Isolamento di cellule epiteliali mammarie da tridimensionale Mixed-cell Spheroid Co-cultura

L'obiettivo generale di questa procedura è ottenere cellule epiteliali da colture tridimensionali di tessuti cellulari misti al fine di analizzare gli effetti dei fibroblasti stromali sulla biologia delle cellule epiteliali. Questo viene ottenuto innanzitutto stabilendo colture co-steroidee tridimensionali di cellule miste. Le sferoidi vengono quindi separate dalla matrice della coltura per isolare le cellule epiteliali post co-coltura.

Il passaggio successivo consiste nel sottoculturare le cellule epiteliali post co-coltura fino al momento in cui saranno pronte per l'analisi. In definitiva, gli effetti dell'esposizione a fibroblasti in una coltura tridimensionale sul comportamento delle cellule epiteliali possono essere valutati mediante imaging microscopico delle colture e analisi post co-coltura. Le cellule epiteliali, ad esempio l'imaging di fluorescenza dell'invasione della matrice e la migrazione in Transwell mostrata in questo caso, saranno oggetto della dimostrazione da parte di Quin, un associato di ricerca del mio laboratorio, il giorno precedente all'allestimento delle co-colture.

Rimuovere il gel matrice dal congelatore e scongelarlo in ghiaccio in un refrigeratore a quattro gradi Celsius durante la notte. Nel giorno dell'esperimento, posizionare il mezzo di coltura in ghiaccio almeno un'ora prima di mescolarlo con il gel matrice. Per diluire il gel matrice scongelato.

Aggiungere metà del volume di mezzo H Mac freddo di ghiaccio necessario per la co-coltura in un tubo sterile posto sul ghiaccio. Successivamente, aggiungere al tubo la stessa metà del volume totale di matrigel scongelato per ottenere una diluizione uno a uno, mantenendo il tubo sul ghiaccio. Successivamente, posizionare 50 microlitri della miscela di matrigel e mezzo al centro delle pozzette designate di una piastra a 24 pozzette e incubare la piastra in un incubatore a 37 gradi Celsius con aria umidificata e 5%CO2 per 10 minuti.

Quindi aggiungere ulteriori 450 microlitri di miscela di mezzo matra gel nei pozzetti e incubare per altri 60 minuti. Durante la seconda incubazione, preparare una sospensione uno a uno di fibroblasti e cellule epiteliali a una concentrazione di 0,5 × 10⁵ cellule in ciascun 0,5 millilitro di mezzo H me. Quando la miscela di mezzo matrigel si sarà solidificata, depositare delicatamente la sospensione cellulare sulla sommità del gel e reinserire la coltura nell'incubatore per due giorni.

Cambiare il mezzo ogni due o tre giorni aspirando molto delicatamente il mezzo dal lato della pozzetta e sostituendolo delicatamente con mezzo HEC fresco; monitorare quotidianamente la formazione di sferoidi al microscopio, utilizzando microscopia a luce visibile o microscopia a fluorescenza, secondo necessità. Iniziare pipettando il coltura su e giù per 10 volte utilizzando una pipetta di vetro sterile da due millilitri. Successivamente, trasferire la coltura con la pipetta di vetro in un tubo da centrifuga sterile da 15 millilitri e centrifugare per 10 minuti a 350 ×g a temperatura ambiente; dopo la centrifugazione, il pellet cellulare si depositerà sul fondo del tubo.

Utilizzare la punta di una pipetta Pasteur sterile per rimuovere delicatamente il gel Matrigel disgregato dalla parte superiore della provetta da centrifuga. Preparazione. Aggiungere ora un millilitro di mezzo H-Mac al pellet, aspirando e dispensando due o tre volte con una pipetta di vetro sterile da due millilitri, quindi trasferire la coltura in una pozzetta di una piastra per colture cellulari a 24 pozzette. Lasciare attaccare le cellule alla piastra per almeno 48 ore prima di sostituire il mezzo.

Nel tempo, le cellule abbandoneranno la struttura sferoidale e cresceranno come monocapato dopo che le colture cellulari avranno raggiunto il 50% di confluenza; passarle utilizzando un protocollo standardizzato in una piastra da 35 millimetri per due-quattro giorni, quindi passarle in una piastra da 100 millimetri per tre-cinque giorni prima di ulteriori analisi delle cellule. Utilizzare una pipetta Pasteur sterile per aspirare il mezzo e quindi rimuovere manualmente il maggior numero possibile di sferoidi residui. Nelle colture co-sferoidali tridimensionali, i fibroblasti con silenziamento ingegnerizzato della TM1, come dimostrato nelle figure D, E e F, inducono un aumento dell'invasione della matrice da parte delle cellule epiteliali di memoria rispetto ai fibroblasti di controllo mostrati nelle figure A, B e C. Si noti le proiezioni epiteliali che invadono la matrice nei sferoidi contenenti fibroblasti con TM1 silenziata, indicate dalle frecce nelle figure D e F. I fibroblasti con sovraespressione ingegnerizzata della TM1, mostrati qui nelle figure J, K e L, inducono una riduzione dell'invasione da parte della linea cellulare di carcinoma mammario SUM159 rispetto ai fibroblasti di controllo nelle figure G, H e I. Confrontare la mancanza di proiezioni epiteliali nei sferoidi contenenti fibroblasti ingegnerizzati con TM1 con quelli contenenti fibroblasti di controllo, indicata dalle frecce nelle figure G e I, una volta stabilite le colture co-sferoidali.

Le popolazioni cellulari possono essere isolate dagli steroidi mediante reimpianto in un contesto bidimensionale. Questa serie di immagini mostra colture osservate mediante microscopia ottica e a fluorescenza dopo l'isolamento dalla coltura in matrigel. Il giorno zero rappresenta l'immagine subito dopo l'isolamento, mentre i giorni uno, due e cinque indicano i giorni successivi all'isolamento.

Osservare come la corona di cellule che abbandonano questo follicolo aumenti nel tempo. Alla fine, rimane un follicolo fantasma con pochissime cellule, come evidenziato qui dalla freccia. Dopo la rimozione dei follicoli fantasma e un passaggio, rimangono pochissimi follicoli.

A seconda dei tassi di crescita relativi delle cellule testate, popolazioni pure possono emergere attraverso passaggi seriali oppure possono essere separate utilizzando marcatori cellulari appropriati. In questo esempio, i campioni vengono analizzati mediante citometria a flusso, utilizzando la fluorescenza verde e la fluorescenza rossa per identificare rispettivamente i fibroblasti esprimenti GFP e le cellule epiteliali esprimenti mCherry, al fine di determinare le proporzioni relative di cellule epiteliali e fibroblasti.

Dopo l'isolamento dalla coltura tridimensionale, le cellule epiteliali mantengono le proprietà conferite dalla co-coltura con fibroblasti per periodi prolungati, offrendo ampie opportunità di analisi. In questo esempio, l'esposizione a fibroblasti carenti di TM1 ha indotto un aumento della migrazione nelle cellule H max co-coltivate, che è persistito per settimane dopo l'isolamento dalla co-coltura 3D, rispetto all'esposizione a fibroblasti di controllo indicati qui come C. Seguendo questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi, come quelli per analizzare i cambiamenti nell'espressione genica e nei marcatori epigenetici, al fine di rispondere ad ulteriori domande sugli effetti dei fibroblasti sulle cellule epiteliali.