Monitoraggio dei riduttivo e ossidativa semireazioni di Flavin-Dependent monoossigenasi con Stopped-Flow Spettrofotometria
March 18th, 2012
Si descrivono l'uso di un stopped-flow strumento per studiare sia riduttive e ossidativo semireazioni di Aspergillus fumigatus Sideroforo A (Sida), un flavina-dipendente monoossigenasi. Abbiamo poi mostrano gli spettri corrispondenti alle specie di cui la reazione di Sida e calcolare le costanti di velocità per la loro formazione.
Questa procedura utilizza uno strumento a flusso arrestato per rilevare le diverse forme spettrali di SID A e misurare le velocità. La reazione catalizzata dalla SID A può essere suddivisa in semireazioni riduttive e ossidative della FAD. La flavina ossidata si lega a N-A-D-P-H e reagisce per formare flavina ridotta e NADP più la reazione dell'ossigeno molecolare e il legame dell'ornitina provocano la formazione di C quattro.
Un'idrossiflavina dopo l'idrossilazione dell'ornitina, l'idrossiflavina si disidrata per formare l'enzima ossidato. NA DP plus rimane legato durante tutto il ciclo catalitico ed è l'ultimo substrato ad essere rilasciato. Lo strumento a flusso arrestato facilita la miscelazione rapida di piccoli volumi di reagenti e registrazioni.
Lo spettrofotometro a perdita di materiale consente di misurare il tasso di formazione e di una reazione catalizzata da un enzima specificamente di intermedi transitori. Due membri del mio laboratorio, Rita Robinson e Enviro Romero dimostreranno questi esperimenti utilizzando il set A al sapore mono ossigenasi come sistema modello. Versare 250 millilitri di tampone fosfato di potassio 100 millimolare in un pallone da 500 millilitri contenente una barra di agitazione.
Sigillare il pallone con un tappo di gomma, quindi posizionarlo su una piastra di agitazione e collegare il tubo corto del pallone a una linea di fianco sch. Degassare il tampone sotto vuoto per un'ora a temperatura ambiente con agitazione, quindi risciacquare con argonne. Ripeti cinque volte.
Infine, sciacquare la fiaschetta con Argonne per 10 secondi. Scollegare il pallone dal collettore del vuoto e posizionarlo all'interno del vano portaoggetti. Continuare a mescolare energicamente con il pallone aperto.
Riempire le siringhe del serbatoio con 18,13 unità per millilitro di glucosio ossidasi e 100 millimolari di soluzioni di glucosio. Impostare ora le valvole di azionamento in posizione di carico. Riempire le siringhe di azionamento.
Quindi, ruotare la valvola F in posizione di azionamento. Utilizzando il software di controllo dati pro, fare clic su svuotare la siringa di arresto, quindi spingere il tampone dalla siringa di azionamento F attraverso il circuito di flusso sollevando manualmente il pistone di azionamento corrispondente. Continuare con le altre tre siringhe di azionamento, equilibrare per un'ora.
Riempire ora le siringhe del serbatoio e ripetere il lavaggio del sistema di flusso interrotto. Per preparare un tampone saturo di ossigeno. Far bollire la soluzione con ossigeno al 100% per un'ora agitando.
Quindi rimuovere l'ago corto dal flaconcino e attendere 10 secondi. Procedere con la rimozione dell'ago lungo e posizionare la cuvetta chiusa nel vano portaoggetti. Per la soluzione N-A-D-P-H.
Inserire un tubo einor da 1,5 millilitri contenente un milligrammo di N-A-D-P-H nella scatola dei guanti. Sciogliere in 300 microlitri di tampone anaerobico fosfato di potassio da 100 millimolari. pH 7,5.
Rimuovere 30 microlitri per determinare la concentrazione di N-A-D-P-H. Ora, per rimuovere l'ossigeno dal brodo enzimatico, trasferire la soluzione in una fiala da 25 millilitri contenente un tappo per ancorette con un tappo di grano e un tappo e un sigillo in alluminio. Mettere sul ghiaccio.
Collegare a una linea schlink, quindi degassare sottovuoto per 20 minuti, quindi risciacquare con argonne. Infine, sciacquare la fiala con Argonne per 10 secondi e scollegarla dal collettore del vuoto. Posizionare la fiala sul ghiaccio all'interno del vano portaoggetti.
Nella finestra del pannello di controllo del software pro data control. Selezionare l'array di fotodiodi, il trigger esterno e la scala logaritmica. Avvia anche il software pro data viewer e definisci la directory per l'archiviazione dei file di dati.
Sostituire ora la soluzione nelle siringhe del serbatoio C e F con un tampone anaerobico 100 millimolare di fosfato di potassio pH 7,5. Ruotare le valvole C e F in posizione di azionamento. Fare clic su Svuotare la siringa di arresto nel software di controllo dati pro.
