva da cellula che presenta l'antigene) e un clone di Jurkat (che fungeva da aiutante echeggiatore del linfocito T).

Immaginare la sinapsi immunologica umana

Scopri come visualizzare la sinapsi virologica indotta dall'HIV-1 usando microscopia TIRF su doppi strati lipidici sintetici. Questo metodo permette di analizzare il reclutamento di molecole di segnalazione come LCK.

Imaging di HIV-1 Envelope indotta Synapse virologica e segnalazione sui doppi strati lipidici sintetici

Esplora altri video