Name: Monitoraggio dei riduttivo e ossidativa semireazioni di Flavin-Dependent monoossigenasi con Stopped-Flow Spettrofotometria (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 8 s
Description: Scopri la spettroscopia stopped-flow per analizzare le semireazioni riduttive e ossidative di SidA, una monoossigenasi dipendente dal flavine. Questo metodo permette di misurare le costanti cinetiche degli intermedi enzimatici.

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La ricerca finanziata dalla NSF award MCB-1021384.

1. Preparazione del Buffer anaerobico <ol><li> Preparare 1 L di tampone fosfato di potassio 100 mM, pH 7,5. Versare 250 mL di tampone in un pallone da 500 ml Büchner con una barra agitatrice. </li><li> Sigillare il pallone con un tappo di gomma e metterlo su un piatto scalpore. Collegare il tubo corto del pallone ad una linea Schlenk. </li><li> Degasare il tampone sotto vuoto per 5 ore a temperatura ambiente con agitazione. Durante questo periodo di tempo, effettuare 5 turni consecutivi di degasaggio sotto vuoto e lavaggio con argon ogni ora. </li><li> Lavare il pallone con argon per 10 secondi e scollegarlo dal collettore di aspirazione. Porre il pallone all&#39;interno del vano portaoggetti. </li><li> Lasciare il pallone aperto nel vano portaoggetti durante la notte con agitazione vigorosa. </li></ol> 2. Rimozione di ossigeno da Stopped-flow del sistema <ol><li> Preparare 1 L di acetato di sodio 0,1 M, pH 5,0. Versare 125 ml di questo tampone in un pallone da 250 ml Büchner ed eseguire operazioni 1,2-1,4. </li><li> Pesare 5mg glucosio ossidasi da Aspergillus niger (181.300 U / g) e 0,9 g di glucosio usando un tubo Eppendorf 1,5 mL e 50 mL Falcon tubo conico, rispettivamente. Posizionare entrambi i contenitori nel vano portaoggetti. </li><li> Sciogliere glucosio ossidasi e glucosio in 50 mL di acetato di sodio anaerobica 0,1 M, pH 5,0 (concentrazioni finali di 18,13 U / ml e 100 mm, rispettivamente). Riempire le siringhe serbatoio con questa soluzione (Figura 1). </li><li> Assicurarsi che le valvole di azionamento sono in posizione &quot;carico&quot; e riempire le siringhe di azionamento (Figura 1). Girare la valvola F in posizione &quot;drive&quot;. Svuotare la siringa fermata cliccando sul vuoto nel Pro-Data software di controllo. Spingere il buffer da unità F siringa attraverso il circuito del flusso manualmente sollevando la ram corrispondente unità. Ripetere questa operazione dieci volte in totale. Eseguire la stessa procedura con le altre tre siringhe di unità. Attendere un&#39;ora. </li><li> Sostituire la soluzione delle siringhe serbatoio con lo stesso tampone conteniNing glucosio ossidasi e glucosio. Ripetere il punto 2.4. </li><li> Ripetere il passaggio 2.5 e permettono la soluzione di stare nel sistema di flusso durante la notte. </li><li> Dopo una notte di incubazione, ripetere il passo 2.5. </li></ol> 3. Preparazione del tampone di ossigeno saturo <ol><li> Preparare potassio 100 mM tampone fosfato (pH 7,5) e 50 mL versare in un flacone da 50 ml con una barra agitatrice. Chiudere la fiala con un tappo Wheaton e un sigillo in alluminio Wheaton. </li><li> Posizionare il flaconcino su ghiaccio. Immergere un lungo ago collegato ad un serbatoio contenente ossigeno al 100% nella soluzione. Inserire un altro ago corto attraverso il tappo del flaconcino come uno sfogo. </li><li> Bubble la soluzione con ossigeno al 100% per 1 ora con agitazione. </li><li> Prima di tutto rimuovere l&#39;ago corto dal flaconcino e attendere 10 secondi prima di rimuovere l&#39;ago lungo. Posizionare il flacone chiuso nel vano portaoggetti. </li></ol> 4. Preparazione della soluzione NADPH <ol><li> Pesare 1 mg di NADPH in una provetta da 1,5 ml Eppendorf e posizionare it nel vano portaoggetti. </li><li> Sciogliere il NADPH in 300 pl di anaerobica tampone fosfato di potassio 100 mM, pH 7,5. Rimuovere 30 pl di questa soluzione dal vano portaoggetti per determinare la concentrazione di NADPH con uno