Name: Delle cellule endoteliali Co-cultura Maturazione media di Cellule Staminali embrionali umane a cellule pancreas che producono insulina in un approccio di differenziazione Regia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: Scopri la differenziazione multi-stadio di cellule staminali embrionali umane in cellule pancreatiche produttrici di insulina mediante co-coltura con cellule endoteliali. Questo protocollo migliora la maturazione cellulare per la ricerca sul diabete.

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1. Cella di manutenzione <ol><li> HESC H1 (WiCell) sono stati mantenuti hESC qualificati Matrigel pozzi rivestiti con mTeSR1 media, con i media cambiano ogni giorno. I pozzetti sono stati rivestiti con una soluzione diluita matrigel, preparata aggiungendo 300 pl di Matrigel hESC in 25 ml di DMEM: F12. 1 ml di questa soluzione Matrigel è stato aggiunto a ciascun pozzetto di una piastra ben sei, o 400 microlitri aggiunti a ciascun pozzetto di una piastra da 12 pozzetti e lasciate rivestimento per 1 ora a temperatura ambiente. Le cellule sono state meccanicamente diversi passaggi in un rapporto di divisione di 1:4 raschiando colonie, una volta raggiunto tra 1 e 1,5 millimetri di diametro. </li><li> RHMVEC (tecnologie VEC) è stata mantenuta in MCDB 131-supporto con mezzi modificare ogni altro giorno. Le cellule sono state suddivise per tripsinizzazione volta 80% di confluenza è stato raggiunto in un rapporto di divisione di 1:3. Le cellule endoteliali tra i passaggi 3 e 7 sono stati usati per questo studio. </li></ol> 2. Preparazione delle soluzioni madre <ol><li> Activin A è stato ricostituito a 50 ug / ml in P sterileBS contenente 0,1% di siero albumina bovina. La soluzione è stata aliquotati e conservati a -20 ° C. </li><li> FEG è stato ricostituito a 500 ug / ml sterile in 10 mM di acido acetico. La soluzione è stata aliquotati e conservati a -20 ° C. </li><li> L&#39;insulina è stato ricostituito a 10 mg / ml aggiungendo acidificata H 2 O (pH ≤ 2), preparato tramite aggiunta di 0,1 ml di acido acetico glaciale a 10 ml di acqua. </li><li> DAPT è stato ricostituito in DMSO a 18 mg / ml. È stato ulteriormente diluito a concentrazione 300 pM in DMEM: F12, aliquotati e conservati a -20 ° C. </li><li> KAAD-Cyclopamine è stato ricostituito in DMSO a 5mg/ml. Essa è stata ulteriormente diluita al 2 concentrazione pM in DMEM: F12, aliquotati e conservati a -20 ° C. </li><li> Acido all-trans retinoico è stato ricostituito a 2,7 mg / ml in etanolo al 95%. Essa è stata ulteriormente diluita alla concentrazione 2mM in DMEM: F12, aliquotati e conservati a -80 ° C. </li></ol> 3. Endoderma definitivo (DE) e Progenitore pancreatico (PP) Induzione <ol><li> Una volta che hColonie ESC raggiunto tra 1 e 1,5 millimetri di diametro, DE induzione è stata eseguita aggiungendo DMEM: F12 supplementato con B27, 0,2% BSA, 100 ng / ml Activin A e 1 pM Wortmannin per 4 giorni (giorno 0-Day 4) con mezzi cambiano ogni giorno. </li><li> Dopo l&#39;induzione DE era completa, capostipite di induzione del pancreas è stata indotta cambiando i media DMEM: F12 integrato con B27, 0.2% BSA e KAAD-Cyclopamine alla