Studiare Checkpoint mitotica illustrando un comportamento dinamico delle proteine ​​cinetocoro e Motion cromosoma in Living

Lo scopo di questo esperimento è dimostrare la visualizzazione della dinamica proteica e dei modelli di localizzazione in vivo in embrioni di drosophila vivi mediante microscopia confocale a intervalli di tempo. Questo viene realizzato innanzitutto raccogliendo embrioni da ceppi di drosophila mantenuti in coltura. Successivamente, si trasferiscono gli embrioni su un vetrino e quindi si rimuovono manualmente le corionti dagli embrioni per ottenere embrioni decoronati.

Successivamente, gli ovociti vengono montati in modo ordinato su vetrini precedentemente preparati e, a seconda dell'esperimento, possono essere microiniettati con appropriati reagenti induttori del checkpoint del fuso. L'ultimo passaggio di questa procedura consiste nell'eseguire un'analisi in time-lapse degli embrioni mediante microscopia confocale. In definitiva, la microscopia in time-lapse e a fuoco ravvicinato viene utilizzata per mostrare le proteine del checkpoint del fuso, il comportamento cromosomico in colocalizzazione e l'effetto di agenti induttori del checkpoint in linee transgeniche di oph correlate al checkpoint.

Il metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nel campo della regolazione del ME, come l'effetto delle mutazioni o deplezioni delle proteine del checkpoint della fuso, ottenute mediante l'uso di linee geniche, sulla colocalizzazione degli altri componenti del checkpoint, e la conseguenza di ciò sulla capacità del checkpoint dell'assemblaggio del fuso di funzionare in modo efficiente. Le mosche transgeniche vengono mantenute a 25 gradi Celsius in provette di plastica contenenti cibo per mosche, con aggiunta di polvere di lievito secco sulla superficie. La provetta viene sostituita regolarmente ogni due o tre settimane, a seconda delle condizioni di crescita.

Per preparare il terreno per moscerini, riscaldare una quantità adeguata della miscela per terreno per moscerini con mescolamento costante per sciogliere i componenti utilizzando una pompa peristaltica, quindi distribuire da otto a dieci millilitri di questo mezzo sotto forma di sospensione in ciascun vial di plastica. Una volta che la sospensione ha preso consistenza e raggiunto la temperatura ambiente, tappare ogni vial con un tappo di ovatta di cotone. Disporre questi vial contenenti il terreno in un vassoio, sigillarli in un sacchetto di plastica e conservarli a quattro gradi Celsius per una raccolta di uova su piccola scala.

Trasferire circa 50 coppie di moscerini adulti di due-tre giorni in un nuovo tubo contenente alimento per moscerini, aggiungendo sulla superficie una polvere di lievito secco per favorire la deposizione degli embrioni. Incubare a 25 gradi Celsius, temperatura mantenuta in questo caso dal condizionamento dell'aria. Ogni ora, trasferire i moscerini in un nuovo tubo e lasciare gli embrioni per 30 minuti.

Per assicurare che alcuni degli embrioni raccolti si trovino intorno al ciclo di divisione nucleare dall'ottavo al decimo. La raccolta della prima ora viene normalmente scartata poiché spesso contiene embrioni invecchiati che erano trattenuti all'interno dei corpi femminili quando le condizioni non erano adatte alla deposizione. Pertanto, solo gli embrioni ottenuti dal trasferimento a partire dalla seconda ora verranno utilizzati in questi esperimenti.

Vengono utilizzati vetrini da microscopio e coprioggetti di dimensioni 50 per 22 millimetri per questa procedura. Iniziare prendendo un coprioggetto e, con un pennello fine leggermente umido, inumidire appena i quattro angoli su un lato con una quantità molto ridotta di acqua. Posizionare il coprioggetto su un vetrino da microscopio.

La tensione superficiale capillare causata dal sottile film liquido dovrebbe impedire che il vetrino coprioggetto si sposti. Applicare una sottile striscia di colla all'eptano al centro del vetrino coprioggetto. L'eptano dovrebbe evaporare in pochi secondi, lasciando la colla sul vetrino coprioggetto.