spettrofotometro (ε 340 nm = 6.270 M -1 cm -1). </li></ol> 5. Rimozione di ossigeno dalla soluzione enzimatica <ol><li> Prendete 400 ml di soluzione enzimatica magazzino dal freezer e scongelare nel vano portaoggetti. La soluzione madre enzima (360 uM) è stato precedentemente preparata in 100 mM tampone fosfato di potassio (pH 7,5) contenente 100 mM NaCl, e congelati in azoto liquido. </li><li> Trasferire la soluzione enzimatica in un flacone da 25 ml con ancoretta, chiudere la fiala con un tappo Wheaton e un sigillo in alluminio Wheaton e togliere dal cassetto portaoggetti. </li><li> Posizionare il flaconcino su ghiaccio e collegarlo ad una linea di Schlenk inserendo un ago attraverso il tappo del flacone. </li><li> Degassare la soluzione enzimatica eseguendo 5 turni consecutivi didegasaggio sotto vuoto e lavaggio con argon ogni 20 minuti per 1 ora. </li><li> Sciacquare la fiala con argon per 10 secondi e scollegarlo dal collettore di aspirazione. Posizionare il flaconcino su ghiaccio all&#39;interno del vano portaoggetti. </li></ol> 6. Riduttiva Half-reazione: Flavin Riduzione Monitoring <ol><li> Preparare la stopped-flow strumento e la Pro-dati software di controllo per singola modalità di mescolamento seguendo il protocollo del produttore. </li><li> Attivare un bagno di acqua circolante (15 ° C). Rimuovere ossigeno dall&#39;acqua mediante gorgogliamento di azoto attraverso di essa per 20 minuti. Ciò impedisce la contaminazione da ossigeno attraverso il circuito di flusso. </li><li> Mantenere la temperatura delle siringhe di azionamento e la cella di osservazione a 15 ° C collegando l&#39;alloggiamento bagno d&#39;acqua del stopped-flow al bagno circolante. </li><li> Nella finestra Pannello di controllo del Pro-Data Array software Photodiode controllo di selezione, trigger esterno (per attivare stopped-flow operativo), e LogaritHMIC scala. </li><li> Avviare il Pro-Data software di visualizzazione e definire la directory dove i file di dati verranno memorizzati. </li><li> Sostituire la soluzione del serbatoio siringhe C e F anaerobica con tampone fosfato di potassio 100 mM (pH 7,5). Girare la C e le valvole F alla posizione &quot;drive&quot;. Svuotare la siringa fermata facendo clic su Svuota nella Pro-Data software di controllo. Spingere il buffer da entrambe le siringhe guida attraverso il circuito del flusso manualmente sollevando l&#39;unità corrispondente ariete cinque volte in totale (fare clic su Svuota prima di ogni movimento del pistone). </li><li> Al fine di garantire che glucosio ossidasi è stato rimosso completamente dal circuito di flusso, eseguire il passaggio 6,6 quattro volte in totale. </li><li> Fare clic sul Baseline nella Pro-Data software di controllo. </li><li> Mescolare 100 ml di soluzione enzimatica magazzino di 1100 anaerobica 100 microlitri di tampone fosfato di potassio mM (concentrazione finale dopo la miscelazione nel flusso interrotto di 15 pM). </li><li> Sostituire la soluzione del serbatoio syrF Inge con la soluzione di enzima. Girare la valvola F in posizione &quot;drive&quot;. Svuotare la siringa fermata facendo clic su Svuota nella Pro-Data software di controllo. Spingere la soluzione enzimatica da unità F siringa attraverso il circuito del flusso manualmente aumentando la ram corrispondente unità. Eseguire questo tre volte in totale. Nella Pro-Data software di controllo, impostare il tempo di acquisizione a 60 s. </li><li> Assicurarsi che entrambe le siringhe sono piene di auto con le loro soluzioni corrispondenti e gli arieti unità sono in contatto con siringhe pistoni di azionamento. Girare entrambe le valvole in posizione &quot;drive&quot; e fare clic su Acquisisci nella Pro-Data software di controllo per eseguire l&#39;unità. Ripetere questa operazione due volte di più per ottenere i dati in triplice copia. Questo spettri rendimenti della forma ossidata dell&#39;enzima. </li><li> Utilizzando il valore di A 452 nm ottenuto dalle unità, determinare la concentrazione