Una tecnica semplificata per

Oggi stiamo dimostrando una tecnica semplificata per prelevare tessuto corneale e retinico da un bulbo oculare umano di donatori cadaverici. La tecnica descritta quest'anno contribuirà a ottenere tessuti di buona qualità da utilizzare per trapianti, scopi chirurgici e ricerche scientifiche, senza danneggiare altri tessuti del bulbo oculare. Con 18 anni di esperienza e migliaia di cornee trapiantate ogni anno, abbiamo mantenuto un elevato standard del nostro lavoro sviluppando nuove tecniche e migliorando costantemente le nostre competenze.

Per raggiungere questo obiettivo, esercitiamo prima sulla cornea, seguito dagli eviscerati retinici. La cornea è un tessuto avascolare che consente la trasmissione della luce sulla retina e, a tale scopo, deve sempre mantenere un buon grado di trasparenza. La cornea comprende cinque strati: l'epitelio, la membrana di Bowman, lo stroma, la membrana di Descemet e l'endotelio.

Se la cornea è danneggiata, può essere sostituita con l'aiuto di una cornea donatrice adatta. La coroide è la tunica intermedia tra la sclera e la retina, delimitata internamente dalla membrana di Bruch ed è responsabile del flusso sanguigno nell'occhio. Un'adeguata escissione della coroide è altrettanto importante della rimozione della retina.

La retina contribuisce a ricevere la luce dalla cornea e dal cristallino e la converte in energia chimica, che viene successivamente trasmessa al cervello. Con l'aiuto del nervo ottico, poiché è trasparente e delicato, deve essere escisso in modo sistematico per ottenere un tessuto di buona qualità. Accendere la cappa a flusso laminare.

Pulire il cabinet a flusso laminare utilizzando alcol isopropilico al 70%. Indossare indumenti protettivi personali come cappuccio chirurgico, guanti sterili e maniche sterili. Utilizzando una tecnica asettica, preparare il campo sterile posizionando un telo sterile e un vassoio di strumenti pre-sterilizzato.

Aprire in modo asettico il vassoio degli strumenti sterili e capovolgerlo sul campo sterile, evitando qualsiasi contaminazione. Posizionare tutti i materiali e strumenti sterili all'interno del campo sterile e disporre i contenitori per occhi contenenti i bulbi oculari in modo che siano distanti dal bordo del campo sterile. Per comodità d'uso, etichettare le bottiglie con il mezzo di conservazione già preparato e posizionare il coperchio di iodio poliol pirro sul tiosolfato di sodio e una soluzione sterile di tampone salino fosfato.

All'esterno dell'alimentazione sterile, lasciare che i tessuti oculari e le soluzioni raggiungano la temperatura ambiente normale, poiché vengono conservati in frigoriferi a quattro gradi Celsius. Evitare cicli ripetuti di riscaldamento o raffreddamento. Rimuovere garze e spugne dal contenitore per occhi utilizzando pinze sterili.

Posizionare il bulbo oculare sulla palpebra e rimuovere le bende aggiuntive. Prelevare con cura il bulbo oculare con il nervo ottico e immergere il bulbo in IPVP sterile. Decontaminare i bulbi oculari in IPVP sterile per due minuti.

Trasferire il globo in solfato di sodio sterile per un minuto. Trasferire i globi in soluzione sterile tampone fosfato per linea cellulare e lasciare fino al momento dell'utilizzo. Lavorando sotto cappa a flusso laminare, lavare e rimuovere il globo oculare dal PBS e posizionarlo nel campo sterile.

Avvolgere il bulbo oculare con lo steroide, lasciando scoperta la cornea e circa cinque millimetri di sclera a partire dalla cornea; il bulbo oculare può essere semplicemente tenuto in mano. Mantenere una pressione adeguata utilizzando forbici sterili. Rimuovere tutti i residui eventuali della congiuntiva senza danneggiare la cornea.

Utilizzare una lama di bisturi monouso per eseguire un'incisione sclerale di tre o quattro millimetri a partire dalla regione del limbo. Successivamente, estendere l'incisione di 360 gradi, evitando di perforare il tessuto uveale sottostante o di causare alcuna deformazione della curvatura normale della cornea. Eseguire quattro incisioni ampie lasciando quattro piccoli spazi, evitando la fuoriuscita del corpo vitreo.

