Semplici dispositivi microfluidici per In vivo Imaging di C. elegans, Drosophila E Zebrafish
30 settembre 2012
Un semplice dispositivo microfluidico è stato sviluppato per eseguire anestetico libera In vivo Imaging C. elegans, Intatto Drosophila Larve e larve di zebrafish. Il dispositivo utilizza una membrana deformabile PDMS per immobilizzare questi organismi modello per eseguire lapse imaging tempo di numerosi processi come il battito cardiaco, la divisione cellulare e subcellulare trasporto neuronale. Abbiamo illustrato l'utilizzo di questo dispositivo e mostrano esempi di diversi tipi di dati ra
Ciao, sono Shamal, ricercatore postdottorato con TUR Kika presso il National Center for Biological Sciences India. In questo video vi mostrerò come realizzare un dispositivo microbico mediante tecniche di litografia morbida in un ambiente da laboratorio comune. Userò questi dispositivi per l'analisi ad alta risoluzione, cellulare e subcellulare, di organismi modello genetici.
Il protocollo attuale permetterà ai ricercatori di eseguire questa acquisizione di immagini in intervalli di tempo in organismi intatti privi di anestetico. Cominciamo dunque. Abbiamo sviluppato un semplice dispositivo microfonico per effettuare acquisizioni in vivo senza anestetico di organismi modello genetici come *C. elegans*, *Oph* intatto e zebrafish.
In questo studio, dimostriamo un dispositivo per la mobilizzazione chiara basato su membrane, realizzato mediante stampaggio morbido di PDMS. Per immobilizzare un singolo organismo, posizioniamo un animale singolo sotto un microscopio stereoscopico e lo preleviamo utilizzando una piccola goccia di soluzione tampone mediante una micropipetta, inseriamo l'animale singolo nel canale di flusso e lo immobilizziamo sotto la membrana in PTMS. Utilizzando una connessione di gas azoto pressurizzato attraverso una valvola a sfera a tre vie.
Progettare le microstrutture fredic utilizzando un software di pulizia. Pulire le fette di silicio di due centimetri per due centimetri in KH al 20% per un minuto e risciacquare con acqua deionizzata. Asciugare le fette con gas azoto e disidratare a 122 °C per quattro ore.
Centrifugare l'Hexa Metal Spinco su pezzi di silicio a 500 giri al minuto per cinque secondi e a 3000 giri al minuto per 30 secondi. Centrifugare il SU 8 2 0 2 5 Spinco su wafer di silicio a 500 giri al minuto per cinque secondi e a 2000 giri al minuto per 30 secondi. Effettuare una cottura soft dei pezzi di silicio rivestiti a 65 gradi Celsius per un minuto e a 95 gradi Celsius per 10 minuti.
Esponi le otto fette rivestite con SU cotto a una lampada UV da 200 watt attraverso la maschera fotografica per il design uno e il design due, rispettivamente per il livello di flusso e il livello di controllo. Effettua la cottura post-esposizione delle fette a 65 gradi Celsius per un minuto e a 95 gradi Celsius per 10 minuti. Sviluppa i pezzi utilizzando la soluzione sviluppatrice SUA per 20 minuti.
Codificare i pezzi con vapore di tricloro perfluorocetilene in un essiccatore per due ore. Mescolare la base di polidil xox e l'agente indurente in rapporto 10 a 1 in peso. Depurare la miscela per rimuovere tutte le bolle d'aria formatesi durante il mescolamento.
Versare una miscela di PDMS di spessore di cinque millimetri su wafer di silicio con il disegno del modello di peso SC. Agitare delicatamente per evitare la formazione di bolle d'aria. Applicare un rivestimento uniforme di PDMS sui wafer di silicio con il disegno progettato per lo strato di flusso mediante centrifugazione a 500 giri al minuto per cinque secondi e a 1500 giri al minuto per 30 secondi.
Incubare entrambi i pezzi del design uno e del design due contenenti PDMS a 50 gradi Celsius per sei ore. Ritagliare il pezzo di PDMS dal substrato di silicio utilizzando una lama sottile contenente il pattern SCH due. Praticare un foro piccolo sulla parte superiore del serbatoio, collegandolo alla trappola principale nello stampo in PDMS.
Utilizzando un ago con punta massima o di calibro 18. Esporre la superficie inferiore dello strato di controllo e la superficie superiore dello strato di flusso a un plasma d'aria a 18 watt per due minuti. Unire le due superfici trattate con il plasma applicando una leggera pressione e cuocerle a 50 gradi Celsius per due ore.
Ritagliare i dispositivi legati dal substrato di silicio con il design SUH uno e perforare fori di accesso nei serbatoi di ingresso e uscita del canale di flusso. Esporre il lato inferiore del PD del dispositivo e un vetro di copertura pulito. Sottoporre a plasma d'aria a 18 volt per due minuti.