dell&#39;enzima prima della miscelazione (ε = 452 nm 13.700 M -1 cm -1) e preparare 4 mL di una solutio NADPHn 1,5 volte più concentrato. </li><li> Sostituire la soluzione del serbatoio C siringa con la soluzione di NADPH e di vuoti e riempire la siringa fermata tre volte, come descritto in 6.10. </li><li> Ripetere il passaggio 6.11. Questo spettri rese durante la riduzione dell&#39;enzima. </li></ol> 7. Ossidativo Half-reazione: Flavin Ossidazione Monitoring <ol><li> Preparare la stopped-flow strumento e la Pro-dati software di controllo per doppia modalità di mescolamento seguendo il protocollo del produttore. </li><li> Ripetere i passaggi 6.2-6.5. </li><li> Sostituire la soluzione nelle quattro siringhe serbatoio anaerobica con tampone fosfato di potassio 100 mM (pH 7,5). Girare la valvola F in posizione &quot;drive&quot;. Svuotare la siringa fermata facendo clic su Svuota nella Pro-Data software di controllo. Spingere il buffer dalla unità F siringa attraverso il circuito del flusso manualmente sollevando la ram corrispondente unità. Eseguire questa operazione cinque volte in totale con ogni siringa unità. </li><li> Eseguire il passaggio 7.3 quattro volte in total di rimuovere completamente i contenuti dal circuito di flusso. </li><li> Clicca Baseline nella Pro-Data software di controllo. </li><li> Mescolare 200 ml di soluzione enzimatica magazzino con 1000 anaerobica 100 microlitri di tampone fosfato di potassio mM (concentrazione finale dopo la miscelazione nel flusso interrotto di 15 pM). </li><li> Sostituire la soluzione di siringa serbatoio A con la soluzione di enzima. A Girare la valvola nella posizione &quot;drive&quot;. Svuotare la siringa fermata facendo clic su Svuota nella Pro-Data software di controllo. Spingere la soluzione enzimatica dalla siringa drive A attraverso il circuito del flusso manualmente aumentando la ram corrispondente unità. Eseguire questa operazione per tre volte in totale. Nella Pro-Data software di controllo, impostare il tempo di ritardo di 0,5 s e il tempo di acquisizione a 60 s. </li><li> Assicurarsi che tutte le siringhe di azionamento sono riempiti con le relative soluzioni e il montone disco sono in contatto con siringhe pistoni di azionamento. Girate tutte le valvole in posizione &quot;drive&quot; e fare clic su Acquisisci nella Pro-Datun software di controllo per eseguire l&#39;unità. Ripetere questa operazione altre due volte per ottenere i dati in triplice copia. Questo spettri rendimenti della forma ossidata dell&#39;enzima. </li><li> Sostituire la soluzione della siringa B serbatoio con una soluzione NADPH 1,5 volte più concentrato rispetto alla soluzione enzimatica in siringa A. Girare la valvola B in posizione &quot;drive&quot; e svuotare e riempire la siringa fermata tre volte, come descritto in 7.7. </li><li> Sostituire la soluzione del serbatoio siringa C con tampone ossigenato. Girare la valvola C in posizione &quot;drive&quot; e svuotare e riempire la siringa fermata tre volte, come descritto in 7.7. Nella Pro-Data software di controllo, impostare il tempo di ritardo e l&#39;acquisizione a 15 e 900 s, rispettivamente. </li><li> Ripetere il punto 7.8. Questo spettri rese durante la riossidazione del enzima completamente ridotto. </li></ol> 8. Analisi dei dati <ol><li> Avviare il Pro-Data software di conversione. Fare clic sull&#39;icona Opzioni e selezionare Salva in ProDataCSV. </li><li> Apertola directory in cui sono stati memorizzati i file di dati. Trascinare i file alla APL Pro-Data finestra convertitore. I dati saranno automaticamente salvati come file in formato CSV nella stessa directory. </li><li> Aprire i file in formato CSV utilizzando Microsoft Excel (Microsoft, Redmond, WA, USA). Normalizzare la linea di base dei stopped-flow tracce sottraendo l&#39;assorbimento corrispondente a 700 nm. </li><li> Analizzare le tracce corrette utilizzando Kaleidagraph (Software Synergy, Reading, PA) inserendo la trama del assorbanza al massimo in