TransFLP - un metodo per modificare geneticamente Vibrio cholerae Sulla base di trasformazione naturale e FLP-ricombinazione

Lo scopo di questa procedura è quello di manipolare geneticamente il vio cray utilizzando questo metodo rapido e carente, che si basa sulla trasformazione naturale e sulla combinazione di flip. Ciò si ottiene preparando prima una fonte di chitina adeguata, poiché la chitina è l'induttore naturale della trasformazione. Durante la seconda fase, viene generato un costrutto di DNA utilizzando due cicli di PCR e viene eseguita la loro trasformazione naturale, consentendo al flip del plasmide PBR contenente batteri di assorbire il frammento di PCR e incorporarlo nei loro genomi.

Successivamente, viene utilizzato uno sbalzo di temperatura per indurre l'enzima lipasi codificato dal plasmide per la rimozione del bersaglio di ricombinazione flip o della cassetta di resistenza agli antibiotici fiancheggiata dal sito FRT. Nella fase finale, i batteri vengono curati dal plasmide codificante FLP. In definitiva, la PCR e il sequenziamento vengono utilizzati per dimostrare che la manipolazione genetica ha avuto successo.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'uso di plasmidi suicidi per manipolare geneticamente la vire, è che questo metodo è molto veloce ed efficiente. Iniziare pesando campioni da 50 a 80 milligrammi di fiocchi di chitina in provette di plastica standard da 1,5 millilitri, quindi tenendo aperti i coperchi delle provette, sterilizzare in autoclave i fiocchi dopo che l'autoclave ha chiamato immediatamente chiudere i coperchi e conservare il kit per autoclave in scaglie a temperatura ambiente, sono necessari almeno sei oligonucleotidi per amplificare le regioni del DNA di interesse, così come la cassetta antibiotica fiancheggiata FRT mediante PCR. Si consiglia inoltre di includere un paio di primer oligonucleotidici al di fuori del frammento di PCR inserito.

Ciò consente di verificare con cura l'integrazione e la corretta escissione del design della cassetta di resistenza agli antibiotici FRT affiancato da FRT, gli oligonucleotidi numero due, numero tre, numero quattro e numero cinque. I primer due e cinque dovrebbero contenere almeno 28 paia di basi per essere in grado di inginocchiarsi sufficientemente al DNA genomico e ai primer. Il tre e il quattro dovrebbero essere costruiti con un FRT contenente plasmidi come primer di progettazione modello due e cinque per consentire un ampio accoppiamento di basi complementari all'estremità cinque tra i primer due e tre e i primer quattro e cinque rispettivamente.

Ora per il primo ciclo di PCR, utilizzare gli oligonucleotidi uno e due per preparare la prima di tre reazioni di PCR simultanee, ma indipendenti, per l'amplificazione della regione a monte della regione sperimentale di interesse dei costrutti progettati su misura. In parallelo, preparare la seconda reazione di PCR utilizzando gli oligonucleotidi tre e quattro per amplificare la cassetta antibiotica fiancheggiata da FRT. Ad esempio, in questo esperimento, è stato utilizzato il gene A PH che codifica per la resistenza canina.

In concomitanza amplificare la regione del DNA a valle preparando la terza reazione di PCR utilizzando gli oligonucleotidi cinque e sei e il DNA genomico come stampo. Quindi avviare la reazione di PCR per tutti e tre i campioni dopo la purificazione di tutti e tre i frammenti della PCR, utilizzare una miscela con quantità uguali di tutti e tre i frammenti ottenuti nel primo ciclo come modello per eseguire un secondo ciclo di PCR. Questa amplificazione sarà catalizzata dagli oligonucleotidi uno e sei.

Il frammento di PCR risultante servirà come DNA trasformante negli esperimenti di trasformazione naturale. Dopo aver coltivato v cellule di colera, mezzo aerobicamente arricchito a 30 gradi Celsius. Raccogliere i batteri mediante centrifugazione a temperatura ambiente.

Successivamente, trasferire la coltura batterica sull'aquilone in scaglie e incubare la sospensione cellulare per una notte a 30 gradi Celsius. Successivamente, mescolare accuratamente almeno 200 nanogrammi dei frammenti derivati dalla PCR del secondo ciclo nella sospensione cellulare batterica. Facendo attenzione a non staccare eccessivamente i batteri dalle superfici della chitina, incubare questa soluzione a 30 gradi Celsius senza movimento per un altro giorno.

Ora vortice, la coltura vigorosa per almeno 30 secondi per i batteri che ospitano il plasmide flip PBR diffonde da 100 a 300 microlitri della soluzione cellulare su doppie piastre selettive contenenti ampicillina. Oltre agli altri antibiotici nelle piastre, incubare le colture cellulari batteriche a 30 gradi Celsius fino a quando le colonie non sono visibili. Quindi isolare i singoli trasformanti dalle piastre selettive.

Inizia questo passaggio facendo crescere i batteri su piastre di agar LB contenenti ampicillina a 37 gradi Celsius per 16-24 ore. Come passaggio facoltativo, modificare la temperatura per due o tre ore a 40 gradi Celsius poiché l'espressione del flip dal plasmide flip PBR viene repressa a temperature più elevate. Dopo altre otto ore di incubazione a 37 gradi Celsius, trasferire i batteri su piastre fresche.