concentrazione di 0,2 uM per 24 ore (Giorno 4 Giorno 5). </li><li> Dopo 24 ore i media è stato cambiato in DMEM: F12 integrato con B27, 0,2% di BSA, KAAD-Cyclopamine concentrazione a 0,2 micron e acido all-trans retinoico a 2 concentrazione uM per 3 giorni con i media cambiano ogni giorno (Day 5-Day 8) . </li></ol> 4. Maturazione del pancreas <ol><li> Dopo induzione PP, tutti i gruppi sono stati cambiati per supporti maturazione composto di DMEM: F12 supplementato con B27, 0,2% BSA, 10 Nicotinamide mM, 25 pg / ml di insulina, 30 nM Na 2 ug SeO 3 e 50 / ml transferrina per 2 days con i media cambiano ogni giorno (Day 8-Day 10). </li><li> Dopo 2 giorni a mezzi di maturazione, la fase di maturazione finale viene effettuata in parallelo utilizzando diverse condizioni per il confronto. Differenziazione stata indotta nelle seguenti condizioni: (i) utilizzando tacca inibitore DAPT (ii) mediante co-coltura supporto soltanto, senza cellule endoteliali come controllo e (iii) mediante contatto co-coltura con cellule RHMVEC. Le cellule sono state mantenute in media DAPT o co-coltura per una settimana (giorno 10-Day 17) con i media cambiano ogni giorno. <ol><li> Supporto DAPT è stato preparato integrando i mezzi di comunicazione di maturazione con 30 DAPT pM. Cellule in questo gruppo sono stati esposti a completare MCDB131 per 24 ore e poi esposto a supporti DAPT per 6 giorni (Day 11-Day 17). </li><li> Co-coltura è stato preparato mediante mezzi integrandolo MCDB 131-B27 con supporti, 0,2% BSA, 10 Nicotinamide mM, 10 ng / ml EGF, 1 pg / ml di idrocortisone, 10 mg EndoGro, 90 mcg / ml di eparina. Per la condizione di controllo dei media di differenziazione le cellule sono state espostea MCDB-131 terreno completo per 24 ore (Giorno 10-11 ° giorno) dopo che è stato cambiato i media a co-cultura dei media per 6 giorni (11 ° giorno-Day 17) (assenza di cellule endoteliali). </li><li> Per il contatto co-coltura condizione, un milione RHMVEC è stato aggiunto alle cellule differenziano in completo MCDB-131 mezzi (tecnologie VEC) per 24 ore (giorno 10-11 ° giorno) per consentire allegato. Dopo 24 ore i media è stato cambiato in co-cultura dei media per 6 giorni (11-Day Day 17) con i media cambiano ogni giorno. </li></ol></li></ol> 5. qRT-PCR <ol><li> Al termine di ciascuna fase di differenziazione (endoderma; progenitore pancreatiche, isolotto maturo) sono state lisate e RNA è stato estratto usando il kit di estrazione di RNA NucleoSpin II secondo le istruzioni del produttore. </li><li> RNA è stato analizzato qualità controllando RNA assorbanza a 260 nm e 280 nm, seguita da quantificazione RNA utilizzando uno spettrofotometro SmartSpec Plus.. </li><li> Trascrizione inversa è stata eseguita usando ImProm k trascrizione inversa IIsecondo le istruzioni del produttore. Tutte le reazioni sono state eseguite con 100 ng di RNA. </li><li> qRT-PCR è stata eseguita utilizzando il Mx3005P QPCR sistema (Agilent) e Brilliant II SYBR Green QPCR master mix secondo le istruzioni del produttore. Gli inneschi usati sono elencati nella tabella 1. La fase di inizializzazione è stata eseguita a 50 ° C per 2 minuti seguiti da 95 ° C per 10 minuti. 