Name: Cella di misura singola di rilascio di dopamina con simultanea di tensione-clamp e Amperometria (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 30 s
Description: Impara a misurare il trasporto inverso di dopamina in neuroni con patch clamp e piroamperometria simultanei. Questa tecnica consente di registrare il rilascio mediato dal DAT controllando il potenziale di membrana.

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Ringraziamo il Dott. Sanika Chirwa per la revisione critica di questo manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health (DA026947, DA021471 e NS071122).

1. Attrezzature e Forniture <ol><li> Montare una gabbia di Faraday sopra il tavolo antivibrazione (TMI) per diminuire il rumore di fondo. </li><li> La simultanea patch clamp sistema amperometria di controllo richiede un microscopio invertito con eccellenti ottiche DIC e una lente lunga distanza di lavoro. Collegare il microscopio faro di una batteria per auto. Questa sorgente luminosa DC per il sistema diminuirà ulteriormente il rumore elettrico. </li><li> Micromanipolatori idraulici (Siskiyou) ulteriore riduzione del rumore. Nella nostra configurazione, utilizziamo un manipolatore di mano destra per la registrazione cellula intera, e la sinistra ha consegnato per amperometria. </li></ol> 2. Preparare Elettrodi di registrazione <ol><li> Tirare elettrodi di patch utilizzando pipette quarzo su un P-2000 estrattore (Sutter). La trazione dura circa 5 secondi, con due cicli termici. Questa volta il calore ha portato a resistenza costante (3-4 MW) nei nostri pipette patch di cellule intere. </li><li> Riempire l&#39;elettrodo con l&#39;Aggiunta della soluzione contenente 2 mM dopamina e montarlo sul manipolatore destro. Avvolgere il contenitore che contiene la soluzione di pipetta contenente DA con un foglio di alluminio. Tenere su ghiaccio. La dopamina è ossidabile. Mantenendo la soluzione in ghiaccio, protetto dalla luce diminuirà il livello di ossidazione della dopamina. </li><li> Rimuovere delicatamente un (Dagan) ProCFE basso tenore di carbonio elettrodo amperometrico rumore fibra dal contenitore, riempire con il mercurio, per montaggio su scheda amperometrica (come illustrato nella figura 1), e poi montare sulla maniupulator destra. Proteggere la punta della fibra di carbonio da danni tenendo l&#39;estremità della fibra di carbonio. Ispezionare l&#39;elettrodo con un microscopio di laboratorio per garantire la punta è pulito e intatto. </li><li> Esaminare l&#39;integrità del elettrodo amperometrico ponendo l&#39;elettrodo in una capsula di Petri di vetro inferiore contenente soluzione esterna. Registrare una corrente di base in assenza di dopamina. Aggiungere 10 ml di una soluzione 1 mM DA al piatto. Un re buon elettrodo amperometricocavi di un aumento nella corrente ossidativo. Ripetere questo passo all&#39;inizio e alla fine di ciascun esperimento per rendere certa la elettrodo amperometrico funziona correttamente. </li></ol> 3. Preparare la coltura primaria neuronale dei neuroni dopaminergici o di cellule ingegnerizzate per esprimere il vettore della dopamina di stoviglie fondo di vetro Petri <ol><li> Lavare delicatamente le cellule o neuroni dopaminergici tre volte con soluzione esterna calda. </li><li> Montare il fondo piatto di vetro Petri sul palco microscopio. </li></ol> 4. Visualizza cellulare ed esecuzione Experiment <ol><li> Trova il punto focale corretta di visualizzare chiaramente le cellule. Posizionare pressione positiva sull&#39;elettrodo patch. Poi, delicatamente portare entrambi gli elettrodi giù nella soluzione, e vicino alla cella. </li><li> Posizionare l&#39;elettrodo amperometrico accanto alla cella (a sinistra), e l&#39;elettrodo cerotto sulla destra. </li><li> Realizzare un sigillo gigaohm sulla cella con l&#39;elettrodo patch. La rottura del sigillo mediante aspirazioneottenere la configurazione a cellula intera. </li><li> Consentire 5-8 min per dialisi della soluzione interna contenente dopamina nella cella. </li><li> Utilizzare desiderato gradino di tensione o protocollo rampa. Acquisire simultaneamente i dati sia la pipetta patch e l&#39;elettrodo amperometrico per la misura di correnti a cellule intere e invertire trasporto di dopamina attraverso il trasportatore della dopamina, mentre il potenziale di membrana è controllata tramite la pipetta patch. </li></ol>