Successivamente, utilizzare una penna a punta di diamante per tagliare un altro vetrino in piccoli quadrati di circa 1,5 millimetri di lato. Prendere un quadrato e posizionarlo su una estremità della striscia di colla. Questo verrà utilizzato per aprire la punta dell'ago quando è richiesta la microiniezione.

Prendere un altro vetrino e attaccare su di esso un pezzo di nastro adesivo doppio faccia lungo due centimetri, quindi rimuovere la pellicola protettiva per iniziare la procedura di rivestimento degli embrioni. Trasferire le mosche in una provetta con nuovo terreno di coltura utilizzando un pennello sottile e umido. Trasferire circa 50 uova sul nastro adesivo doppio faccia del vetrino preparato.

Utilizzare una quantità adeguata di liquido in modo che le uova possano essere disperse. Quando il liquido sarà evaporato, le uova aderiranno al nastro sotto un microscopio stereoscopico. Toccare delicatamente le uova più volte lungo il loro asse maggiore con la parte esterna di una delle due estremità di una pinzetta, finché il corion non si rompe e si apre.

Lasciare l'embrione nel guscio di Corian per prevenire una rapida disidratazione. Continuare questo processo fino a quando sono stati trattati da 10 a 20 uova. Successivamente, raccogliere gli embrioni rimuovendoli uno alla volta dal guscio di Corian e posizionarli delicatamente in una striscia verticale.

Sul nastro adesivo. Allineare gli embrioni con il lato lungo in senso antiparallelo rispetto al lato lungo del nastro adesivo. Posizionare gli embrioni in una camera di disidratazione per tre a otto minuti.

Infine, coprire gli embrioni con una quantità adeguata di olio volter left tennis per prevenire una disidratazione eccessiva prima della microiniezione. La microingestione è l'aspetto più difficile di questa procedura. Per rendere la microingestione il più semplice ed efficiente possibile, è necessario seguire il protocollo specifico per la preparazione degli aghi.

Gli embrioni devono essere preparati con attenzione in modo da trovarsi nelle condizioni ottimali per la microiniezione. I capillari per la microiniezione degli embrioni vengono preparati in anticipo. Utilizzando una punta di carico fine, riempire il capillare dal retro con uno o due microlitri di una concentrazione appropriata del reagente in tampone di iniezione.

Montare l'ago nel portaago sul microscopio confocale invertito Leica TCSP due con il tubo della pressione collegato al sistema di controllo dell'iniezione. Individuare un embrione con l'obiettivo da 40 volte. Successivamente, individuare l'ombra dell'ago senza cambiare il piano focale.

Questo si ottiene spostando l'ago al centro del campo visivo e abbassandolo gradualmente fino al corretto piano focale. Muovere molto delicatamente la piastra del microscopio per individuare il piccolo quadrato di coprioggetto premontato a un'estremità della striscia di colla. Spostare con estrema delicatezza la punta dell'ago finché non tocca il bordo del piccolo quadrato di coprioggetto e lo rompe leggermente.

Spostare la piastra in modo che gli embrioni tornino visibili e selezionarne uno all'età corretta per l'iniezione. Spostare con attenzione l'embrione vicino all'ago e regolare nuovamente il piano focale sia per l'embrione che per l'ago. Introdurre l'embrione nell'ago.

Iniettare una goccia di reagente sul lato dell'embrione, quindi spostare l'embrione. Acquisire immagini in intervallo di tempo o singole immagini di embrioni vivi utilizzando un sistema a microscopio confocale invertito Leica TCSS SP2 con un obiettivo a immersione in olio da 40 volte. Quando si esegue l'acquisizione di più fluorofori che presentano spettri sovrapposti ed espressi contemporaneamente nello stesso embrione, ogni lunghezza d'onda di emissione delle proteine fluorescenti viene acquisita in modo sequenziale.

Le immagini sono emerse successivamente durante l'impostazione degli intervalli temporali per l'acquisizione in time-lapse. Questi fattori devono essere presi in considerazione. Comunemente, un'immagine singola viene ottenuta come media di due linee di scansione.