50 cicli di amplificazione sono state eseguite come segue: 95 ° C per 30 secondi, 54 ° C per 30 secondi e 72 ° C per 1 minuto. </li><li> Fold change di espressione di mRNA in cellule indifferenziate è stata calcolata a partire dai valori CT utilizzando le seguenti formule: ACT (Marker i) = CT (Marker i) - CT (GAPDH) Δ ACT (marcatori i) = ACT (Marker i) (Sample) - ACT (Marker i) (cellule indifferenziate) Espressione relativa (Marker i) = 2-ΔΔCT(Marker i) </li></ol> 6. Immunocitochimica <ol><li> Al termine di ciascuna fase di differenziazione (endoderma; progenitore pancreatiche, isolotto maturo) cellule sono state fissate in formaldeide 4% per 15 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Le cellule sono state fissi permeabilizzate con 0,25% Triton X-100 (TX) per 15 minuti. </li><li> Marcatura non specifica è stata bloccata mediante incubazione in siero asino 10% in 0,05% TX per 30 minuti. </li><li> L&#39;anticorpo primario incubazione è stata eseguita la notte a 4 ° C in tampone di bloccaggio alla diluizione anticorpo raccomandata (vedi tabella 1). </li><li> Le cellule sono state lavate con 0,05% TX tre volte per 5 minuti. </li><li> Incubazione anticorpo secondario è stata eseguita per un&#39;ora a temperatura ambiente al buio con anticorpi appropriati diluiti in tampone di bloccaggio. </li><li> Le cellule sono state lavate con 0,05% TX tre volte per 5 minuti. </li><li> Colorazione nucleare è stata eseguita da incubazione con Hoescht macchia di diluizione 1:1000 in PBSper 5 minuti, seguito da 3 lavaggi con PBS. </li><li> Cellule fissate e colorate sono stati ripresi utilizzando Olympus IX81 microscopio invertito e Metamorph software di imaging. </li></ol> 7. Risultati rappresentativi L&#39;aggiunta di Activin A e Wortmannin di hESC indifferenziato per 4 giorni induce endoderma definitiva come confermato da qRT-PCR per marcatori DE Sox17, i CXCR4, e Foxa2 e immunocolorazione per Sox17 come illustrato in figura 2. La differenziazione di cellule progenitrici pancreatiche dopo aggiunta di acido retinoico cyclopamine ed è stato confermato dal qRT-PCR di marcatori progenitrici pancreatiche e l&#39;immunocolorazione per Pdx1 come illustrato in figura 3. Nella fase finale di differenziazione, contattare co-coltura con cellule RHMVEC fortemente indotta sovraregolazione di espressione insulina nelle cellule pancreatiche derivate hESC progenitrici. L&#39;efficienza di co-coltura differenziazione mediata è stata analizzata mediante comparing con la condizione di controllo utilizzando DAPT. DAPT è stato usato come controllo positivo in quanto è attualmente uno dei metodi più utilizzati per ottenere la maturazione pancreatica. Poiché la co-coltura è stata eseguita in un mezzo modificati completata da fattori di supporto di cellule endoteliali, il controllo aggiuntivo è stato effettuato con i media in assenza di cellule endoteliali per verificare l&#39;effetto dei media sulla differenziazione. I dettagli di questa analisi sono presentati in Figura 4. <img alt="Figura 1." src="/files/ftp_upload/3759/3759fig1.jpg" /> Figura 1. Multi-stage protocollo per la differenziazione delle hESC insulina in cellule