<ol><li>Michael, A. C., Ikeda, M., Justice, J. B. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+contributing+to+the+recovery+of+striatal+releasable+dopamine+following+MFB+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Mechanisms contributing to the recovery of striatal releasable dopamine following MFB stimulation.</a> Brain Res. 421, 325-335 (1987).</li>
<li>Gonon, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+and+extrasynaptic+excitatory+action+of+dopamine+mediated+by+D1+receptors+in+the+rat+striatum+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Prolonged and extrasynaptic excitatory action of dopamine mediated by D1 receptors in the rat striatum in vivo.</a> J. Neurosci. 17, 5972-5978 (1997).</li>
<li>Sulzer, D., Pothos, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+quantal+size+by+presynaptic+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Regulation of quantal size by presynaptic mechanisms.</a> Rev. Neurosci. 11, 159-212 (2000).</li>
<li>Napolitano, A., Cesura, A. M., Da Prada, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+monoamine+oxidase+and+catechol+O-methyltransferase+in+dopaminergic+neurotransmission%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neural.+Transm.+Suppl%22%5BJournal%5D)">The role of monoamine oxidase and catechol O-methyltransferase in dopaminergic neurotransmission.</a> J. Neural. Transm. Suppl. 45, 35-45 (1995).</li>
<li>Sulzer, D., Maidment, N. T., Rayport, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amphetamine+and+other+weak+bases+act+to+promote+reverse+transport+of+dopamine+in+ventral+midbrain+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Amphetamine and other weak bases act to promote reverse transport of dopamine in ventral midbrain neurons.</a> J. Neurochem. 60, 527-535 (1993).</li>
<li>Salahpour, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+amphetamine-induced+hyperactivity+and+reward+in+mice+overexpressing+the+dopamine+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Increased amphetamine-induced hyperactivity and reward in mice overexpressing the dopamine transporter.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 4405-4410 (2008).</li>
<li>Khoshbouei, H., Wang, H., Lechleiter, J. D., Javitch, J. A., Galli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amphetamine-induced+dopamine+efflux.+A+voltage-sensitive+and+intracellular+Na%2B-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Amphetamine-induced dopamine efflux. A voltage-sensitive and intracellular Na+-dependent mechanism.</a> J. Biol. Chem. 278, 12070-12077 (2003).</li>
<li>Goodwin, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amphetamine+and+methamphetamine+differentially+affect+dopamine+transporters+in+vitro+and+in%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Amphetamine and methamphetamine differentially affect dopamine transporters in vitro and in.</a> , 284-2978 (2009).</li>
<li>Kahlig, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amphetamine+induces+dopamine+efflux+through+a+dopamine+transporter+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Amphetamine induces dopamine efflux through a dopamine transporter channel.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 3495-3500 (2005).</li>
<li>Swant, J., Chirwa, S., Stanwood, G., Khoshbouei, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methamphetamine+reduces+LTP+and+increases+baseline+synaptic+transmission+in+the+CA1+region+of+mouse+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Methamphetamine reduces LTP and increases baseline synaptic transmission in the CA1 region of mouse hippocampus.</a> PLoS One. 5, e11382(2010).</li>
<li>Gnegy, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+Ca2%2B+regulates+amphetamine-induced+dopamine+efflux+and+currents+mediated+by+the+human+dopamine+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Intracellular Ca2+ regulates amphetamine-induced dopamine efflux and currents mediated by the human dopamine transporter.</a> Mol. Pharmacol. 66, 137-143 (2004).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Simultanea voltage-clamp e amperometria offre i seguenti vantaggi. Tutti i tipi cellulari sono accessibili e possono essere utilizzati per la registrazione. L&#39;identificazione delle cellule o dei neuroni in cui sono fatte le registrazioni è semplice e lineare. In particolare, se la cella è marcato in modo fluorescente aggiungendo un tag fluorescente per la proteina di interesse sperimentatore può facilmente selezionare la cella di destinazione o neurone. La configurazione sperimentale consente un&#39;erogazione unifo...

