Superare blocco nel encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) ceppi di topi resistenti dal trasferimento adottivo e uno stimolo antigenico

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di indurre l'EAE in modo coerente e semplice in qualsiasi ceppo di topo, compresi quelli ritenuti resistenti all'induzione di EAE. Ciò si ottiene immunizzando prima i topi donatori con proteine specifiche della mielina o antigeni peptidici, emulsionati in adiuvante fres completo. 10 giorni dopo, i linfonodi dei topi donatori vengono isolati e le cellule linfonodali vengono restimolate in vitro coltivandole con lo stesso antigene per quattro o cinque giorni.

Le cellule vengono quindi trasferite in modo adottivo in topi riceventi naïve. I ceppi di topo sensibili svilupperanno EAE in 8-14 giorni per innescare l'EAE in un ceppo resistente. 14 giorni dopo il trasferimento adottivo, i topi riceventi sono stati quindi immunizzati con antigene in CFA.

Utilizzando questo metodo, l'EAE può essere indotto in ceppi di topi resistenti. Il vantaggio principale del protocollo di trasferimento adattivo e di sfida per l'induzione dell'EAE è che consente un'induzione affidabile della malattia. Raramente vediamo meno del 100% di malattia clinica.

Possiamo personalizzare il protocollo per indurre la malattia e i ceppi di topo sensibili, ma soprattutto, possiamo utilizzare questo protocollo per indurre l'EAE in molti ceppi di topi precedentemente considerati resistenti alla malattia. Dimostrazione delle procedure. Oggi è il nostro principale ricercatore associato, cha ching.

Inizia preparando una soluzione di due milligrammi per millilitro di MBP. In PBS. Utilizzare una siringa di vetro smerigliato dotata di blocco esca per prelevare 100 microlitri di soluzione antigenica per topo da immunizzato.

Utilizzando una siringa separata, raccogliere un volume uguale di adiuvante di Freud completo H 37 ra. Quindi, con un rubinetto a tre vie, collegare le due siringhe e spingere gli stantuffi avanti e indietro per mescolare l'antigene e l'adiuvante fino a formare un'emulsione. Per verificare che questo sia il caso, trasferire la soluzione in una delle siringhe e scollegare quella vuota.

Tirare leggermente indietro le siringhe vuote, quindi scaricare una goccia della miscela residua in un becher di acqua pulita a temperatura ambiente. Se la goccia si disperde, ricollegare le siringhe e continuare a mescolare. Ripetere il test se la goccia rimane intatta e si è formata l'emulsione per raccogliere l'emulsione.

Per l'immunizzazione. Collegare una siringa di plastica da un millilitro alla siringa di vetro il cui stantuffo è stato rimosso. Trasferire con cautela la soluzione nella siringa di plastica, riempiendola fino al bordo.

Quindi inserire lo stantuffo di plastica ed espellere un po' di emulsione in modo che rimangano esattamente 1,2 millilitri. Non devono esserci bolle d'aria intrappolate nella siringa. Se questa procedura viene eseguita correttamente.

Scollegare la siringa di plastica. Montarlo con un ago calibro 26 e riempire il volume del vuoto dell'ago spingendo lo stantuffo fino al segno di un millilitro. Posiziona saldamente il mouse e tieni la coda tra l'anulare e il mignolo in modo che il torace e l'addome siano facilmente accessibili. Sottocute.

Iniettare 50 microlitri di emulsione nel torace proprio sopra l'ascella destra. Se l'iniezione viene eseguita correttamente, sarà visibile un piccolo rigonfiamento bianco nel sito di iniezione. Ripeti la procedura sopra l'ascella sinistra, quindi rilascia la coda e afferra il piede destro, esponendo il fianco destro del topo.

Iniettare 50 microlitri di soluzione appena sotto la gabbia toracica. Lascia andare il piede destro. Giri il mouse dall'altra parte e ripeta l'iniezione sul lato sinistro.

Da sette a 10 giorni dopo l'immunizzazione. Raccogliere i linfonodi dagli animali soppressi. Per prima cosa posiziona il topo sulla schiena con gli arti distesi e fissati alla tavola di dissezione con degli spilli.

Spruzza il mouse con etanolo. Quindi utilizzando strumenti sterili. Incidere un'incisione longitudinale nella pelle del topo dal basso addome fino al mento.