che esprimono. <img alt="Figura 2." src="/files/ftp_upload/3759/3759fig2.jpg" /> Figura 2. Induzione endoderma definitivo delle cellule staminali embrionali umane. A) qRT-PCR di marcatori rappresentativi DE hESC in cellule esposte a Activin A e Wortmannin per 4 giorni. Risultati ar<html> e normalizzati rispetto al hESC indifferenziata. B) Sox17 colorazione (verde) e DAPI (blu) mostrano l&#39;espressione nucleare di Sox17. Scale bar: 50 micron. <img alt="Figura 3." src="/files/ftp_upload/3759/3759fig3.jpg" /> Figura 3. Progenitore induzione pancreatica delle cellule staminali embrionali derivate cellule endoderma. A) qRT-PCR di marcatori precoci in cellule pancreatiche endoderma hESC derivate esposti all&#39;acido retinoico cyclopamine e per 4 giorni dopo l&#39;induzione DE. Risultati normalizzati rispetto al hESC indifferenziata. B) Pdx1 colorazione (viola) e DAPI (blu) mostrano l&#39;espressione nucleare di Pdx1. Scale bar: 50 micron. &quot;&gt; <img alt="Figura 4." src="/files/ftp_upload/3759/3759fig4.jpg" /> Figura 4. Fase di maturazione pancreatica A) qRT-PCR degli ormoni pancreatici in hESC dopo la maturazione del pancreas con DAPT, contattare il co-coltura o di co-cultura dei media (controllo). Risultati normalizzati rispetto al hESC indifferenziata. valori di p ottenuti dallo studente t-test. B) Co-coltura con Dil-Ac-LDL marcato RHMVEC (Red) mostrano regioni in cui EC fissano alla piastra se ci sono spazi vuoti (in alto), RHMVEC altri si possono trovare a diretto contatto con la differenziazione ESC (in basso). C) C-peptide (verde) colorazione di cellule differenziate con co-coltura metodo. Scale bar: 12,5 micron (Top) e 50 micron (basso) D) immunocolorazione RHMVEC dimostra nessuna espressione insulina nel RHMVEC. <table border="1"><tbody><tr><td> Marcatore </td><td> Primer1 (5 &#39;a 3&#39;) &lt;/ Td&gt; <td> Primer2 (5 &#39;a 3&#39;) </td><td> Ref </td></tr><tr><td> SOX17 </td><td> CTCTGCCTCCTCCACGAA </td><td> CAGAATCCAGACCTGCACAA </td><td> 12 </td></tr><tr><td> CXCR4 </td><td> CACCGCATCTGGAGAACCA </td><td> GCCCATTTCCTCGGTGTAGTT </td><td> 4 </td></tr><tr><td> FOXA2 </td><td> GGAGCGGTGAAGATGGAA </td><td> TACGTGTTCATGCCGTTCAT </td><td> 12 </td></tr><tr><td> Pdx1 </td><td> AAGTCTACCAAAGCTCACGCG </td><td> GTAGGCGCCGCCTGC </td><td> 4 </td></tr><tr><td> PTF1 </td><td> CATAGAGAACGAAACCACCCTTTGAG </td><td> GCACGGAGTTTCCTGGACAGAGTTC </td><td> 12 </td></tr><tr><td> HLXB9 </td><td> CACCGCGGGCATGATC </td><td> ACTTCCCCAGGAGGTTCGA </td><td> 4 </td></tr><tr><td> HNF6 </td><td> TGTGGAAGTGGCTGCAGGA </td><td> TGTGAAGACCAACCTGGGCT </td><td> 5 </td></tr><tr><td> PAX6 </td><td> CGAATTCTGCAGGTGTCCAA </td><td> ACAGACCCCCTCGGACAGTAAT </td><td> 5 </td></tr><tr><td> NKX6.1 </td><td> AGACCCACTTTTTCCGGACA </td><td> CCAACGAATAGGCCAAACGA </td><td> 5 </td></tr><tr><td> ISL1 </td><td> GATCTATGTCACCTCGCAAGG </td><td> TACAACCACCATTTCACTG </td><td> 12 </td></tr><tr><td> Glucagone </td><td> AGGCAGACCCACTCAGTGA </td><td> AACAATGGCGACCTCTTCTG </td><td> 4 </td></tr><tr><td> INSULINA </td><td> AAGAGGCCATCAAGCAGATCA </td><td> CAGGAGGCGCATCCACA </td><td> 12 </td></tr></tbody></table> Primer Tabella 1. Utilizzato per le reazioni qPCR.