funzione del tempo corrispondente alla funzione appropriata esponenziale. Come mostrato in Figura 2B, l&#39;assorbanza a 452 nm è stata tracciata in funzione del tempo per determinare il tasso di riduzione flavina dopo la miscelazione e l&#39;enzima NADPH in stopped-flow strumento. In questo caso, il migliore adattamento dei dati sono stati ottenuti utilizzando una doppia equazione esponenziale e tassi di 0,65 e 0,23 s -1 sono stati calcolati per la prima e seconda fase di riduzione, resture rispettivamente. Per determinare il tasso di formazione del C4a-hydroperoxyflavin intermedio e la riossidazione dopo reazione con l&#39;enzima ridotto ossigeno, abbiamo analizzato le stopped-flow tracce a 380 e 452 nm, rispettivamente (Figura 3B). Utilizzo di una singola equazione esponenziale, abbiamo calcolato tassi di 1,4 e 0,006 s -1 per il primo passo e secondo ossidativo semireazione, rispettivamente. </li></ol> 9. Risultati rappresentativi I risultati degli esperimenti descritti nelle sezioni precedenti mostrano come il riduttiva semi-reazione di A Sida f può essere monitorata misurando le variazioni di assorbanza a 452 nm, che corrispondono ai cambiamenti nello stato redox della flavina. Il tasso di questo stadio può essere determinato inserendo i dati per l&#39;equazione appropriata (Figura 2; Fase 8,4). Il tasso di riduzione ottenuto (0,65 s -1) è simile al valore k calcolato con gattoallo stato stazionario esperimenti 2, suggerendo che la riduzione è il fattore limitante della reazione. Sfruttando la modalità doppia miscelazione del stopped-flow, il tasso di ossidazione e gli intermedi in questo mezzo reazione può essere determinato (Figura 3; Fase 8,4). Nella reazione catalizzata dalla Sida A f, la C4a-hydroperoxyflavin è chiaramente rilevato (λ max di 380 nm), e il tasso di formazione e decadimento può essere calcolato. La lentezza della riossidazione ottenuto (0,006 s -1) indica che il C4a-hydroperoxyflavin è molto stabile in assenza della ornitina. <img alt="Schema 1" src="/files/ftp_upload/3803/3803scheme1.jpg" /> Schema 1. Meccanismo di un Sida f. L&#39;anello isoallozaxine del cofattore FAD viene mostrato. Il ossidato flavina (A) si lega a NADPH (B) e reagisce per formare ridotta Flavin e NADP + (C). Dopo la reazione con ossigeno molecolare e di legameornitina, il C4a-hydroperoxyflavin si forma (D). Questa è la specie idrossilante. Dopo idrossilazione della ornitina, il hydroxyflavin (E) deve essere disidratato per formare l&#39;enzima ossidato. NADP + rimane vincolato per tutto il ciclo catalitico ed è il prodotto ultimo ad essere rilasciato (F). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3803/3803fig1.jpg" /> Figura 1. La stopped-flow strumento. A) Immagine dei componenti del Photophysics Applied SX20 stopped-flow spettrofotometro. B) Immagine della centrale di trattamento del campione. C) Schema del circuito di flusso in doppia modalità di mescolamento. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3803/3803fig2.jpg" /> Figura 2. Riduzione anaerobica di Sida con NADPH in stopped-flow strumento. A) modifiche spettrali registrati dopo mescolando volumi uguali di 30 pm Sida NADPH e 45 micron. Il primo spettro (ossidato Sida) e spettro ultimo (completamente ridotto SidA) è evidenziata in blu e rosso, rispettivamente. B) traccia assorbanza a 452 nm registrate in funzione del tempo. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3803/3803fig3.jpg" /> Figura 3. Ossidazione di Sida in stopped-flow strumento. A) i cambiamenti spettrali registrati dopo la miscelazione volumi uguali completamente ridotta Sida e buffer ossigenato. Le concentrazioni finali erano di 15 pM Sida, NADPH 22,5 pM, ossigeno e 0,95 mM. Lo spettro registrato a 0,034, 4,268, e 727,494 s corrisponde all&#39;enzima completamente ridotta, il C4a-hydroperoxyflavin intermedio (λ max di 380 nm), e l&#39;enzima ossidato (λ max di 450 nm), rispettivamente. B) traccia assorbanza a 382 e 452 nm registrata in funzione del tempo.

