Superare blocco nel encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) ceppi di topi resistenti dal trasferimento adottivo e uno stimolo antigenico

L'obiettivo generale di questa procedura è indurre in modo costante e semplice l'EAE in qualsiasi ceppo di topo, inclusi quelli considerati resistenti all'induzione dell'EAE. Questo risultato si ottiene innanzitutto immunizzando topi donatori con proteine specifiche della mielina o antigeni peptidici, emulsionati in adiuvante completo di Freund. Dieci giorni dopo, i linfonodi dei topi donatori vengono isolati e le cellule linfonodali vengono nuovamente stimolate in vitro coltivandole con lo stesso antigene per quattro o cinque giorni.

Le cellule vengono quindi trasferite in modo adottivo in topi riceventi naïve. I ceppi di topi suscettibili svilupperanno EAE in otto-quattordici giorni per indurre EAE in un ceppo resistente. Quattordici giorni dopo il trasferimento adottivo, i topi riceventi sono stati immunizzati con l'antigene in CFA.

Utilizzando questo metodo, l'EAE può essere indotta in ceppi di topi resistenti. Il vantaggio principale del protocollo di trasferimento adattativo e sfida per l'induzione dell'EAE è che consente un'induzione affidabile della malattia. Raramente osserviamo una malattia clinica inferiore al 100%.

È possibile adattare il protocollo per indurre la malattia in ceppi murini suscettibili, ma, cosa ancora più importante, possiamo utilizzare questo protocollo per indurre l'EAE in numerosi ceppi murini precedentemente considerati resistenti alla malattia. Dimostrazione delle procedure. Oggi il nostro ricercatore principale è cha ching.

Iniziare preparando una soluzione di MBP a due milligrammi per millilitro in PBS. Utilizzare una siringa in vetro macinato dotata di blocco a baionetta per aspirare 100 microlitri di soluzione antigene per ogni topo da immunizzare.

Utilizzando una siringa separata, prelevare un volume uguale di adiuvante completo di Freund H 37 ra. Quindi, mediante un rubinetto a tre vie, collegare le due siringhe e spingere avanti e indietro gli stantuffi per mescolare l'antigene e l'adiuvante fino a formare un'emulsione. Per verificare che ciò sia avvenuto, trasferire la soluzione in una delle siringhe e scollegare quella vuota.

Riportare leggermente indietro lo stantuffo delle siringhe vuote, quindi rilasciare una goccia della miscela residua in un becher contenente acqua pulita a temperatura ambiente. Se la goccia si disperde, ricollegare le siringhe e continuare a mescolare. Ripetere la prova se la goccia rimane integra e si è formata un'emulsione, per raccogliere l'emulsione.

Per l'immunizzazione. Collegare una siringa di plastica da un millilitro alla siringa di vetro dalla quale è stato rimosso lo stantuffo. Trasferire con attenzione la soluzione nella siringa di plastica, riempiendola fino al bordo.

Inserire quindi lo stantuffo di plastica ed espellere parte dell'emulsione in modo che ne rimangano esattamente 1,2 millilitri. Non devono essere presenti bolle d'aria nella siringa. Se questa procedura viene eseguita correttamente.

Scollegare la siringa di plastica. Applicarvi un ago da 26 gauge e riempire il volume morto dell'ago spingendo lo stantuffo fino al segno di un millilitro. Afferrare saldamente il mantello del topo e tenere la coda indietro tra l'anulare e il mignolo in modo che torace e addome siano facilmente accessibili. Per via sottocutanea.

Iniettare 50 microlitri di emulsione nel torace subito sopra l’ascella destra. Se l’iniezione viene eseguita correttamente, sarà visibile un piccolo rigonfiamento bianco nel sito di iniezione. Ripetere la procedura sopra l’ascella sinistra, quindi rilasciare la coda e afferrare la zampa destra, esponendo il fianco destro del topo.

Iniettare 50 microlitri di soluzione appena sotto la gabbia toracica. Lasciare il piede destro. Ruotare il topo nel verso opposto e ripetere l'iniezione sul lato sinistro.

Da sette a 10 giorni dopo l'immunizzazione, prelevare i linfonodi dagli animali sacrificati. Posizionare innanzitutto il topo supino, con gli arti distesi e fissati al tavolo di dissezione mediante spilli.

Spruzzare l'etanolo sul topo. Quindi, utilizzando strumenti sterili, praticare un'incisione longitudinale sulla pelle del topo, partendo dall'addome inferiore fino al mento.