<ol><li>De Vos, J., Assou, S., Tondeur, S., Dijon, M., Hamamah, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Les+cellules+souches+embryonnaires+humaines+%3A+de+la+transgression+de+l%27embryon+humain+%C3%A1+la+m%C3%A9decine+r%C3%A9g%C3%A9n%C3%A9ratrice+de+demain%5BTitle%5D)+AND+%22Gyn%C3%A9cologie+Obst%C3%A9trique+%26+Fertilit%C3%A9%22%5BJournal%5D)">Les cellules souches embryonnaires humaines : de la transgression de l'embryon humain á la médecine régénératrice de demain.</a> Gynécologie Obstétrique & Fertilité. 37, 620-626 (2009).</li>
<li>Murtaugh, L. C., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes%2C+Signals%2C+and+Lineages+in+Pancreas+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Genes, Signals, and Lineages in Pancreas Development.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 19, 71-89 (2003).</li>
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<li>D'Amour, K. A., Bang, A. G., Eliazer, S., Kelly, O. G., Agulnick, A. D., Smart, N. G., Moorman, M. A., Kroon, E., Carpenter, M. K., Baetge, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+pancreatic+hormone-expressing+endocrine+cells+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotech%22%5BJournal%5D)">Production of pancreatic hormone-expressing endocrine cells from human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotech. 24, 1392-1401 (2006).</li>
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<li>Docherty, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+development+of+the+islets+of+Langerhans%3A+implications+for+the+treatment+of+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Growth and development of the islets of Langerhans: implications for the treatment of diabetes mellitus.</a> Current Opinion in Pharmacology. 1, 641-649 (2001).</li>
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<li>Osafune, K., Caron, L., Borowiak, M., Martinez, R. J., Fitz-Gerald, C. S., Sato, Y., Cowan, C. A., Chien, K. R., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marked+differences+in+differentiation+propensity+among+human+embryonic+stem+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotech%22%5BJournal%5D)">Marked differences in differentiation propensity among human embryonic stem cell lines.</a> Nat. Biotech. 26, 313-315 (2008).</li>
<li>Banerjee, I., Sharma, N., Yarmush, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+co-culture+on+pancreatic+differentiation+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Tissue+Eng.+Regen.+Med%22%5BJournal%5D)">Impact of co-culture on pancreatic differentiation of embryonic stem cells.</a> J. Tissue Eng. Regen. Med. 5, 313-323 (2010).</li>
</ol>

Non abbiamo nulla da rivelare.

Durante lo sviluppo del pancreas, le cellule pancreatiche di differenziazione sono in stretta vicinanza con le cellule endoteliali della aorta, inoltre, isole pancreatiche sono densamente vascolarizzati per promuovere lo scambio rapido di glucosio nel sangue e ormoni insulari. Dati questi fatti, non è sorprendente che le cellule endoteliali svolgono un ruolo importante nel processo di organogenesi pancreatica. Mentre l&#39;importanza di cellule endoteliali durante lo sviluppo del pancreas è sempre più apprezzato, il suo...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Concentrazioni </td></tr><tr><td> mTeSR1 (con supplemento) </td><td> Tecnologie di cellule staminali </td><td> 5850 </td><td></td></tr><tr><td> hESC qualificato matrigel </td><td> BD Biosciences </td><td> 354277 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM: F12 </td><td> Invitrogen </td><td> 11330-032 </td><td></td></tr><tr><td> MCDB-131 </td><td> Invitrogen </td><td> 10372019 </td><td></td></tr><tr><td> MCDB-131 (Complete) </td><td> VEC Technologies </td><td> MCDB-131 </td><td></td></tr><tr><td> B27 Supplemento </td><td> Invitrogen </td><td> 17504044 </td><td></td></tr><tr><td> A Activin </td><td> R &amp; D </td><td> <a href="http://www.rndsystems.com/pdf/338-ac.pdf">338-AC</a> </td><td> 100ng/ml </td></tr><tr><td> Wortmannin </td><td> Invitrogen </td><td> W3144 </td><td> 1 pm </td></tr><tr><td> KAAD-Cyclopamie </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C4116 </td><td> 0.2μM </td></tr><tr><td> Acido all-trans retinoico </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> R2625 </td><td> 2μM </td></tr><tr><td> DAPT </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D5942 </td><td> 30 um </td></tr><tr><td> Nicotinamide </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> N0636 </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> Sodio Selenite </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S5261 </td><td> 30 nM </td></tr><tr><td> Insulina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I1882 </td><td> 25 pg / ml </td></tr><tr><td> Transferrina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T8158 </td><td> 50 ug / ml </td></tr><tr><td> EGF </td><td> R &amp; D </td><td> <a href="http://www.rndsystems.com/pdf/236-eg.pdf">236-EG</a> </td><td> 10ng/ml </td></tr><tr><td> EndoGro </td><td> VEC Technologies </td><td> ENDOGRO </td><td> 10mg </td></tr><tr><td> Eparina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H3149 </td><td> 90μg/ml </td></tr><tr><td> Idrocortisone </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H0888 </td><td> 1μg/ml </td></tr><tr><td> NucleoSpin RNA II </td><td> Macherey Nagel </td><td> 740955 </td><td></td></tr><tr><td> ImProm II sistema di trascrizione inversa </td><td> Promega </td><td> A3800 </td><td></td></tr><tr><td> II Brilliant SYBR Green QPCR master mix </td><td> Straragene </td><td> 600548 </td><td></td></tr><tr><td> Sox17 policlonale di capra IgG </td><td> Santa Cruz </td><td> sc-17355 </td><td> 1/500 </td></tr><tr><td> Pdx1 policlonale di capra IgG </td><td> Santa Cruz </td><td> sc-14662 </td><td> 1/500 </td></tr><tr><td> C-Peptide policlonale di coniglio </td><td> Segnalazione cellulare </td><td> 4593 </td><td> 1/500 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 asino anti-IgG di coniglio </td><td> Invitrogen </td><td> A-21.206 </td><td> 1/1000 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 647 asino anti-IgG di capra </td><td> Invitrogen </td><td> A-21.447 </td><td> 1/1000 </td></tr></tbody></table> Tabella 2. Reagenti e kit.

delle cellule endoteliali co-cultura maturazione media di cellule staminali embrionali umane a cellule pancreas che producono insulina in un approccio di differenziazione regia

Endothelial Cell Co-culture Mediates Maturation of Human Embryonic Stem Cell to Pancreatic Insulin Producing Cells in a Directed Differentiation Approach

Le cellule staminali embrionali (ESC) hanno due caratteristiche principali: possono essere a tempo indeterminato propagate in vitro in uno stato indifferenziato e sono pluripotenti, avendo così la potenzialità di differenziarsi in diversi lignaggi. Tali proprietà rendono CES estremamente attraente per la terapia cellulare a base e le applicazioni di trattamento di rigenerazione 1. Tuttavia, per il suo pieno potenziale da realizzare le cellule devono essere differenziate in fenotipi maturi e funzionale, che è un compito scoraggiante. Un approccio promettente per indurre la differenziazione cellulare è imitare al cammino dell&#39;organogenesi nell&#39;impostazione in vitro. Sviluppo del pancreas si verifica in 2 fasi specifiche, a cominciare da endoderma, che può svilupparsi in diversi organi, compreso fegato e pancreas. Endoderma induzione può essere ottenuto mediante la modulazione del percorso nodale aggiunta di Activin A 3 in combinazione con diversi fattori di crescita 4-7 </sup&gt;. Cellule endoderma definitive quindi sottoposti impegno pancreatica mediante inibizione di inibizione hedgehog sonic, che può essere ottenuto in vitro mediante l&#39;aggiunta di cyclopamine 8. La maturazione del pancreas è mediata da numerosi eventi collaterali tra cui l&#39;inibizione del segnale di Notch, l&#39;aggregazione di cellule progenitrici del pancreas in 3-dimensionali cluster; induzione di vascolarizzazione, solo per citarne alcuni. Di gran lunga il maggior successo nella maturazione in vitro delle cellule pancreatiche progenitrici derivate CES sono stati raggiunti attraverso l&#39;inibizione del segnale di Notch dal completamento DAPT 9. Malgrado il successo, questo si traduce in bassa resa del fenotipo maturo con funzionalità ridotte. Una zona meno studiato è l&#39;effetto di segnalazione delle cellule endoteliali nella maturazione del pancreas, che è sempre più apprezzato come un fattore importante che contribuisce in in-vivo maturazione di isole pancreatiche 10,11. Il presente studio esamina tale effetto di endothelIAL di segnalazione delle cellule nella maturazione di cellule pancreatiche progenitrici derivate dal Comitato in isole pancreatiche produttrici di insulina come le cellule. Riportiamo un multi-stadio protocollo di differenziazione diretta dove i CES umani vengono prima indotti verso endoderma da Activin A insieme con l&#39;inibizione della via PI3K. Specifica delle cellule del pancreas endoderma si ottiene l&#39;inibizione di sonic hedgehog segnalazione da Cyclopamine insieme con l&#39;induzione dei retinoidi mediante aggiunta di acido retinoico. La fase finale di maturazione viene indotta da segnalazione cellulare endoteliale raggiunti da una co-coltura configurazione. Mentre diverse cellule endoteliali sono stati testati in co-coltura, qui vi presentiamo i nostri dati con le cellule del cuore di ratto endoteliali microvascolari (RHMVEC), principalmente per la facilità di analisi.