Ora restringi i cloni in parallelo su piastre di agar contenenti antibiotici e prive di antibiotici per testare la sensibilità agli antibiotici e quindi isolare una singola colonia sensibile agli antibiotici risultante. Inizia questo passaggio coltivando la coltura durante la notte in condizioni aerobiche a 30 gradi Celsius, arricchendo il terreno senza antibiotici. La mattina successiva coltivare una nuova coltura per tre-sei ore diluendo la coltura notturna in un rapporto da uno a 100 in un terreno fresco privo di antibiotici nel pomeriggio striare o diluire la piastra della coltura su semplici piastre di agar LB, quindi incubare le piastre per altre 8-16 ore a 30 gradi Celsius fino a quando le colonie sono visibili.

In questo primo esperimento mirato a eliminare i geni vicini CTXA e CTXB. Gli oligonucleotidi per il metodo trans flip sono stati generati come appena dimostrato dal ceppo parentale, il ceppo intermedio che ospita la cassetta di resistenza agli antibiotici fiancheggiata da FRT invece del locus originale del DNA di C-T-X-A-B e il ceppo finale eliminato per C-T-X-A-B e liberato dalla cassetta di resistenza sono stati tutti testati per il loro genotipo La PCR all'ingrosso è stata eseguita per questo esperimento utilizzando primer che non si inginocchiavano al frammento di PCR trasformante, ma solo al DNA cromosomico. I frammenti della PCR sono stati separati mediante elettroforesi standard su aerogel per determinarne le dimensioni.

Nella corsia uno, il ceppo mondiale di colera di tipo B è stato localizzato alla dimensione prevista del frammento di 3.143 paia di basi. Nella seconda corsia, il frammento PCR derivato dal ceppo delta C-T-X-A-B-F-R-T può. L'FRT era situato a 3.162 coppie di basi.

E nella corsia tre, il frammento delta ctx A B FFR TP CR si trovava a 1.769 coppie di basi rispetto alla scala da un KB. Nel secondo esempio in cui è stata rimossa un'intera isola genomica, è stata scelta come bersaglio per questo esperimento quella dell'isola di patogenicità del vibrione o VPI. Il metodo trans flip è stato modificato in due passaggi.

In primo luogo, l'integrazione del gene di resistenza alla kanamicina è stata preceduta da un singolo sito FRT all'inizio di PI one. Successivamente è stato eseguito un secondo ciclo di trasformazione naturale, che ha permesso l'inserimento di un ulteriore marcatore di resistenza agli antibiotici, ovvero la resistenza alla gentamicina, seguito da un secondo sito FRT alla fine dell'isola di patogenicità. Le rispettive coppie di primer sono indicate sopra ogni immagine in gel e il metodo trans FLP è stato continuato come appena dimostrato.

I ceppi parentale, intermedio e finale sono stati tutti verificati mediante PCR del DNA genomico purificato nella corsia uno. Il frammento PCR del ceppo selvaggio di colera di tipo V è stato eseguito nella corsia due. È stato eseguito il frammento di PCR risultante dal ceppo VPI un FRT può GM FRT.

E nella corsia tre, è stato analizzato il ceppo delta VPI un prodotto di PCR derivato da FRT. Le coppie di primer sono indicate sopra ogni immagine in gel. La varietà finale manca dell'intera VPI.

In questo terzo esempio, una sequenza di promotori dipendente dalla T sette RNA polimerasi è stata integrata a monte con il gene T fox, un importante regolatore della trasformazione naturale utilizzando il metodo trans flip con una leggera modifica rispetto al protocollo standard. La sequenza consenso del promotore dipendente dal T sette RNA è stata inclusa come sporgenze negli oligonucleotidi numero quattro e numero cinque, in modo che questa sequenza di DNA fosse mantenuta all'interno del cromosoma. Anche dopo che la cassetta di resistenza agli antibiotici è stata asportata, il costrutto è stato poi integrato in un ceppo colorato V di RNA polimerasi T sette.

In questo ceppo, l'espressione del gene T sette RNA polimerasi è stata guidata dal promotore LAC UV five per testare l'espressione dipendente dalla T sette RNA polimerasi di T Fox I saggi di trasformazione naturale sono stati eseguiti in terreno LB. Il ceppo parentale privo del promotore T sette dipendente che precede il gene T Fox non è naturalmente trasformabile in queste condizioni a causa della mancanza di trascrizione di T FOX in terreno ricco e in assenza del suo induttore naturale chitina. Questo fenotipo era indipendente dal fatto che la RNA polimerasi T sette fosse stata indotta artificialmente dall'IPTG o meno.

Tuttavia, il ceppo generato da trans flip, che contiene il promotore dipendente dalla RNA polimerasi T sette a monte del gene di competenza T Fox, era effettivamente un terreno arricchito naturalmente trasformabile a causa della perdita del promotore LAC UV cinque nel terreno LB. La T sette RNA polimerasi prodotta ha già trascritto T FOX dal promotore dipendente dalla T sette RNA polimerasi senza induzione da parte di IPTG. Questo ha avviato la competenza naturale e la trasformazione confermando la funzionalità della sequenza integrata del promotore dipendente dalla T sette RNA polimerasi.

Questo fenotipo è stato significativamente potenziato dall'induzione completa della RNA polimerasi T sette dovuta all'aggiunta dell'induttore del promotore LAC UV cinque IPTG. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione su come manipolare geneticamente il colera VI utilizzando una combinazione di trasformazione naturale indotta dalla chitina e ricombinazione flip. Una volta padroneggiata, questa tecnica consente di eliminare i geni o le isole genomiche, nonché di integrare le sequenze di DNA in modo diretto al sito in pochi giorni.