Name: Isolamento di cellule epiteliali mammarie da tridimensionale Mixed-cell Spheroid Co-cultura (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-30T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: Impara a isolare cellule epiteliali mammarie da co-culture tridimensionali con fibroblasti stromali. Questo metodo permette di analizzare gli effetti del microambiente tumorale sulla biologia cellulare in vitro.

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1. Stabilire colture tridimensionali in co-coltura
<ol>
	<li>Il giorno prima dell'allestimento delle colture in co-coltura, rimuovere il Matrigel dal congelatore e farlo scongelare su ghiaccio in un frigorifero a 4 °C durante la notte.</li>
	<li>Il giorno dell'esperimento, preparare il mezzo per la co-coltura, corrispondente al mezzo utilizzato per le cellule epiteliali (in questo caso mezzo HMEC: mezzo DME/F12 con 10% di siero di vitello bovino, 5 μg/mL di insulina, 1 μg/mL di idrocortisone e 1 ng/mL di EGF). Mantenere il mezzo sul ghiaccio per almeno 1 ora prima di mescolarlo con il Matrigel.</li>
	<li>Per diluire il Matrigel scongelato, determinare la quantità totale desiderata di Matrigel:mezzo (300 μL per pozzetto per piastre a 24 pozzetti) e aggiungere metà di tale volume di mezzo HMEC freddo a una provetta sterile posta su ghiaccio. Successivamente, aggiungere alla provetta lo stesso volume (metà del totale) di Matrigel scongelato per ottenere una diluizione 1:1. Mantenere la provetta sul ghiaccio.</li>
	<li>Deporre 50 μL della miscela Matrigel:mezzo al centro dei pozzetti designati di una piastra a 24 pozzetti e incubare per 10 minuti in un incubatore a 37 °C con aria umidificata e 5% di CO2.</li>
	<li>Aggiungere ulteriori 450 μL della miscela Matrigel:mezzo nei pozzetti e incubare per altri 60 minuti.</li>
	<li>Durante l'incubazione, preparare una sospensione 1:1 di fibroblasti (in questo caso fibroblasti mammarî riduttivi immortalizzati con h-TERT ed esprimenti GFP) e cellule epiteliali (in questo caso linea cellulare epiteliale mammaria umana immortalizzata con h-TERT ed esprimente RFP) a una concentrazione di 0,5 x 105 cellule ciascuna in 0,5 ml di mezzo HMEC.</li>
	<li>Al termine del passaggio di incubazione di 60 minuti, depositare delicatamente la sospensione cellulare sulla superficie del gel solidificato e reinserire la coltura nell'incubatore.</li>
	<li>Non disturbare le colture per 2 giorni. Successivamente, il mezzo può essere sostituito ogni 2-3 giorni aspirando delicatamente il mezzo dal bordo del pozzetto e sostituendolo con mezzo HMEC fresco in modo altrettanto delicato.</li>
	<li>Monitorare quotidianamente la formazione degli sferoidi mediante microscopia. Le colture sono generalmente mature dopo 10-14 giorni. Eseguire l'acquisizione delle immagini con microscopia a luce visibile o a fluorescenza, secondo necessità. La dimensione degli sferoidi e la lunghezza delle protrusioni possono essere misurate mediante microscopia a luce visibile.</li>
</ol>
2. Isolamento di cellule da colture in co-coltura sferoidali
<ol>
	<li>Pipettare molto delicatamente la coltura su e giù per 10 volte utilizzando una pipetta di vetro sterile da 2 mL. In alternativa, tagliare la punta di una pipetta di plastica da 1000 microlitri con delle forbici sterili, ottenute mediante autoclave o immersione in etanolo al 70%, per pipettare la coltura. Trasferire la coltura, utilizzando la pipetta di vetro o la punta di plastica tagliata, in un tubo da centrifuga sterile da 15 ml e centrifugare per 5 minuti a 2000 rpm a temperatura ambiente. Gli sferoidi cellulari si depositeranno sul fondo.</li>
	<li>Utilizzare una punta di pipetta Pasteur sterile per rimuovere delicatamente il Matrigel disgregato dalla parte superiore del tubo centrifugato.</li>
	<li>Aggiungere 1 ml di mezzo HMEC agli sferoidi pellettizzati, pipettare su e giù 2-3 volte con una pipetta di vetro sterile da 2 mL e trasferire la coltura in una pozzetta di una piastra per colture cellulari a 24 pozzette.</li>
	<li>Lasciare che gli sferoidi si attacchino alla piastra per almeno 48 ore prima di cambiare il mezzo. Col tempo, le cellule abbandoneranno le strutture sferoidali e cresceranno come monocapato.</li>
	<li>Passare le colture cellulari quando le cellule raggiungono una confluenza del 50%. Espandere prima la coltura in una piastra da 35 mm (circa 2-4 giorni) e successivamente in una piastra da 100 mm (circa 3-5 giorni). Immediatamente prima di ogni passaggio, utilizzare una pipetta Pasteur sterile per rimuovere manualmente il maggior numero possibile di "sferoidi fantasma" residui.</li>