Tutti e quattro gli intervalli vengono tagliati, assicurando che non venga rimossa alcun'altra porzione di tessuto. La presenza di piccole placche sclerali può ostacolare il taglio; pertanto, assicurarsi del completamento dell'escissione sclerale mediante forbici per microchirurgia. Questa operazione deve essere eseguita senza danneggiare la coroide, la retina e il corpo vitreo.

Ispezionare l'incisione per assicurarsi che sia completa. Se l'incisione è stata eseguita correttamente, il margine corneosclerale aderisce al corpo ciliare solo nel punto corrispondente alla cornea; posizionare l'occhio ribaltato vicino al centro del campo sterile. Completare la rimozione della cornea utilizzando pinze sterili.

Mantenere fermo il margine sclerale ed escindere il margine corneo-sclerale dal bagliore oculare. Separare delicatamente eventuali strutture adiacenti residue dal pulsante corneo-sclerale. Non tirare mai il margine corneo-sclerale in un modo che possa causare tensione trasversale sulla cornea, né permettere che ricada nuovamente nella camera anteriore.

La densità delle cellule endoteliali della cornea viene verificata utilizzando una soluzione ipotonica e la mortalità cellulare mediante colorazione con triplo blu per circa un minuto. Rimuovere il colorante triplo blu su una garza sterile e lavare la cornea in PBS sterile. Trasferirla in una piastra di Petri sterile contenente soluzione di saccarosio.

Questa soluzione aiuta a creare un ambiente ipotonico e permette l'identificazione visiva delle cellule. Le cellule vengono quindi contate al microscopio ottico con un'ingrandimento di cento x e misurate come numero di cellule per millimetro quadrato. Generalmente si esaminano aspetti legati alla densità cellulare e alla morfologia, come i bordi intercellulari, polimorfismo, degenerazione, distrofia e mortalità cellulare.

Lo spessore della cornea è anch'esso un aspetto importante per il trapianto, insieme a un buon tasso di trasparenza della cornea escissa. Un CLO corneale sterile viene utilizzato per fissare la cornea al margine sclerale, piegando il CLO corneale per assicurare un'apertura del foro sufficiente a bloccare il margine sclerale, quindi trasferendo il margine sclerocorneale utilizzando un bastoncino corneale in un apposito contenitore di conservazione corneale preparato in precedenza con mezzo di conservazione a temperatura ambiente. La cornea deve quindi essere conservata a 31 gradi SIUs durante le quattro settimane di conservazione.

Il mezzo di conservazione viene sottoposto a diversi test microbiologici mediante uno strumento B 9 2 4 0. Durante la conservazione, la cornea aumenta di spessore rispetto alle dimensioni normali richieste per il trapianto. Le banche degli occhi utilizzano agenti D swelling per ridurre lo spessore; il 6%Dextron T 500 viene impiegato per riportare la cornea alle sue dimensioni normali e come mezzo di trasporto.

Pulire gli strumenti sterili con l'app per RNA per creare un ambiente privo di RNAsi prima dell'escissione della retina. Preparare il campo sterile e assicurarsi che il bulbo oculare sia integro e che vengano rimossi solo la cornea e il margine sclerale. Se il corpo vitreo sta fuoriuscendo, diventa difficile rimuovere il tessuto retinico.

Se il donatore ha meno di 65 anni, la sclera viene conservata in alcol al 70% a scopo chirurgico dopo i test sierologici. In tali casi, la sclera non viene tagliata, ma solo il corpo vitreo viene asportato e l'intera sclera viene conservata per l'escissione della retina. Iniziare con un piccolo taglio o incisione vicino al lato corneale della sclera, procedendo verso il nervo ottico utilizzando pinze e forbici sterili.

Tenere la parte della sclera utilizzando pinze sterili e tagliare con le forbici in direzione del nervo ottico, pezzo per pezzo, evitando di danneggiare il corpo vitreo. I tappi corioidali devono essere separati dalla sclera poiché sono attaccati insieme. Tagliare tutta la sclera per esporre il tessuto corioideale. Cosa?

Una volta completato il taglio della sclera, separare la sclera dai tessuti rimanenti tagliandola in prossimità del nervo ottico; a questo punto sarà visibile un intero strato di corioide che ricopre il corpo vitreo. Riempire queste provette sterili prive di RNAsi con due ml di RL in seguito, utilizzando due pinzette sterili. Rimuovere delicatamente lo strato di corioide afferrando il nervo ottico con una coppia di pinzette ed eliminando il corioide con l'altra.

