Cella di misura singola di rilascio di dopamina con simultanea di tensione-clamp e Amperometria

Lo scopo di questa procedura è misurare il trasporto inverso della dopamina in un neurone che è bloccato in tensione utilizzando simultaneamente patch clamp e pirometria per misurare il rilascio di D mediato da DAT. Ciò si ottiene testando prima l'integrità dell'elettrodo pirometrico con dopamina. Il secondo passo consiste nel posizionare l'elettrodo pirometrico vicino alla cellula e ottenere un patch dell'intera cellula del neurone con una pipetta patch.

Successivamente, la tensione della cella viene controllata con la pipetta patch e la dopamina mediata da DAT rilasciata dalla cella viene registrata contemporaneamente con un elettrodo pirometrico. Il passaggio finale consiste nell'aggiungere il bloccante DAT e registrare nuovamente l'intera cella e le correnti di pirometria per consentire la sottrazione della corrente specificamente mediata dal trasportatore della dopamina. Il significato di questa tecnica è la capacità di misurare il trasporto inverso della dopamina attraverso il trasportatore della dopamina, controllando contemporaneamente la tensione del neurone dopaminergico.

Il sistema di registrazione simultanea del patch clamp e della barometria richiede un microscopio invertito con un'eccellente ottica DIC e una lente a lunga distanza di lavoro per generare una sorgente di luce CC per il sistema. Con un basso rumore elettrico, collegare il faro del microscopio a una batteria dell'auto. I micro manipolatori idraulici vengono utilizzati perché non contribuiscono in modo apprezzabile ai livelli di rumore nella nostra configurazione.

Un manipolatore destrorso viene utilizzato per la pinza di tensione, la registrazione di intere celle e il manipolatore sinistrorso per la pirometria. Per preparare l'elettrodo per la registrazione all'ingrosso, estrarre una pipetta di quarzo con un estrattore P 2000. In genere, utilizziamo una pipetta con una resistenza di tre o quattro mega ohm.

Quindi, riempire l'elettrodo con la soluzione della pipetta contenente un millimolare di dopamina. Quindi montarlo sul portapipetta sul manipolatore destro. Assicurati di avvolgere il contenitore che contiene la soluzione per pipette contenente dopamina con un foglio di alluminio e di tenerlo in ghiaccio quando non è in uso.

Poiché la dopamina è ossidabile, mantenere la soluzione sul ghiaccio e al riparo dalla luce diminuirà il tasso di ossidazione. Infilare il filo d'argento nel portaelettrodo, quindi infilare l'adattatore parametrico am sul portaelettrodo. Quindi, riempire l'elettrodo tric con una quantità di mercurio sufficiente a entrare in contatto con il filo d'argento.

Quando l'elettrodo è montato sull'adattatore, assicurarsi di ispezionare al microscopio la fibra di carbonio a basso rumore pro CFE e l'elettrodo parametrico per assicurarsi che la punta sia pulita e intatta. Assicurati di tenere l'estremità più lontana della fibra di carbonio per proteggere la punta della fibra di carbonio da eventuali danni. Quindi montare l'elettrodo pro CFE Tric.

Successivamente montare l'elettrodo assemblato sul manipolatore idraulico sinistro per esaminare l'integrità dell'elettrodo tric. Immergerlo in una capsula di Petri con fondo di vetro contenente la soluzione esterna. Registrare la corrente di base in assenza di dopamina.

Quindi aggiungere 10 microlitri di una soluzione di dopamina da un millimolare al piatto. Un buon elettrodo emper metrico dovrebbe registrare un aumento della corrente ossidativa. Assicurarsi di controllare l'integrità dell'elettrodo metrico emper prima e dopo gli esperimenti.

In questa procedura, recuperare i neuroni della dopamina o le cellule ingegnerizzate per esprimere il trasportatore della dopamina posto nella capsula di Petri con fondo di vetro dall'incubatore. Lavare delicatamente le cellule o i neuroni della dopamina tre volte con una soluzione esterna calda. Per visualizzare le cellule ed eseguire l'esperimento, montare la capsula di Petri con fondo di vetro sul tavolino del microscopio e trovare il punto focale corretto per visualizzare chiaramente le cellule.

Quindi, applicare una pressione positiva all'elettrodo patch. Utilizzando una siringa da un millilitro, portare delicatamente entrambi gli elettrodi nella soluzione e avvicinare la cella con i micromanipolatori. Quindi posizionare l'elettrodo metrico emper sul lato sinistro della cella e l'elettrodo patch sul lato destro.

Quando l'elettrodo patch tocca la cella. Applicare una leggera aspirazione per bocca o siringa per formare una giga tenuta sulla cella. Successivamente, rompere il sigillo con l'aspirazione per ottenere la configurazione dell'intera cellula e attendere da cinque a otto minuti per la dialisi della soluzione interna contenente dopamina nella cellula.

Quindi registrare le correnti mediate da DAT aumentando la tensione della membrana cellulare tra meno 60 e più 100 millivolt da un potenziale di mantenimento di meno 40 millivolt attraverso la pipetta. Per determinare il flx di dopamina mediato da DAT specifico, registrare le correnti metriche emper in assenza e presenza di un antagonista DAT. La corrente tric specificata mediata da DAT viene quindi determinata sottraendo le tracce registrate in presenza di antagonista DAT dalle tracce emper registrate senza l'antagonista.

Una deflessione verso l'alto delle correnti trichettiche corrisponde a un flusso di dopamina verso l'esterno mostrato qui. A correnti mediate da DAT registrate aumentando la tensione di membrana di 20 millivolt tra meno 60 e più 100 millivolt da un potenziale di mantenimento di meno quattro millivolt C con la pipetta contenente due dopamina millimolare nella modalità di patching dell'intera cellula. Ecco la corrente metrica Emper acquisita contemporaneamente alla corrente dell'intera cella.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come misurare il trasporto inverso della dopamina attraverso il trasportatore della dopamina in un neurone con tensione bloccata. Ricordarsi di controllare l'integrità dell'elettrodo parametrico prima e dopo gli esperimenti, e non dimenticare di sottrarre le tracce registrate in presenza di quell'antagonista dalle tracce tric registrate senza l'antagonista.