	<li>Analizzare le cellule mediante citometria a flusso per determinare la purezza della popolazione, utilizzando marcatori di superficie cellulari appropriati, e separare ulteriormente diverse popolazioni cellulari mediante sorting cellulare a fluorescenza, se necessario. Le cellule isolate sono ora pronte per ulteriori analisi, secondo necessità.</li>
</ol>
3. Risultati rappresentativi
Nei co-coltivi tridimensionali a sferoide, i fibroblasti con silenziamento ingegnerizzato di Tiam1 inducono un aumento dell'invasione nella matrice da parte delle cellule epiteliali mammarie (Figura 1, confronta D, E, F con A, B, C). I fibroblasti con sovraespressione ingegnerizzata di Tiam1 inducono una riduzione dell'invasione nella matrice da parte della linea cellulare di carcinoma mammario SUM159 (Figura 1, confronta J, K, L con G, H, I).
Una volta stabiliti gli sferoidi in co-coltura, le popolazioni cellulari possono essere isolate dagli sferoidi mediante reimpianto in un contesto bidimensionale, come mostrato in Figura 2. A seconda dei tassi di crescita relativi delle cellule testate, popolazioni pure possono emergere attraverso passaggi seriali (come mostrato in Figura 3) oppure possono essere separate utilizzando marcatori cellulari appropriati. Dopo l'isolamento dalla co-coltura tridimensionale, le cellule epiteliali mantengono le proprietà conferite dalla co-coltura con fibroblasti per periodi prolungati, consentendo ampie opportunità di analisi. In questo esempio, l'esposizione a fibroblasti privi di Tiam1 ha indotto un aumento della migrazione nelle HMEC in co-coltura, che è persistito per settimane dopo l'isolamento dalla co-coltura 3D (Figura 4).
<img alt="Confronto della morfologia cellulare; campo chiaro, fluorescenza GFP, fluorescenza Cherry; tecnica di imaging microscopico." src="/files/ftp_upload/3760/3760fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
Figura 1. Imaging di colture sferoidali co-istituite mediante microscopia ottica e a fluorescenza. Le colture sferoidali sono state stabilite utilizzando linee cellulari di epitelio mammario e fibroblasti e lasciate crescere in coltura per 10-14 giorni. A-F: epitelio = cellule HMEC-mCherry. G-L: cellule epiteliali = cellule SUM159-mCherry. A-C, G-I: fibroblasti = cellule RMF-GFP di controllo. D-F: fibroblasti = RMF-GFP con silenziamento di Tiam1. J-L: fibroblasti = RMF-GFP con sovraespressione di Tiam1. Le frecce indicano proiezioni epiteliali che invadono la matrice.
<img alt="Progressione della coltura cellulare; microscopia in campo chiaro, GFP, fluorescenza Cherry; analisi della crescita." src="/files/ftp_upload/3760/3760fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 2"> 
Figura 2. Acquisizione sequenziale di immagini di colture mediante microscopia ottica e a fluorescenza dopo l'isolamento dalla coltura in Matrigel. Il giorno 0 rappresenta l'acquisizione immediatamente dopo l'isolamento; i giorni 1, 2 e 5 indicano i giorni successivi all'isolamento. La corona di cellule che abbandonano lo sferoide aumenta nel tempo. Alla fine rimane uno sferoide "fantasma" con pochissime cellule (freccia). Pochissimi sferoidi rimangono dopo la rimozione dei fantasma e il primo passaggio.
<img alt="Diagramma di citometria a flusso che mostra l'espressione di mCherry/GFP nel corso dei giorni; analisi dei dati delle popolazioni cellulari." src="/files/ftp_upload/3760/3760fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 3"> 
Figura 3. Analisi mediante citometria a flusso delle cellule dopo l'isolamento dalla coltura co-coltivata in Matrigel. Dopo che le colture co-coltivate in sferoidi hanno raggiunto la maturazione, le cellule vengono isolate dalla coltura tridimensionale mediante pipettaggio e passaggi seriali. Aliquote campione vengono analizzate mediante citometria a flusso (in questo esempio utilizzando fluorescenza verde e fluorescenza rossa per identificare rispettivamente i fibroblasti esprimenti GFP e le cellule epiteliali esprimenti mCherry) al fine di determinare le popolazioni relative di cellule epiteliali e fibroblasti.
<img alt="Grafico a barre; confronto della migrazione cellulare nel tempo; gruppi controllo vs shT; dati sperimentali." src="/files/ftp_upload/3760/3760fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 4"> 
Figura 4. La migrazione Transwell dei CEMH persiste dopo l'isolamento dalla co-coltura con Matrigel. Una volta ottenute popolazioni pure mediante coltura o sorting cellulare mediante fluorescenza, le cellule possono essere analizzate secondo le esigenze. In questo caso, la migrazione dei CEMH co-coltivati con fibroblasti di controllo (C) o privi di Tiam1 (shT) attraverso inserti Transwell perforati è stata valutata a 2, 4 e 8 settimane dall'isolamento dalla co-coltura.