Il presente studio descrive un approccio diretto differenziazione nell&#39;indurre la differenziazione pancreatica di cellule staminali embrionali umane. Di grande importanza è la scoperta che cellule endoteliali co-coltura maturazione media di cellule staminali umane embrionali derivano in cellule progenitrici del pancreas di insulina che esprimono.

Delle cellule endoteliali Co-cultura Maturazione media di Cellule Staminali embrionali umane a cellule pancreas che producono insulina in un approccio di differenziazione Regia

Le cellule staminali embrionali (ESC) possiedono due caratteristiche principali: possono essere propagate indefinitamente in vitro in uno stato indifferenziato e sono...

Questo protocollo descrive una differenziazione multistadio delle cellule staminali embrionali umane come approccio efficace per ottenere cellule produttrici di insulina con un rendimento migliore rispetto ai protocolli precedentemente sviluppati: innanzitutto si induce l'endoderma definitivo mediante l'attivazione della via Wnt e un inibitore della PI3K. Successivamente, per favorire l'induzione dei progenitori pancreatici, si espongono le cellule all'acido retinoico e alla cyclopamine. Infine, si effettua una co-coltura con cellule endoteliali per favorire la maturazione dei progenitori pancreatici in cellule esprimenti insulina.Procedere ad analisi funzionali mediante microscopia a immunofluorescenza e QPCR per dimostrare l'espressione del peptide C e l'upregolazione dell'insulina. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come il metodo not, è che questo metodo determina una maggiore upregolazione dell'insulina nonché un rendimento più elevato di cellule esprimenti cpep. Coltivare colonie di cellule staminali embrionali umane fino a raggiungere una dimensione compresa tra uno e 1,5 millimetri di diametro, fino a quando le cellule non raggiungono il CO 12.Piastra a pozzetti con un millilitro per pozzetto di matrigel per HESC diluito in mezzo D-M-E-M-F 12; nel frattempo, aspirare il mezzo dagli HSC e sostituire gli mts con uno fresco. Quindi raccogliere le cellule mediante raschiatura. Aggiungerle in un tubo conico da 15 millilitri e aggiungere MTR fresco; quindi seminare in un rapporto di suddivisione di uno a quattro nei pozzetti precedentemente rivestiti con matrigel di una piastra a 12 pozzetti.Una volta che le cellule in proliferazione raggiungono un diametro compreso tra uno e 1,5 millimetri, la differenziazione viene avviata aggiungendo un mezzo di induzione dell'endoderma definitivo contenente in a attivo e l'inibitore della PI tre K. Colture Wart manin per quattro giorni.Ricambiare il mezzo ogni giorno. Procedere all'induzione dei progenitori pancreatici, coltivando prima in D-M-E-M-F 12 completo contenente 0,2 micromolare di KAAD, cycl dopamina per 24 ore. Successivamente, sostituire il mezzo con D-M-E-M-F 12 completo contenente 0,2 micromolare di KAAD cycl dopamina e 2 micromolari di acido retinoico trans, incubare per tre giorni ricambiando il mezzo ogni giorno.Coltivare le cellule in mezzo di maturazione per due giorni prima di eseguire l'ultimo passaggio di maturazione come controllo positivo per la maturazione in vivo di cellule progenitrici pancreatiche derivate da ESC in presenza dell'inibitore della via Notch DAPT prima della suddivisione. Esaminare le cellule endoteliali al microscopio, quindi tripsinizzare e contare le cellule per la condizione di co-coltura a contatto. Aggiungere 1 milione di cellule endoteliali microvascolari cardiache di ratto alle cellule in differenziamento in mezzo MCDB 131 completo.Preparare anche una coltura di controllo con solo il mezzo di