Posizionare le due superfici trattate al plasma con una leggera pressione e cuocere a 50 gradi per due ore. Conservare il dispositivo in un ambiente pulito per un uso futuro. Dopo la fabbricazione dei dispositivi, vi mostrerò come utilizzare la membrana in PDMS per immobilizzare C. elegans nel dispositivo. Collegare un'estremità di un tubo microflex a un regolatore di alimentazione di gas azoto sotto pressione e l'altra estremità al serbatoio principale del trappolatore attraverso un ago da 18 gauge.
Un rubinetto a tre vie posizionato nel collegamento del tubo permette di applicare o rilasciare la pressione sulla membrana. Riempire il tubo e collegarlo al dispositivo in PDMS con una colonna di 10 centimetri di acqua distillata prima di connetterlo alla riserva della trappola principale. Ruotare la valvola della fornitura di azoto fino a leggere una pressione di PSI proteica e osservare, a bassa ingrandimento al microscopio invertito, la membrana della trappola principale deflettere verso il canale di flusso.
Quindi rilasciare il rubinetto a tre vie e riportare la membrana in posizione di riposo. Riempire il canale di flusso con tampone per 10 minuti. Prima di un esperimento, localizzare un singolo esemplare di sea elegance utilizzando un microscopio con obiettivo a basso ingrandimento.
Prelevare un singolo animale utilizzando un piccolo volume di soluzione tampone in una punta micro. Spingere l'individuo attraverso l'ingresso del canale di flusso. Regolare la pressione della pipetta per posizionare l'animale singolo sotto la trappola principale.
Aumentare lentamente la pressione della membrana in PDMS per posizionare l'animale contro il bordo del canale e immobilizzarlo con una pressione compresa tra 7 e 14 PSI. Utilizzare un microscopio invertito impostato sulla configurazione desiderata per l'acquisizione ad alta risoluzione in campo chiaro o in fluorescenza. Acquisire singole immagini in fluorescenza o immagini temporizzate con una frequenza di acquisizione predefinita.
Rilasciare la pressione della trappola e monitorare il comportamento locomotorio dell'animale. Per cinque minuti a bassa ingrandimento, lavare l'animale e inserire un animale nuovo. Per ripetere i passaggi di DevOp, utilizzare la punta della micropipetta tagliata per prelevare una singola larva oph e inserirla nel dispositivo microferro di dimensioni maggiori.
Spingere la singola larva attraverso l'ingresso del canale di flusso. Aumentare lentamente la pressione della membrana in PDMS e immobilizzarla con sette pressioni ESI. Utilizzare un microscopio invertito per l'acquisizione di immagini in fluorescenza a basso ingrandimento ed eseguire acquisizioni temporali di immagini in fluorescenza per l'analisi del trasporto.
Rilasciare la pressione della trappia e monitorare il comportamento locomotorio della larva a basso ingrandimento. Utilizzare lo stesso principio del dispositivo per immobilizzare e acquisire immagini a intervalli di pesci zebrafish di 30 ore post-fecondazione. Cuore val.
Dopo aver visto questo video, dovreste essere in grado di realizzare dispositivi microscopici simili nel vostro laboratorio e di utilizzarli con successo per immobilizzare organismi in esperimenti straordinari ad alta risoluzione. Grazie per aver guardato il video e buona fortuna per i vostri esperimenti.
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Panoramica
È stato sviluppato un semplice dispositivo microfluidico per l'acquisizione di immagini in vivo, senza anestetici, di C. elegans, larve di Drosophila integre e larve di pesce zebra. Questo dispositivo utilizza una membrana in PDMS deformabile per immobilizzare questi organismi durante l'acquisizione di immagini a intervalli di tempo per lo studio di diversi processi biologici.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia
- Microidraulica
Sfondo
- L'imaging in vivo è fondamentale per lo studio di organismi viventi.
- L'imaging tradizionale richiede spesso anestetici, che possono influenzare i processi biologici.
- I dispositivi microfluidici offrono un metodo per studiare organismi senza l'uso di anestetici.
- Organismi modello come C. elegans e Drosophila sono ampiamente utilizzati nella ricerca.
Scopo dello studio
- Sviluppare un dispositivo microfluidico per l'acquisizione di immagini senza anestetici.
- Permettere l'acquisizione di immagini in time-lapse di processi biologici in organismi viventi.
- Dimostrare l'applicazione del dispositivo in diversi sistemi modello.
Metodi Utilizzati
- Realizzazione di un dispositivo microfluidico mediante tecniche di litografia morbida.