Quindi spingere il tampone da entrambe le siringhe di azionamento attraverso il circuito di flusso sollevando manualmente il pistone di azionamento corrispondente. Ripetere il risciacquo con le siringhe C e F altre tre volte. Per garantire la completa rimozione della glucosio ossidasi dal circuito di flusso, procedere a fare clic sulla linea di base nel software di controllo dati pro.
Sostituire la soluzione della siringa del serbatoio F con la soluzione enzimatica. Ruotare la valvola F in posizione di marcia. Fare clic su Svuotare la siringa di arresto nel software di controllo dati pro.
Spingere la soluzione enzimatica dalla siringa di azionamento F attraverso il circuito di flusso sollevando manualmente il pistone di azionamento corrispondente. Torna al software di controllo dati pro per impostare il tempo di acquisizione su 60 secondi. Verificare che entrambe le siringhe di azionamento siano riempite con le soluzioni corrispondenti e che i pistoni di azionamento siano a contatto con la siringa di azionamento. Pistoni.
Ruotare entrambe le valvole in posizione di azionamento e fare clic su acquisisci nel software di controllo dati pro per eseguire l'azionamento. Acquisire dati spettrali della forma ossidata dell'enzima in triplicato utilizzando il valore A 4 52 nanometri ottenuto dagli azionamenti. Determinare la concentrazione dell'enzima prima di mescolare e preparare quattro millilitri di soluzione N-A-D-P-H.
Riempire la siringa C con la soluzione N-A-D-P-H con 1,5 volte più concentrato, svuotare e riempire la siringa di arresto tre volte come mostrato in precedenza. Ora, acquisire gli spettri durante la riduzione del contenuto di lavaggio enzimatico dal circuito di flusso con tampone anaerobico fosfato di potassio da 100 millimolari pH 7,5. Ora fai clic sulla linea di base nel software di controllo dati pro.
Quindi mescolare 200 microlitri di soluzione madre enzimatica con 1000 microlitri di tampone anaerobico fosfato di potassio 100 millimolare. pH 7,5. Sostituire la soluzione della siringa del serbatoio A con la soluzione enzimatica.
Ruotare la valvola A in posizione di azionamento nel software di controllo dati pro. Fare clic sull'arresto della siringa vuota. Spingere la soluzione enzimatica dalla siringa di azionamento A attraverso il circuito di flusso sollevando manualmente il pistone di azionamento corrispondente.
Impostare il tempo di ritardo su 0,5 secondi e il tempo di acquisizione su 60 secondi. Verificare che tutte le siringhe di azionamento siano riempite con le soluzioni corrispondenti e che i pistoni di azionamento siano a contatto con i pistoni della siringa di azionamento. Quindi ruotare tutte le valvole di azionamento in posizione di azionamento e fare clic su acquisisci nel software di controllo dati pro.
Ottenere dati spettrali della forma ossidata dell'enzima in triplicato. Quindi, sostituire la soluzione della siringa del serbatoio B con una soluzione N-A-D-P-H. 1,5 volte più concentrato della soluzione enzimatica nella siringa A.Ruotare la valvola B in posizione di azionamento e svuotare e riempire la siringa di arresto tre volte come mostrato in precedenza nella finestra del pannello di controllo.
Impostare il tempo di ritardo su 0,5 secondi. Un'acquisizione a 20 secondi, sostituire la soluzione del serbatoio siringa mare con il tampone ossigenato. Ruotare la valvola C in posizione di marcia.
Risciacquare tre volte nel software di controllo dati pro. Impostare il tempo di ritardo a 15 secondi e il tempo di acquisizione a 900 secondi. Continuare ad acquisire spettri durante la riossidazione dell'enzima completamente ridotto nello strumento a flusso arrestato.
La riduzione anaerobica della SID A con N-A-D-P-H può essere monitorata misurando le variazioni dello stato redox della flavina utilizzando l'assorbente a 452 qui. Le variazioni spettrali vengono registrate nel tempo dal SID A ossidato all'ultimo spettro di SID A completamente ridotto. La velocità di questo passaggio enzimatico può essere determinata adattando i dati all'equazione appropriata. La velocità di ossidazione e gli intermedi di reazione possono anche essere determinati utilizzando la doppia modalità di miscelazione del flusso arrestato in questa reazione da AF Sid A.L'intermedio C quattro A Idrossiflavina è chiaramente rilevato con una lambda max di tre 80 nanometri e l'enzima ossidato ha una lambda max di 450 nanometri.
Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in quattro-sei ore se eseguita correttamente. Ricorda di assicurarti che le soluzioni siano anaerobiche. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come studiare sia lo ione relativo che quello ulcerativo del mono indipendente FLA più a valle dell'esperimento come la chimica rapida.