Fai un'altra incisione dall'addome lungo una gamba. Poi giù l'altro. Staccare la pelle dal topo e fissarla alla tavola di dissezione.

Taglia anche la pelle lungo i quattro arti. Quindi staccare e fissare la parte superiore dei lembi cutanei con spilli su entrambi i lati, i linfonodi inguinali e ascellari, che normalmente sono vicini all'inguine o alle ascelle, dovrebbero essere visibili come piccole masse opache direttamente sotto la pelle. Usa due pinze sottili per rimuovere delicatamente il tessuto connettivo sopra il primo linfonodo.

Facendo attenzione a non interrompere i vasi sanguigni durante il processo. Una volta che il tessuto connettivo è stato liberato, posiziona un paio di pinze sotto il linfonodo ed estrailo dal corpo. Trasferire il linfonodo in una capsula di Petri da 35 millimetri contenente PBS sterile e raccogliere gli altri tre linfonodi allo stesso modo.

Una volta prelevati tutti i linfonodi, trasferire la capsula di Petri in una cappa di biosicurezza. Utilizzando il retro di uno stantuffo per siringa sterile. Omogeneizzare i linfonodi per liberare le cellule per rimuovere i detriti, filtrare la sospensione attraverso una rete di nylon in un tubo conico.

Quindi regolare il volume a 50 millilitri con PBS sterile e centrifugare le cellule per 10 minuti. Dopo la centrifugazione, risospendere le cellule in un piccolo volume di terreno di coltura cellulare preriscaldato e contare le cellule vitali. Regolare la concentrazione a quattro volte 10 per sei cellule per millilitro.

Quindi piastrate le cellule a due millilitri per pozzetto in una piastra a 24 pozzetti. Aggiungere l'antigene MVP in ogni pozzetto in modo da ottenere una concentrazione finale di 100 microgrammi per millilitro. Una volta aggiunto l'antigene.

Incubare le cellule a 37 gradi Celsius per cinque giorni. Una volta che le cellule sono state restimolate, raccoglierle pipettandole delicatamente su e giù e trasferirle in una provetta conica da 50 millilitri. Centrifugare le celle a 1000 giri/min per 10 minuti e risospendere il pellet in un piccolo volume di PBS sterile.

Quindi contare le cellule e regolare la concentrazione di cellule vitali a 2,5 volte 10 all'ottava cellula per millilitro con PBS. Aspirare le cellule in una siringa e inserirla con un ago calibro 26 per eseguire il trasferimento adottivo. Iniettare 0,2 millilitri di cellule per via endovenosa nella coda di ciascun topo per sfidare i topi resistenti a settimane dopo il trasferimento adottivo.

Iniettare negli animali 200 microgrammi di antigene in un volume di 200 microlitri di emulsione nello stesso modo in cui è stata eseguita l'immunizzazione dei topi donatori. Da sette a 10 giorni dopo la sfida, si svilupperà la malattia paralitica e la sua progressione potrà essere monitorata. La malattia inizia con la debolezza della coda.

Quando la coda è flaccida, la malattia è classificata, una malattia è classificata. Due, se il topo sviluppa la paralisi in un arto posteriore, e tre, se entrambi gli arti posteriori sono paralizzati. Il quarto grado è quando entrambi gli arti anteriori sono paralizzati.

Grado quinto, il topo è più abbondante. E al sesto grado, il topo è morto. Come mostrato qui, da sette a 14 giorni dopo la provocazione, i topi svilupperanno una malattia paralitica monofasica, che può essere classificata utilizzando i classici criteri EAE.

Sebbene i topi possano riprendersi, non avranno una ricaduta spontanea. L'induzione della malattia richiede una sfida antigene-specifica. La sfida con il CFA da solo o con un antigene irrilevante non riesce a provocare la malattia.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione del trasferimento adottivo e del metodo di sfida per indurre l'EAE. Combinando il trasferimento adattivo di cellule linfonodali antigene specifiche con una sfida antigenica potenziante, si può facilmente indurre EAE in qualsiasi ceppo di topo. Questo metodo ci permette di superare i meccanismi di resistenza insiti in alcuni ceppi di topo, e quindi permette lo studio della resistenza alle malattie. Anche.

Questa tecnica dovrebbe essere facilmente adattata per studiare qualsiasi processo di malattia autoimmune.