<ol><li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hallmarks+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The hallmarks of cancer.</a> Cell. 100, 57-70 (2000).</li>
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<li>Djordjevic, B., Lange, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-cell+interactions+in+spheroids+maintained+in+suspension%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Oncol%22%5BJournal%5D)">Cell-cell interactions in spheroids maintained in suspension.</a> Acta Oncol. 45, 412-420 (2006).</li>
<li>Hirschhaeuser, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicellular+tumor+spheroids%3A+an+underestimated+tool+is+catching+up+again%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again.</a> J. Biotechnol. 148, 3-15 (2010).</li>
<li>Hoevel, T., Macek, R., Swisshelm, K., Kubbies, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reexpression+of+the+TJ+protein+CLDN1+induces+apoptosis+in+breast+tumor+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Reexpression of the TJ protein CLDN1 induces apoptosis in breast tumor spheroids.</a> Int. J. Cancer. 108, 374-383 (2004).</li>
<li>Paduch, R., Kandefer-Szerszen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitamin+D%2C+tamoxifen+and+beta-estradiol+modulate+breast+cancer+cell+growth+and+interleukin-6+and+metalloproteinase-2+production+in+three-dimensional+co-cultures+of+tumor+cell+spheroids+with+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Biol.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Vitamin D, tamoxifen and beta-estradiol modulate breast cancer cell growth and interleukin-6 and metalloproteinase-2 production in three-dimensional co-cultures of tumor cell spheroids with endothelium.</a> Cell. Biol. Toxicol. 21, 247-256 (2005).</li>
<li>Timmins, N. E., Nielsen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+multicellular+tumor+spheroids+by+the+hanging-drop+method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Generation of multicellular tumor spheroids by the hanging-drop method.</a> Methods Mol. Med. 140, 141-151 (2007).</li>
<li>Foty, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Hanging+Drop+Cell+Culture+Protocol+for+Generation+of+3D+Spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids.</a> J. Vis. Exp. (51), e2720-e2720 (2011).</li>
<li>Xu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+fibroblast+Tiam1+in+tumor+cell+invasion+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">The role of fibroblast Tiam1 in tumor cell invasion and metastasis.</a> Oncogene. 29, 6533-6542 (2010).</li>
</ol>

Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

Il metodo qui presentato rappresenta un approccio semplice per analizzare gli effetti di fibroblasti stromali sulle cellule epiteliali, comprese le cellule tumorali. Esso consente diretto cellula-cellula interazione all&#39;interno di un contesto tridimensionale supportato da matrice extracellulare membrana basale, pur consentendo una facile estrazione delle celle della matrice per ulteriori analisi. Questo può essere applicato allo studio del tumore-associato stroma, come linee di fibroblasti possono essere manipolati ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome di reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Comments </td></tr><tr><td> BD Matrigel </td><td> BD Biosciences </td><td> 356237 </td><td> Fenolo-rosso senza </td></tr><tr><td> Hyclone Media Classical liquido: DMEM F12 </td><td> ThermoScientific </td><td> SH30023.01 </td><td></td></tr><tr><td> Hyclone Bovine Calf Serum </td><td> ThermoScientific </td><td> SH3007303 </td><td></td></tr><tr><td> Insulina </td><td> EMD Chemicals </td><td> 407709 </td><td> Sciogliere in 0.005N HCl; 0,22 uM filtro </td></tr><tr><td> Idrocortisone </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H4001 </td><td> Sciogliere in 50% EtOH; 0,22 uM filtro </td></tr><tr><td> EGF </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E9644 </td><td> Sciogliere in 10mM acido acetico; 0,22 uM filtro </td></tr></tbody></table>

isolamento di cellule epiteliali mammarie da tridimensionale mixed-cell spheroid co-cultura

Isolation of Mammary Epithelial Cells from Three-dimensional Mixed-cell Spheroid Co-culture