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> Attrezzatura </td></tr><tr><td> Anti-vibrazione tavolo w / gabbia di Faraday </td><td> Tecnico Manufacturing Corporation </td><td> 63-500 serie </td><td> usiamo il modello 63-543 </td></tr><tr><td> Microscopio invertito Nikon TE-2000 </td><td> Nikon </td><td> interrotto </td><td> ora Eclipse Ti </td></tr><tr><td> Due amplificatori a basso rumore axopatch 200b </td><td> Molecular Devices </td><td></td><td> 800-635-5577 </td></tr><tr><td> 1-203 CV BU headstage </td><td> Molecular Devices </td><td></td><td> 800-635-5578 </td></tr><tr><td> 1-HL-U pipetta titolare </td><td> Molecular Devices </td><td></td><td> 800-635-5579 </td></tr><tr><td> Digidata 1440A convertitore A / D </td><td> Molecular Devices </td><td></td><td> 800-635-5580 </td></tr><tr><td> Due manipolatori Siskyou, a sinistrae la mano destra </td><td> Siskiyou </td><td> MX6600R MX6600L </td><td> 877-313-6418 </td></tr><tr><td> Laser pipetta estrattore </td><td> Sutter Instruments </td><td> P-2000 </td><td> 888-883-0128 </td></tr><tr><td> Bassa rumorosità in fibra di carbonio elettrodo amperometrico </td><td> ProCFE </td><td></td><td> <a href="http://www.dagan.com" target="_blank">www.dagan.com</a> </td></tr><tr><td> Bassa rumorosità quarzo pipetta </td><td> Sutter Instruments </td><td> QF100-70-7,5 </td><td> 888-883-0128 </td></tr><tr><td> 12 volt batteria auto </td><td></td><td></td><td> ampiamente disponibili </td></tr><tr><td> Caricabatterie per auto </td><td></td><td></td><td> ampiamente disponibili </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reagente </td></tr><tr><td> Cloruro di sodio (NaCl) </td><td> Sigma </td><td> S7653 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma </td><td> H3375 </td><td></td></tr><tr><td> Destrosio </td><td> Sigma </td><td> G7528 </td><td></td></tr><tr><td> Solfato di magnesio (MgSO4) </td><td> Sigma </td><td> M2643 </td><td></td></tr><tr><td> Potassio fosfato monobasico (KH 2 PO 4) </td><td> Sigma </td><td> P5655 </td><td></td></tr><tr><td> Cloruro di potassio (KCl) </td><td> Sigma </td><td> P9333 </td><td></td></tr><tr><td> Calcio cloruro diidrato (CaCl 2 • 2H 2 0) </td><td> Sigma </td><td> 223506 </td><td></td></tr><tr><td> Magnesio cloruro esaidrato (MgCl 2 • 6H 2 0) </td><td> Sigma </td><td> M2670 </td><td></td></tr><tr><td> EGTA </td><td> Sigma </td><td> E0396 </td><td></td></tr></tbody></table>

cella di misura singola di rilascio di dopamina con simultanea di tensione-clamp e amperometria

Single Cell Measurement of Dopamine Release with Simultaneous Voltage-clamp and Amperometry

