GC-based Detection di acetato derivatizzata Glucosamina e muramico Acid Aldononitrile per la determinazione dei residui microbica nel terreno

L'obiettivo generale di questo video è fornire una descrizione dettagliata dell'analisi mediante GC dei derivati acetati di Aldon nitrile di glucosamina e acido muico estratti da suoli. Il processo inizia con la digestione acida, che degrada i polimeri organici e libera glucosamina e acido muico. I monomeri degli zuccheri amminici vengono quindi isolati e purificati dalla soluzione della miscela.

Successivamente segue la derivatizzazione, per convertire quegli zuccheri amino in acetonitrili aldonici volatili per l'analisi mediante cromatografia gassosa. L'ultima fase della procedura consiste nell'estrazione liquido-liquido e nella determinazione mediante GC. Infine, è possibile ottenere risultati che mostrano una separazione di base degli zuccheri amino acetonitrili aldonici, che eluiscono tra gli standard di mio e acetolo e la glutamina metilica, mediante GC con rilevamento a ionizzazione di fiamma.

Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ad altri metodi è che garantisce un equilibrio ottimale tra precisione, sensibilità, semplicità, buona separazione cromatica grafica e stabilità durante la conservazione del campione. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo del ciclo globale del carbonio, come il contributo dei microorganismi SSE alle riserve di carbonio stabile nel suolo. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sull'accumulo di detriti microbici nei suoli, può essere applicato anche in altre matrici come sistemi oceanici, tessuti biologici ed addirittura campioni extraterrestri.

Per iniziare questo protocollo, liofilizzare i campioni di suolo dopo il prelievo in campo, quindi macinare e omogeneizzare i campioni di suolo utilizzando un macinino a sfera o un mortaio e pestello. Pesare i campioni di suolo macinati in fiale di idrolisi da 25 millilitri. Aggiungere 10 millilitri di acido cloridrico sei molare in ciascuna fiala di idrolisi ed esaurire con gas azoto prima di chiudere ermeticamente.

Idrolizzare a 105 gradi Celsius in un incubatore per otto ore. Utilizzando un interruttore temporizzato automatico, rimuovere i becher dall'incubatore e far raffreddare a temperatura ambiente.

Aggiungere 100 microlitri di standard interno di acetolo di mio in ciascun matraccio. Mescolare agitando delicatamente e predisporre imbuto in plastica che convogliano in matracci a forma di pera da 200 millilitri. Utilizzare giunti conici standard di dimensione 24 40 in vetro smerigliato, posizionati su bicchieri di plastica per garantire stabilità.

Piegare i cerchi qualitativi Watman numero due in quarti e posizionarli nei becher. Agitare delicatamente ogni flacone di idrolisi e versare la sospensione nel filtro. Per filtrare ogni campione, asciugare il filtrato utilizzando un evaporatore rotante a circa 45 gradi Celsius applicando il vuoto.

Sospendere il residuo secco di ogni coppia di beute con tre a cinque millilitri di acqua e versare in un tubo in teflon da 40 millilitri. Risciacquare ogni beuta con un secondo aliquota di acqua. Regolare il pH dei campioni a 6,6-6,8 utilizzando una soluzione uno molare di idrossido di potassio per far precipitare gli ioni metallici e altre molecole organiche. Rimuovere quindi i precipitati mediante centrifugazione a 2000 ×g per 10 minuti, dopo la centrifugazione.

Versare i soprannatanti in provette di vetro da 40 millilitri e coprire le aperture delle provette con paraform. Congelare i soprannatanti e quindi praticare dei fori nel paraform. Liofilizzare i soprannatanti congelati per rimuovere tutto il liquido. Una volta che i soprannatanti sono stati essiccati, sciogliere il residuo con tre millilitri di metanolo anidro.

Vortexare accuratamente, chiudere i tubi e quindi centrifugare a 2000 × g per 10 minuti. Per far sedimentare i sali, trasferire i soprannatanti in provette coniche da tre millilitri ed evaporare a secco mediante un apparecchio VA rapido a 45 gradi Celsius o sotto un flusso delicato di gas azoto secco. Dopo l'evaporazione, aggiungere 100 microlitri di standard di recupero e metilglutamina, e un millilitro di acqua a ciascuna provetta.

Quindi congelare i campioni prima di iniziare la derivatizzazione. Preparare gli standard come descritto nel protocollo scritto, quindi liofilizzare sia i campioni che gli standard. Preparare il reagente di derivatizzazione contenente 32 milligrammi per millilitro di cloridrato di idrossilammina e 40 milligrammi per millilitro.