Separare parzialmente la coroide e tagliarla per facilitare l'asportazione. Lo strato coroideale può essere tagliato con le forbici, evitando danni alla retina. Posizionare lo strato coroideale asportato nella soluzione RNA later e conservarlo a quattro gradi Celsius per 24 ore.

Rimuovere tutto il corio aggiuntivo per esporre il tessuto retinico. Una volta rimossa l'intera lamina corioidea, si osserverà uno strato trasparente di retina. È evidente che lo strato corioide presenta una membrana interna detta membrana di Bruch, che potrebbe essere anch'essa rimossa, ma è difficile identificarla a occhio nudo.

In modo analogo, utilizzare due pinzette per rimuovere il foglietto retinico. È facile isolare una grande quantità di retina se l'asportazione avviene in prossimità del nervo ottico. A questo punto è possibile osservare tutti i foglietti dell'occhio.

Posizionare la retina escissa nella soluzione RNA later e conservarla a quattro gradi Celsius per 24 ore. Pulire l'area di lavoro utilizzando alcol isopropilico al 70%. Le cellule endoteliali colorate con trip e blu possono essere osservate a un ingrandimento di cento volte al microscopio invertito.

Una cornea adatta con più di 200 cellule per millimetro quadrato viene solitamente conservata per ulteriori utilizzi. Valutarle da qualità discreta a eccellente sarà utile per studi comparativi. Di solito, una volta che la cornea è pronta per il trapianto, si rilevano lo spessore e la trasparenza, e una cornea adatta viene utilizzata per la cheratoplastica perforante, in cui l'intera cornea viene trapiantata.

La mortalità cellulare viene verificata osservando le cellule colorate di blu e valutata in percentuale di cellule morte. Una mortalità cellulare complessiva superiore al 2% è considerata inadeguata durante la conservazione. Se la densità cellulare è inferiore a 2200 cellule per millimetro quadrato o se vi sono danni dovuti alla mortalità, la cornea può essere utilizzata per la cheratoplastica laminare anteriore.

Se il trauma anteriore è danneggiato e la cornea presenta una buona densità di cellule endoteliali, la cornea potrebbe essere utilizzata per la cheratoplastica lamellare posteriore. Lo spessore della cornea di solito aumenta durante la coltura in organo. Il mezzo di trasporto aiuta a ripristinare la sua forma e struttura normali.

Inoltre, la coltura organotipica favorisce la ri-epitelializzazione della cornea e, grazie al suo lungo periodo di conservazione, consente una corretta selezione del donatore. Test microbiologici e sierologici. Permette di disporre di un tempo sufficiente per organizzare un intervento chirurgico e di verificare la densità cellulare e la morfologia endoteliale quando ciò non sia possibile a causa di un elevato intervallo post mortem.

Pertanto, seguendo la procedura descritta, le cornee possono essere escisse senza alcun danno ai tessuti circostanti. Se la cornea non è adatta al trapianto, può essere utilizzata a fini di ricerca per sviluppare nuovi mezzi e condizioni di conservazione, per lo studio delle malattie della superficie oculare, per l'isolamento di cellule staminali limbali e per analizzare l'effetto dei farmaci sulla cornea. Per la retina, è possibile evitare la contaminazione incrociata dei campioni di RNA con tessuti cent, preservando l'integrità dell'RNA, elemento di fondamentale importanza.

Questi tessuti indispensabili per scopi di ricerca sono finalizzati alla caratterizzazione del trascrittoma dei tessuti oculari, all'isolamento di cellule staminali per progetti di medicina rigenerativa e alla valutazione delle differenze istologiche tra tessuti provenienti da soggetti normali o affetti da patologie. Una volta rimosso il tessuto retinico, questo può essere utilizzato per scopi diversi e, di conseguenza, i passaggi e le condizioni successivi per la conservazione possono variare. Ad esempio, il tessuto retinico può essere collocato in provette contenenti reagenti di stabilizzazione dell'RNA come r nator o thisis buffer per l'estrazione di RNA o DNA, oppure in displasia o tripsina per l'isolamento delle cellule.

Soluzioni di fissazione da utilizzare prima di includere i tessuti in paraffina o OCT per l'immunohistochimica. Grazie per aver guardato questo video e buona fortuna nella vostra ricerca.