Dopo il suo rilascio nella fessura sinaptica, la dopamina esercita le sue proprietà biologiche attraverso i suoi obiettivi di pre-e post-sinaptica 1. Il segnale dopamina è terminata da diffusione 2-3, enzimi extracellulari 4, e trasportatori di membrana 5. Il trasportatore della dopamina, che si trova nel peri-sinaptico dei neuroni dopaminergici cancella le ammine rilasciate attraverso un flusso di dopamina verso l&#39;interno (assorbimento). Il trasportatore della dopamina può funzionare anche in senso inverso per liberare ammine dall&#39;interno verso l&#39;esterno in un processo chiamato di trasporto verso l&#39;esterno o l&#39;efflusso di dopamina 5. . Più di 20 anni fa Sulzer et al hanno riportato il trasportatore della dopamina può operare in due modi di attività: in avanti (assorbimento) e la retromarcia (efflusso) 5. Il neurotrasmettitore rilasciato tramite efflusso attraverso il trasportatore può spostare una grande quantità di dopamina nello spazio extracellulare, e ha dimostrato di giocare un ruolo importante nella regolamentazione dopamina extracellulare homeostasi 6. Qui si descrive come patch clamp e registrazione simultanee amperometria può essere utilizzato per misurare dopamina rilasciata attraverso il meccanismo di flusso con risoluzione temporale millisecondo quando il potenziale di membrana è controllata. Per questo, cellule intere correnti e ossidativo (amperometrico) segnali sono misurati simultaneamente utilizzando un amplificatore Axopatch 200B (Molecular Devices, con un passa-basso insieme filtro di Bessel a 1.000 Hz per cellula intera registrazione corrente). Per amperometria registrazione di un elettrodo in fibra di carbonio è collegato ad un secondo amplificatore (Axopatch 200B) ed è posto adiacente alla membrana plasmatica e mantenuto a 700 mV. Le cellule intere e ossidativo (amperometrico) correnti possono essere registrati e la relazione corrente-tensione possono essere generati utilizzando un protocollo di tensione di fase. A differenza della calibrazione solita amperometrico, che richiede la conversione alla concentrazione, la corrente viene riportato direttamente senza considerare il 7 effettivo volume. Così, i dati risultantirappresentano un limite inferiore di efflusso dopamina perché alcuni trasmettitore è perso alla soluzione bulk.

Patch clamp combinato con amperometria può misurare tensione-dipendente DAT-mediata DA efflusso. Figura 2A mostra una configurazione rappresentativa sperimentale e registrazione DAT-mediata DA efflusso quando l&#39;ambiente intracellulare e il potenziale di membrana sono serrati da una cellula intera pipette patch. Usando questa tecnica, cellule esprimenti YFP-DAT proteine ​​sono in tensione fissata con una pipetta intero cerotto cellule mentre un elettrodo amperometrico viene posto sulla membrana plasm...

La tecnica di misura amperometrico il rilascio di dopamina da una singola cellula rilevando la corrente ossidativo prodotta per ossidazione spontanea dopamina. Morsetto di tensione simultanea e la metodologia amperometria rivelano il rapporto meccanicistico tra il generale &quot;attività&quot; del trasportatore della dopamina e il ruolo di regolamentazione di questa attività sul trasporto inverso di dopamina.

Cella di misura singola di rilascio di dopamina con simultanea di tensione-clamp e Amperometria

Dopo il rilascio nello spazio sinaptico, la dopamina esercita le proprie proprietà biologiche attraverso i suoi target pre- e post-sinaptici1. Il segnale dopaminergico è...

Lo scopo di questa procedura è misurare il trasporto inverso della dopamina in un neurone bloccato a potenziale costante, utilizzando contemporaneamente la tecnica del patch clamp e la voltammetria per misurare il rilascio di dopamina mediato da DAT. Questo viene ottenuto innanzitutto testando l'integrità dell'elettrodo voltammetrico con la dopamina. Il secondo passaggio consiste nel posizionare l'elettrodo voltammetrico vicino alla cellula e ottenere un'ampia registrazione in modalità whole cell del neurone mediante una pipetta per patch. Successivamente, la tensione della cellula viene controllata mediante la pipetta per il patch e il rilascio di dopamina mediato dal trasportatore della dopamina (DAT) da parte della cellula viene registrato simultaneamente con un elettrodo piroamperometrico. L'ultimo passaggio consiste nell'aggiungere un inibitore del DAT e registrare nuovamente le correnti della cellula intera e quelle piroamperometriche, in modo da poter sottrarre la corrente specificamente mediata dal trasportatore della dopamina. L'importanza di questa tecnica risiede nella possibilità di misurare il trasporto inverso della dopamina attraverso il trasportatore della dopamina,

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In questo video ci dimostra come applicare una conduttanza in un neurone dopaminergico registrato nella configurazione cellule intere fette di cervello di ratto. Questa tecnica è chiamata la pinza dinamica.