Eseguire un'altra incisione dall'addome lungo una gamba, quindi lungo l'altra. Staccare la pelle dal topo e fissarla al tavolo da dissezione.

Tagliare anche la pelle lungo le quattro membra. Poi staccare e fissare con spilli la parte superiore delle lembi di pelle su entrambi i lati; i linfonodi inguinali e ascellari, che normalmente si trovano vicino all'inguine o alle ascelle, dovrebbero essere visibili come piccole masse opache direttamente sotto la pelle. Utilizzare due pinzette fini per rimuovere delicatamente il tessuto connettivo sovrastante il primo linfonodo.

Avendo cura di non danneggiare i vasi sanguigni nel corso dell'operazione. Una volta rimosso il tessuto connettivo, posizionare una pinzetta sotto il linfonodo e staccarlo dal corpo. Trasferire il linfonodo in una piastra di Petri da 35 millimetri contenente PBS sterile e raccogliere gli altri tre linfonodi nello stesso modo.

Dopo aver prelevato tutti i linfonodi, trasferire la piastra di Petri in una cappa a sicurezza biologica. Utilizzando la parte posteriore dello stantuffo di una siringa sterile, omogeneizzare i linfonodi per liberare le cellule; per rimuovere i detriti, filtrare la sospensione attraverso una maglia di nylon in un tubo conico.

Quindi portare il volume a 50 millilitri con PBS sterile e centrifugare le cellule per 10 minuti. Al termine della centrifugazione, risospendere le cellule in un piccolo volume di mezzo di coltura cellulare preriscaldato e contare le cellule vitali. Regolare la concentrazione a quattro volte 10 alla sesta cellule per millilitro.

Quindi si seminano le cellule in quantità di due millilitri per pozzetto in una piastra a 24 pozzetti. Si aggiunge l'antigene MVP in ogni pozzetto in modo da ottenere una concentrazione finale di 100 microgrammi per millilitro. Una volta aggiunto l'antigene.

Incubare le cellule a 37 gradi Celsius per cinque giorni. Una volta che le cellule sono state ri-stimolate, raccoglierle pipettando delicatamente su e giù e trasferirle in un tubo conico da 50 millilitri. Centrifugare le cellule a 1000 giri al minuto per 10 minuti e risospendere il pellet in un piccolo volume di PBS sterile.

Quindi conta le cellule e regola la concentrazione delle cellule vitali a 2,5 × 10⁸ cellule per millilitro con PBS. Aspira le cellule in una siringa e applica un ago da 26 gauge per eseguire il trasferimento adottivo. Inietta 0,2 millilitri di cellule per via endovenosa nella coda di ciascun topo per sottoporre i topi resistenti a una sfida a settimane di distanza dal trasferimento adottivo.

Iniettare negli animali 200 microgrammi di antigene in un volume di 200 microlitri di emulsione, nello stesso modo in cui è stata eseguita l'immunizzazione nei topi donatori. Da sette a dieci giorni dopo la sfida, si svilupperà una malattia paralitica che potrà essere monitorata. La malattia inizia con un'indebolimento della coda.

Quando la coda è flaccida, la malattia viene classificata al grado uno. Due, se il topo sviluppa paralisi in un arto posteriore, e tre, se entrambi gli arti posteriori sono paralizzati. Il grado quattro si verifica quando entrambi gli arti anteriori sono paralizzati.

Grado cinque, il topo è più abbondante. E grado sei, il topo è morto. Come mostrato qui, da sette a quattordici giorni dopo la sfida, i topi svilupperanno una malattia paralitica monofasica, che può essere valutata utilizzando i criteri classici di EAE.

Sebbene i topi possano riprendersi, non andranno incontro a una ricaduta spontanea. L'induzione della malattia richiede una sfida specifica per l'antigene. La sfida con CFA da solo o con un antigene irrilevante non induce la malattia.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione del metodo di trasferimento adottivo e di sfida per indurre l'EAE. Combinando il trasferimento adattivo di cellule dei linfonodi specifiche per l'antigene con una sfida antigenica di richiamo, è possibile indurre facilmente l'EAE in qualsiasi ceppo di topo. Questo metodo ci permette di superare i meccanismi di resistenza intrinseci in alcuni ceppi di topi, consentendo quindi lo studio della resistenza alla malattia. Inoltre.

Questa tecnica dovrebbe essere facilmente adattabile per lo studio di qualsiasi processo patologico autoimmune.