Mentre enormi sforzi sono andati ad identificare vie di segnalazione e le molecole coinvolte in comportamenti di cellule normali e maligne 1-2, gran parte di questo lavoro è stato effettuato utilizzando classici bidimensionali modelli di coltura cellulare, che consentono la manipolazione cellulare facile. E &#39;diventato chiaro che vie di segnalazione che sono influenzati da forze extracellulari, tra cui dimensionalità e tensione superficiale delle cellule 3-4. Molteplici approcci sono state prese per sviluppare modelli tridimensionali che rappresentano il tessuto più accuratamente l&#39;architettura biologica 3. Mentre questi modelli incorporano multidimensionalità e sollecitazioni architettoniche, lo studio degli effetti conseguenti sulle cellule è meno facile rispetto a bidimensionale coltura tissutale a causa dei limiti dei modelli e la difficoltà di estrazione di cellule per la successiva analisi. L&#39;importante ruolo del microambiente intorno tumori nella tumorigenesi e il comportamento del tumore is sempre più riconosciuta 4. Stroma tumorale è composta da più tipi di cellule e molecole extracellulari. Durante lo sviluppo del tumore sono segnali bidirezionali tra cellule tumorali e cellule stromali 5. Sebbene alcuni fattori che partecipano stroma del tumore-co-evoluzione sono stati identificati, vi è ancora la necessità di sviluppare tecniche semplici per identificare sistematicamente e studiare la gamma completa di questi segnali 6. I fibroblasti sono il tipo cellulare più abbondante nei tessuti normali stromali o tumore-associato, e contribuire alla deposizione e alla manutenzione della membrana basale e fattori di crescita paracrini 7. Molti gruppi hanno utilizzato tre sistemi di coltura tridimensionale per studiare il ruolo dei fibroblasti su varie funzioni cellulari, compresa la risposta del tumore alle terapie, il reclutamento delle cellule immunitarie, le molecole di segnalazione, la proliferazione, l&#39;apoptosi, l&#39;angiogenesi e l&#39;invasione 8-15. Abbiamo ottimizzato un metodo semplice per assessing gli effetti di fibroblasti mammarie su cellule epiteliali mammarie utilizzando un modello disponibile in commercio matrice extracellulare per creare tridimensionali colture miste di popolazioni cellulari (co-colture) 16-22. Con continua co-coltura delle cellule formano sferoidi con il raggruppamento fibroblasti all&#39;interno e le cellule epiteliali ampiamente sulla parte esterna degli sferoidi e formando multicellulari sporgenze nella matrice. Manipolazione dei fibroblasti che porta alla alterato l&#39;invasività delle cellule epiteliali possono essere facilmente quantificato dai cambiamenti del numero e la lunghezza delle proiezioni epiteliali 23. Inoltre, abbiamo sviluppato un metodo per isolare le cellule epiteliali di tridimensionale co-cultura che facilita l&#39;analisi degli effetti dell&#39;esposizione fibroblasti sul comportamento epiteliale. Abbiamo trovato che gli effetti della co-coltura persistere per settimane dopo l&#39;isolamento delle cellule epiteliali, consentendo tempo sufficiente per effettuare saggi multipli. Questo metodo è adattabile a cellulevariabile potenziale maligno e non richiede attrezzature specializzate. Questa tecnica permette di valutazione rapida dei modelli in vitro di cellule in condizioni diverse, ed i corrispondenti risultati possono essere confrontati con tessuto in modelli animali in vivo così come campioni di tessuti umani.

Un semplice metodo è descritto per analizzare gli effetti di fibroblasti su tessuti associati cellule epiteliali. La combinazione di questo metodo e tridimensionale coltura tissutale può facilitare l&#39;analisi di cellule dopo l&#39;isolamento da 3D. La tecnica è applicabile a celle di varia potenziale maligno, consentendo studio sistematico di effetti di tumore-associato stroma sulle cellule tumorali.

Isolamento di cellule epiteliali mammarie da tridimensionale Mixed-cell Spheroid Co-cultura

Sebbene siano stati profusi enormi sforzi nell'identificare le vie di segnalazione e le molecole coinvolte nei comportamenti cellulari normali e maligni1-2, gran parte di questo lavoro ...

L'obiettivo generale di questa procedura è ottenere cellule epiteliali da colture tridimensionali di tessuti cellulari misti al fine di analizzare gli effetti dei fibroblasti stromali sulla biologia delle cellule epiteliali. Questo viene ottenuto innanzitutto stabilendo colture co-steroidali tridimensionali di cellule miste. Le sferoidi vengono quindi separate dalla matrice della coltura per isolare le cellule epiteliali post co-coltura.Il passaggio successivo consiste nel sottoculturare le cellule epiteliali post co-coltura fino al momento in cui saranno pronte per l'analisi. In definitiva, gli effetti dell'esposizione a fibroblasti in coltura tridimensionale sul comportamento delle cellule epiteliali possono essere valutati mediante imaging microscopico delle colture e analisi post co-coltura. Le cellule epiteliali, ad esempio l'imaging di fluorescenza dell'invasione della matrice e della migrazione in Transwell mostrato qui, saranno oggetto della dimostrazione da parte di Quin, un associato di ricerca del mio laboratorio, il giorno precedente all'allestimento delle co-colture.Rimuovere il gel matre dal congelatore e scongelarlo su ghiaccio in un refrigeratore a quattro gradi Cel

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Questo manoscritto descrive una tecnica di litografia morbida a base di ingegnerizzare matrici uniformi di tridimensionale (3D) tessuti epiteliali di geometria definita circondati da matrice extracellulare. Questo metodo è suscettibile di una grande varietà di tipi di cellule e contesti sperimentali e consente di high-throughput screening di replicati identici.