Quattro dimetilammino purina in metanolo purinico. Aggiungere 300 microlitri del reagente di derivatizzazione a ciascuna delle provette reattive, chiuderle ermeticamente e vortexare accuratamente. Porre le provette sigillate in un bagno d'acqua a 75-80 gradi Celsius per 35 minuti.

Rimuovere i flaconcini dal bagno termico e farli raffreddare a temperatura ambiente. Aggiungere quindi un millilitro di anidride acetica a ciascuno dei flaconcini reattivi da tre millilitri, chiuderli ermeticamente e vortexare accuratamente. Successivamente, una seconda incubazione in un bagno termico a 75-80 gradi Celsius per 25 minuti.

Rimuovere i vial dal bagno termico e farli raffreddare a temperatura ambiente. Per iniziare la separazione e la misurazione, aggiungere 1,5 millilitri di cloroformio in ogni tubo, quindi vortexare. Dopo aver aggiunto un millilitro di acido cloridrico uno molare in ogni vial e aver vortexato accuratamente, lasciare riposare le soluzioni indisturbate fino alla separazione delle due fasi.

Aspirare e scartare la fase acquosa superiore. Utilizzando una pipetta da 1000 microlitri nello stesso modo, estrarre la fase organica per tre volte, utilizzando però un millilitro di acqua nell'ultimo passaggio di lavaggio. Prestare particolare attenzione affinché tutta la fase acquosa superiore sia stata rimossa.

Essiccare la soluzione finale utilizzando un evaporatore rapido a 45 gradi Celsius o un flusso di gas azoto, risospendere ciascun campione in 300 microlitri di acetato di etile-esano e trasferire in vial ambrati da due millilitri con inserto di piccolo volume e tappo a vite, chiudendo ermeticamente per la quantificazione analizzata mediante cromatografia a gas con rivelatore a ionizzazione di fiamma, usando una colonna capillare in silice fusa non polare come DB-5, come indicato nel protocollo scritto. Dopo l'esecuzione e l'analisi standard, regolare la portata del gas trasportatore in modo che i derivati di acetolo glucosamina e acido mu-amico eluiscano a 250 gradi Celsius e la glutammina metil terminale eluisca a 270 gradi Celsius.

Eseguire un'iniezione split da un microlitro con rapporto 30 a 1, con l'ingresso della CG impostato a 250 gradi Celsius, utilizzando un campionatore automatico successivamente alla corsa di cromatografia gassosa. E come passo finale di questa procedura, eseguire la validazione del derivato utilizzando i metodi di cromatografia e spettrometria descritti nel protocollo scritto. Qui vengono mostrati esempi di analisi per glucosamina e acido uremico ottenuti da standard e da un campione di suolo; oltre alla glucosamina e all'acido muico, due isomeri della glucosamina osaina e della galattosammina possono essere determinati contemporaneamente mediante il metodo, basato sulla quantità accurata degli standard applicati e sui fattori di risposta di ciascuno dei due standard interni.

È possibile determinare la quantità di questi biomarcatori nei campioni di suolo. Lo standard di recupero è stato inoltre utilizzato per monitorare qualitativamente il processo di derivazione. Qui vengono mostrati gli schemi di formazione dell'acetonitrile di aldone, della glucosamina derivata e dell'acido muico.

Il numero uno rappresenta la reazione di nitrile, e il numero due rappresenta l'acetilazione. Le strutture proposte dei frammenti ionici formati in seguito all'ionizzazione elettronica sono state studiate confrontando gli spettri di massa dei campioni preparati con diverse incorporazioni isotopiche. Qui viene mostrato lo spostamento di massa dell'ione dominante del derivato acetato di nitrile di aldone della glucosamina in diversi scenari.

In questo esempio, il campione è stato preparato con agenti non marcati, nonché con anidride acetica marcata isotopicamente e glucosamina marcata isotopicamente. L'asterisco sulla struttura chimica rappresenta l'atomo con isotopo pesante o il gruppo isotopico. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di mantenere condizioni rigorosamente anidre durante la derivatizzazione.

Entrambi i solventi organici e la vetreria utilizzati in questa fase devono essere asciutti. Sebbene molti fornitori vendano solventi anidri, quelli disponibili possono essere essiccati facendoli passare attraverso colonne contenenti reagenti disidratanti come il solfato di magnesio. Dopo questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi come la spettrometria di massa con rapporto isotopico, al fine di rispondere ad ulteriori domande, ad esempio su come i macroorganismi rispondono, e su come il carbonio o l'azoto si trasformano e accumulano nei suoli distinguendo tra macroorganismi vivi e morti dopo il loro sviluppo.

Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della macroecologia e della biologia e chimica del suolo, permettendo di esplorare il contributo dei macrorganismi alla materia organica del suolo e al sequestro in sistemi terrestri naturali o gestiti.