L&#39;applicazione di una conduttanza recettore NMDA nei neuroni dopaminergici mesencefalo Rat Utilizzando la tecnica dinamica morsetto

Tramite scansione veloce voltammetria ciclica per misurare elettricamente evocate dinamiche dopamina presinaptica in fettine di cervello striatale.

Dinamica dopamina presinaptica in fettine di cervello striatale con Fast-scan Voltammetria ciclica

Questo video mostra l'impianto di elettrodi e cannule in un ratto anestetizzato per misurare il rilascio di dopamina nel nucleo accumbens utilizzando un potenziostato e l'infusione di farmaci per modulare l'attività dopaminergica nell'area tegmentale ventrale.

Monitoraggio del rilascio di dopamina in un modello di ratto con manipolazione del recettore dei neuroni dopaminergici VTA

Il video dimostra la registrazione dell'attività elettrica nei neuroni fotorecettori dell'ommatidio di Drosophila stabilendo una configurazione dell'intera cellula. Evidenzia l'attivazione dei canali del potenziale recettoriale transitorio da parte di impulsi luminosi, con conseguenti urti quantici misurabili.

Registrazioni con morsetto di tensione a cellula intera dai fotorecettori di Drosophila

Le registrazioni subcellulari di patch-clamp offrono la possibilità di studiare le proprietà funzionali dei dendriti. Tuttavia, queste strutture fini non sono facilmente accessibili a causa del loro piccolo diametro. Il protocollo qui descritto mira a facilitare la raccolta di registrazioni stabili e affidabili dai dendriti dei neuroni dopaminergici in fette in vitro.

Subcellulari patch-clamp dal dominio Somatodendritic di nigral dopamina neuroni

La voltammetria ciclica veloce può monitorare la neurotrasmissione dopamina in vivo nel contesto di farmaci, malattie e altre manipolazioni sperimentali. Questo lavoro descrive l'implementazione di QNsim1.0, un software per modellare le risposte dopaminiche stimolate elettricamente secondo il modello quantitativo neurobiologico per quantificare le stime della dinamica di rilascio e di reuptake della dopamina.

Modellazione di voltammetria ciclica veloce dei dati da dati neurotrasmettivali elettromagnetici a dopamina utilizzando QNsim1.0

Le registrazioni a cellule intere dai fotoricettori Drosophila melanogaster consentono di misurare scatti oscuri spontanei, urti quantici, risposte macroscopiche alla luce e relazioni di tensione-corrente in varie condizioni. In combinazione con gli strumenti di manipolazione genetica D. melanogaster , questo metodo consente di studiare il percorso iniettol-lipidico onnipresente e il suo target, il canale TRP.

Metodo elettrofisiologico per le registrazioni a morsetto di tensione a cellule intere da<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotorecettori

Questa carta dettaglia l'uso di registrazioni di fisso-potenziale amperometrico utilizzando elettrodi in fibra di carbonio e tecnologia dei biosensori enzimatici per misurare il rilascio di dopamina e glutammato con elevata risoluzione temporale durante il naturale comportamento gratificante nella criceto femmina.

Misurare In Vivo i cambiamenti in neurotrasmettitori extracellulare durante naturalmente Premiando i comportamenti in criceti siriani femminili

Qui descriviamo l'acquisizione ottica e la caratterizzazione di potenziali d'azione da cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte utilizzando un sistema di fotometria modulare ad alta velocità.

Misurazione del potenziale d'azione ottico a singola cellula in cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane

Questo metodo introduce una semplice tecnica per il rilevamento del rilascio endogeno di monoammina utilizzando fette di cervello acute. La configurazione utilizza una piastra a 48 pozzetti contenente un supporto in tessuto per il rilascio di monoammina. La monoammina rilasciata viene analizzata mediante HPLC accoppiato con il rilevamento elettrochimico. Inoltre, questa tecnica fornisce un metodo di screening per la scoperta di farmaci.

Un test basato su piastre per la misurazione del rilascio di monoamina endogena in fette cerebrali acute

Impara a misurare il trasporto inverso di dopamina in neuroni con patch clamp e piroamperometria simultanei. Questa tecnica consente di registrare il rilascio mediato dal DAT controllando il potenziale di membrana.

Cella di misura singola di rilascio di dopamina con simultanea di tensione-clamp e Amperometria

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