Con una media di due scansioni di fotogrammi, occorrono almeno 6,3 secondi per scansionare un'immagine di cinque per dodici su cinque per dodici pixel in modalità di scansione simultanea e 15,44 secondi in modalità di scansione sequenziale, al fine di ottenere un buon rapporto segnale-rumore. Il diaframma è normalmente impostato da uno a due au, ovvero unità di Airy, e la potenza del laser viene regolata al livello più basso possibile per evitare qualsiasi significativo fotoblesamento. Questo filmato rappresentativo in time-lapse mostra il reclutamento dinamico del core cinetico di CDC 20 e il movimento dei cromosomi in embrioni vivi di ophs in cial.

Sono state acquisite immagini in time-lapse da un embrione transgenico iniziale che esprime contemporaneamente GFP-CDC20, mostrato in verde, e RFP-Histone H2B, mostrato in rosso. Durante i cicli di divisione nucleare, sono stati acquisiti sette-otto fotogrammi ogni 10 secondi, e il fotogramma in cui le cellule sono già in profase è considerato come punto zero del tempo. Questa figura mostra i fotogrammi del filmato in time-lapse: GFP-CDC20 può essere chiaramente osservato sui cinetocori in profase e prometafase, come indicato dalle frecce bianche rispettivamente nelle immagini tre e quattro, e persiste sui cinetocori in metafase e anafase, come osservato rispettivamente nelle immagini cinque e sei.

La G-F-P-C-D-C 20 è esclusa dal nucleo interfasico indicato dalla testa di freccia bianca nell'immagine uno ed entra nel nucleo in profase precoce come mostrato nell'immagine due. Nelle immagini da otto a 14, le morfologie della cromatina sono state determinate utilizzando l'istone RFP due B espresso in co-marcazione. Le immagini sono mostrate nella riga inferiore.

Utilizzando questo protocollo, le funzioni del checkpoint dell'assemblaggio del fuso, o SAC, possono essere studiate manipolando gli embrioni mediante microiniezione di anticorpi, proteine marcate con fluorocromo o composti chimici di interesse che potenzialmente attivano il SAC. In questo esempio, gli embrioni sono trattati con colchicina per depolimerizzare i microtubuli, inducendo così il SAC. GFP CDC 20 o GFP MAD2 sono stati utilizzati. Due segnali cinetici del complesso centrale sono stati impiegati come marcatori del progresso del ciclo cellulare.

Nel pannello superiore, l'ARES indica gli esci arrestati nelle immagini da due a sei. L'area contrassegnata da una freccia nell'immagine uno indica lo stato precedente al trattamento con colchicina, in cui la G-F-P-C-D-C 20 è esclusa dal nucleo in fase tardiva. Le immagini nel pannello centrale mostrano che in assenza della MAD endogena, la G-F-P-C-D-C 20 indicata dalle frecce nelle immagini da sette a dodici continua a oscillare all'interno e all'esterno del nucleo e lungo e lontano dal corso cinetico.

Sebbene la citocinesi sembri essere difettosa, ciò suggerisce un malfunzionamento del SAC nel bloccare le cellule in risposta al trattamento con colchicina. Un esempio di mancata separazione del nucleo figlio è osservabile nell'immagine 10. Infine, nel pannello inferiore, le frecce nelle immagini da 14 a 18 indicano nuclei chinetici arrestati con accumulo di proteine di fusione GFP MA due, il che suggerisce che la GFP MA due funzionale recupera il fenotipo difettoso del SAC nell'embrione mutante MA due.

La freccia nell'immagine 13 indica l'accumulo di GFP MAD2 in un nucleo in fase tardiva di interfase. Dopo aver visionato questi video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come raccogliere gli embrioni di Drosophila dal mantenimento dei peduncoli, disincagliare manualmente gli embrioni prima di preparare vetrini per l'ingestione microscopica e l'acquisizione di immagini in vivo in tempo reale mediante microscopia confocale.