co-coltura e le nostre cellule endoteliali. Posizionare tutte le condizioni sperimentali in un incubatore per sei giorni con cambio del mezzo. Raccogliere quotidianamente cellule campione alla fine di ogni stadio del processo di differenziamento.Estrazione di RNA da cellule endocrine, progenitori pancreatici ed estratti di eyelet maturi utilizzando il kit di estrazione nucleus spin E-R-R-N-A secondo le istruzioni del produttore. Con un spettrofotometro smart spec plus e una cuvetta in quarzo, determinare la qualità dell'RNA mediante il rapporto di assorbanza a 260 nanometri rispetto a 280 nanometri. Inoltre, calcolare le concentrazioni dei campioni con 100 nanogrammi di RNA stampo per campione.Eseguire le reazioni di RT utilizzando il kit di trascrizione inversa improvvisato. Procedere con l'allestimento della QPCR utilizzando i primer indicati, caricare le reazioni sul termociclatore ed eseguire il programma di QPCR. Successivamente, utilizzando i valori di CT, calcolare il fold change dell'espressione dell'mRNA bersaglio rispetto alle cellule indifferenziate al termine di ogni stadio di differenziazione.Fissare le cellule con formaldeide al 4% per 15 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, permeabilizzare con Triton X-100 allo 0,25% per 10 minuti per bloccare la colorazione non specifica. Aggiungere siero di asino al 10% in TX allo 0,05% per 30 minuti.Successivamente, aggiungere l'anticorpo primario nel buffer di blocco e incubare tutta la notte a quattro gradi Celsius. Lavare i campioni con Triton X 0,05% per cinque minuti. Quindi aggiungere l'anticorpo secondario diluito nel buffer di blocco e incubare per un'ora a temperatura ambiente al buio.Eseguire tre lavaggi di cinque minuti ciascuno con una soluzione al 0,05% x per mantenere i nuclei alla colorazione con tinta di cavallo in un rapporto di diluizione da 1 a 1000 in PBS. Incubare per cinque minuti, seguito da tre lavaggi con PBS. Acquisire immagini delle cellule fissate e colorate utilizzando un microscopio invertito e un software di acquisizione immagini.L'aggiunta di attivina A e Wnt3a a cellule staminali embrionali umane indifferenziate per quattro giorni induce l'endoderma definitivo. L'analisi Q-R-T-P-C-R ha confermato la presenza dei marcatori attesi per l'endoderma definitivo: SOX17, CXCR4 e FoxA2.La colorazione immunoistochimica per SOX17 in verde mostra la colocalizzazione con il nucleo colorato in blu con DPI. La differenziazione in cellule progenitrici pancreatiche, dopo l'aggiunta di cyclo, ammina e acido rettinoico, è stata confermata mediante Q-R-T-P-C-R dei marcatori dei progenitori pancreatici e anche mediante colorazione immunoistochimica per PDX1. Nella fase finale della differenziazione, la coltura in contatto co-coltura con cellule endoteliali microvascolari del cuore di ratto ha fortemente indotto l'upregolazione dell'espressione di insulina nelle cellule progenitrici pancreatiche derivate da HESC.Le colture co con RHM VEC marcati con AC-LDL mostrano regioni in cui le ECS sono attaccate alla piastra. Se sono presenti spazi vuoti, altri RHM VEC possono trovarsi a contatto diretto con le ESC in differenziamento, come previsto. La colorazione immunoistochimica dei RHM VEC non rivela espressione di insulina.La colorazione con eptide è anche un marcatore utile per le cellule differenziate mediante il metodo di co-coltura dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha permesso l'indagine sulle interazioni tra cellule nel processo di differenziazione delle cellule staminali, che evidentemente aumenta la funzionalità del fenotipo maturo.

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