Tessuti epiteliali Ingegneria tridimensionali integrati all&#39;interno di matrice extracellulare

Questo protocollo descrive metodi per purificare, quantificare e caratterizzare vescicole extracellulari (EVs) / esosomi da cellule epiteliali mammarie non aderenti / mesenchimali e per usarle per trasferire la capacità di formazione delle ghiandole mammarie alle cellule epiteliali mammarie luminali. EVs / esosomi derivati ​​da cellule epiteliali mammarie simili a stelo possono trasferire questa proprietà cellulare alle cellule che ingeriscono gli EV / esosomi.

Trasferimento di abilità di formazione del ghiandale mammario tra le cellule epiteliali basali del mammifero e le cellule luminescenti mammarie attraverso le vescicole / esosomi extracellulari

Utilizzando le cellule epiteliali primarie umane, riportiamo un nuovo metodo privo di biomarcatori di caratterizzazione funzionale delle cellule staminali da un saggio di ritenzione di etichette basato su sferoidi. Viene descritto un protocollo passo-passo per l'etichettatura delle celle 2D BrdU, CFSE o Far Red; formazione di sferoidi tridimensionali; l'identificazione delle cellule staminali di conservazione dell'etichetta mediante immunocitochimica; e l'isolamento da parte della FACS.

Isolamento di cellule simili a stelo dalle colture speroidi a 3 dimensioni

La ghiandola mammaria è una struttura bistrato, che comprende cellule epiteliali mitraeliliali ed interne interne. Presentato è un protocollo per preparare gli organoidi utilizzando la prova differenziale. Questo metodo efficiente consente ai ricercatori di manipolare separatamente questi due tipi di cellule per esplorare le domande riguardanti i loro ruoli nella forma e nella funzione della ghiandola mammaria.

Generazione di organoidi mammari mosaici per provepsinizzazione differenziale

La diafonia tra cellule epiteliali mammarie e cellule endoteliali contribuisce in modo importante alla progressione del cancro al seno, alla crescita del tumore e alle metastasi. In questo studio, gli sferoidi sono stati realizzati da cellule di cancro al seno insieme a cellule endoteliali vascolari e / o linfatiche e dimostrano la loro applicabilità come sistema in vitro per la ricerca sul cancro al seno.

Sferoidi epiteliali ed endoteliali mammari come potenziale modello funzionale in vitro per la ricerca sul cancro al seno

Il presente studio riporta un protocollo più semplice, rapido ed economico per isolare e far crescere in modo efficiente le cellule epiteliali mammarie umane primarie (HMEC) da piccole quantità di tessuto mammario. Questo protocollo è adatto per la produzione rapida di HMEC primari sia per applicazioni di laboratorio che cliniche.

Isolamento e coltura di cellule epiteliali mammarie umane primarie

C'è un bisogno critico di modelli di cancro 3D che catturino il crosstalk eterocellulare per studiare le metastasi del cancro. Il nostro studio presenta la generazione di epiteliali stromali eteromulticellulari in un ambiente privo di scaffold e scaffold che può essere utilizzato per studiare l'invasione e le distribuzioni spaziali cellulari.

Cellule stromali eteromulticellulari in colture 3D prive di scaffold di cellule tumorali epiteliali per guidare l'invasione

Impara a isolare cellule epiteliali mammarie da co-culture tridimensionali con fibroblasti stromali. Questo metodo permette di analizzare gli effetti del microambiente tumorale sulla biologia cellulare in vitro.

Isolamento di cellule epiteliali mammarie da tridimensionale Mixed-cell Spheroid Co-cultura

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