- Utilizzo di una membrana deformabile in PDMS per l'immobilizzazione degli organismi.
- Acquisizione di immagini a intervalli temporali di battiti cardiaci, divisione cellulare e trasporto neuronale.
- Applicazione su C. elegans, larve di Drosophila e larve di pesce zebra.
Risultati principali
- Imaging riuscita di diversi processi biologici senza l'uso di anestetici.
- Versatilità dimostrata del dispositivo su diversi organismi modello.
- Raccolti dati su battiti cardiaci, divisione cellulare e trasporto neuronale.
- Messo in evidenza il potenziale dell'imaging ad alta risoluzione su campioni vivi.
Conclusioni
- Il dispositivo microfluidico consente un'analisi in vivo dettagliata.
- Apre nuove prospettive per la ricerca negli studi su organismi viventi.
- L'approccio può migliorare la nostra comprensione dei processi biologici.
Domande Frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Dispositivi microfluidici per l'immobilizzazione in vivo L'imaging di C. elegans, Drosophila e zebrafish consente studi ad alta risoluzione, senza l'uso di anestetici, di processi cellulari e subcellulari. Questa capacità soddisfa un'esigenza fondamentale di dati fisiologicamente rilevanti nei flussi di lavoro della scoperta precoce e della validazione di target. L'approccio aumenta l'affidabilità predittiva e riduce l'ambiguità biologica in punti critici del percorso di scoperta.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Permette l'osservazione diretta del trasporto neuronale, della dinamica delle vescicole sinaptiche e della divisione cellulare in organismi modello integri.
- Supporta la validazione funzionale degli obiettivi preservando gli stati fisiologici nativi durante l'imaging.
- Facilita la riduzione dei rischi meccanicistici eliminando gli artefatti indotti dagli anestetici nei dati di imaging in tempo reale.
- Migliora l'affidabilità predittiva per le ipotesi biologiche successive e per la selezione del portafoglio.
Sviluppo di screening e saggi
- Fornisce un'immobilizzazione standardizzata per saggi di imaging in differita quantitativi e riproducibili.
- Consente lo screening ad alto contenuto di trasporto cellulare e di eventi dello sviluppo in diversi contesti genetici.
- Supporta la scalabilità del saggio e il riutilizzo della piattaforma nei modelli di C. elegans, Drosophila e pesce zebra.
- Garantisce letture affidabili e prive di artefatti per studi di perturbazione chimica o genetica.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Si allinea a sistemi rilevanti per le malattie consentendo l'imaging in modelli genetici ampiamente utilizzati.
- Mantiene la continuità traslazionale dalla scoperta alla validazione preclinica supportando endpoint fisiologicamente rilevanti.
- Riduce il rischio di falsi positivi/negativi dovuti agli effetti degli anestetici sui processi neuronali o dello sviluppo.
- Facilita decisioni di avanzamento basate sulla valutazione del rischio, fondate su dati robusti ottenuti da animali vivi.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo metodo di immobilizzazione microfluidico si integra nel percorso di scoperta, dall'analisi iniziale delle ipotesi fino all'identificazione dei composti promettenti e alla validazione preclinica.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi mediante l'osservazione in tempo reale di eventi cellulari in organismi viventi.
- Screening: Garantisce prontezza e riproducibilità del saggio per schermate basate su imaging quantitativo.
- Analisi: Fornisce misurazioni ad alta risoluzione e a intervalli di tempo di trasporto, divisione e attività fisiologica per analisi comparativa.
- Ricerca traslazionale: Collega i risultati della scoperta a modelli preclinici utilizzando organismi geneticamente conservati.
- Riutilizzo aziendale: Offre una piattaforma riutilizzabile adattabile a diversi sistemi modello e domande sperimentali.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nella validazione del bersaglio.
- Valore operativo: Standardizza le procedure di immobilizzazione e di imaging per garantire riproducibilità e scalabilità.
- Valore strategico: Permette decisioni più accurate di avanzamento o interruzione e una maggiore efficienza nell'uso del capitale fornendo dati privi di artefatti.
- Impatto sul portafoglio: Favorisce la priorizzazione e la progressione di asset nella fase di scoperta, adeguata al livello di rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella fabbricazione di dispositivi microfluidici e nelle tecniche di litografia morbida.
- Necessita dell'accesso a microscopia a fluorescenza invertita e a strumentazione per il controllo della pressione.
- Richiede una standardizzazione tra gruppi diversi per quanto riguarda le dimensioni del dispositivo e i protocolli di acquisizione delle immagini.
- Adattabile a C. elegans, Drosophila e pesce zebra con modifiche alle dimensioni del dispositivo.
- Limitato a organismi con diametri ridotti e tessuti otticamente accessibili, come indicato dallo studio.