Quentin può aiutare a chiarire la triste natura degli intermedi.
Panoramica
Questo studio utilizza uno strumento a flusso interrotto per analizzare le semi-reazioni riduttive e ossidative dell'A (SidA) sideroforo di Aspergillus fumigatus, una monoossigenasi dipendente dalla flavina. La ricerca include l'analisi spettrale degli intermedi di reazione e il calcolo delle costanti di velocità per la loro formazione.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Biochimica
- Enzimologia
- Spettroscopia
Sfondo
- Aspergillus fumigatus è un importante patogeno fungino.
- Il sideroforo A (SidA) svolge un ruolo cruciale nell'acquisizione del ferro.
- Le monoossigenasi dipendenti dalla flavina sono importanti per varie reazioni biochimiche.
- Comprendere i meccanismi di reazione può aiutare nello sviluppo di strategie antifungine.
Obiettivo dello studio
- Indagare i meccanismi di reazione di SidA.
- Misurare le costanti di velocità degli intermedi di reazione.
- Fornire approfondimenti sul ciclo catalitico degli enzimi dipendenti dalla flavina.
Metodi utilizzati
- Spettroscopia a flusso interrotto per miscelazione rapida e analisi spettrale.
- Preparazione di condizioni anaerobiche per le reazioni enzimatiche.
- Misurazione dei cambiamenti spettrali nel tempo per determinare la cinetica di reazione.
- Uso di buffer e reagenti specifici per facilitare le reazioni.
Risultati principali
- Identificazione di diverse forme spettrali di SidA durante le reazioni.
- Calcolo delle costanti di velocità per la formazione degli intermedi di reazione.
- Dimostrazione del ciclo catalitico che coinvolge NADP e ossigeno.
- Caratterizzazione degli intermedi transitori nel percorso di reazione.
Conclusioni
- La tecnica a flusso interrotto è efficace per studiare la cinetica enzimatica.
- Gli approfondimenti ottenuti possono informare le future ricerche sugli enzimi dipendenti dalla flavina.
- I risultati contribuiscono alla comprensione del metabolismo fungino.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Stopped-flow spectrophotometry enables precise kinetic dissection of flavin-dependent monooxygenase reactions, supporting mechanistic de-risking and target validation in early discovery. By resolving reductive and oxidative half-reactions and quantifying transient intermediates, this approach enhances predictive confidence for enzyme-targeted portfolios. The method's adaptability to other flavin-dependent systems positions it as a reusable capability for biopharma R&D pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct measurement of intrinsic rate constants for mechanistic hypothesis testing.
- Supports identification and characterization of catalytic intermediates for functional target validation.
- Facilitates biological de-risking by clarifying enzyme reaction pathways.
- Improves predictive confidence for advancing enzyme targets in discovery portfolios.
Screening & Assay Development
- Provides validated spectral readouts for assay standardization and reproducibility.
- Enables quantitative tracking of enzyme redox states for reliable compound evaluation.
- Supports preparation of robust biological systems for downstream screening workflows.
- Allows platform reuse across flavin-dependent monooxygenase targets.
Translational & Preclinical Research
- Aligns mechanistic insights with disease-relevant enzyme systems when applicable.
- Ensures continuity from discovery-stage kinetic validation to preclinical model selection.
- Informs risk-adjusted advancement decisions by clarifying catalytic mechanisms.
- Supports translational biomarker development through quantitative intermediate detection.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates at the interface of early discovery and lead identification, providing mechanistic clarity before preclinical advancement.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by resolving reductive and oxidative half-reactions.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative spectral outputs for assay readiness.
- Analytics: Enables measurement of rate constants and detection of transient intermediates for comparative analysis.
- Translational Research: Connects mechanistic findings to preclinical model selection when enzyme targets are disease-relevant.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized workflow adaptable to other flavin-dependent monooxygenases.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in enzyme target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable kinetic measurements.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio triage.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of enzyme-targeted assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in enzymology and kinetic data analysis.
- Needs access to stopped-flow spectrophotometry and anaerobic handling infrastructure.
- Demands rigorous cross-team standardization of buffer preparation and instrument calibration.
- Adaptable to various flavin-dependent monooxygenase systems with appropriate optimization.
- Dependent on maintaining strict anaerobic conditions for accurate half-reaction measurement.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:37
Anaerobic Buffer
2:24
Removing Oxygen from the Stopped-flow System
3:22
Key Solutions
4:45
Reductive Half-reaction: Monitoring Flavin Reduction
7:31
Oxidative Half-reaction: Monitoring Flavin Oxidation
10:10
Stopped Flow: Spectral Forms of Af SidA
11:27
Conclusion