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Non abbiamo nulla da rivelare.

Enzimi che catalizzano reazioni redox solito contengono cofattori quali hemes e flavine che subiscono variazioni di assorbanza significativi durante il ciclo catalitico. La forma ossidata del flavina presenta assorbanza massimi a ~ 360 e 450 nm, e la sua riduzione è tipicamente monitorata seguendo la diminuzione di assorbanza a 450 nm 7. In generale, alcuni transitori intermedi sono presenti, ma la forma e il decadimento troppo veloce per essere misurato in spettrofotometri regolari. Utilizzando il Applied Photophysics SX20 stopped-flow spettrofotometro (o strumenti simili), è possibile misurare le variazioni di assorbanza nella scala temporale millisecondo (tempo morto, 2 ms). Qui abbiamo studiato le riduttive e ossidativo mezze reazioni del flavina-dipendente monooxygenase A Sida f, che funge da modello. Il tasso di trasferimento di idruro è stata determinata misurando la variazione di assorbanza a 452 nm dopo la miscelazione con l&#39;enzima NADPH in condizioni anaerobiche. Successivamente, tenendo advantage della modalità doppia miscelazione del stopped-flow strumento, l&#39;enzima è stato fatto reagire con NADPH, fino a completa riduzione è stata ottenuta, quindi il enzimatica ridotta-NADP + complesso è stato miscelato con ossigeno. Seguendo questa procedura, è possibile rilevare transitori intermedi flavina ossigenati e per misurare i tassi di formazione e di decadimento. L&#39;identificazione di questi intermedi fornisce dati sperimentali sulla natura delle specie reattive di catalisi. Nel caso di Sida A f, la formazione del C4a-hydroperoxyflavin (tipicamente monitorato a 370-380 nm), che è la specie idrossilante. Inoltre, misurando la velocità costante di ogni passo permette di ottenere informazioni sul fattore limitante della reazione e aiutano a chiarire i meccanismi cinetici e chimico dell&#39;enzima. In generale, gli approcci simili possono essere usati per altre flavoenzymes, o proteine ​​per le quali assorbanza cambiamenti intercorsi, come proteine ​​che contain eme, piridossal-fosfato, o di ferro non-eme 8-10. Una limitazione di questo metodo è che grandi quantità di enzima purificato sono richiesti, ma questo può essere superato utilizzando un sistema di espressione con alte rese. Si determina la concentrazione proteica ottimale per spettri registrazione utilizzando proteine ​​abbastanza così che un segnale sufficientemente forte può essere osservato, ma non troppo enzima che non viene sprecato. Tipicamente, la concentrazione più bassa enzima per flavina contenenti enzimi utilizzati in stopped-flow esperimenti è 6-10 uM (dopo la miscelazione) e viene determinata utilizzando il coefficiente di estinzione molare corrispondente dell&#39;enzima. Nel caso di Sida A f, la percentuale di FAD enzima legato è 50-65% 2. Apo-proteina è considerata inattiva in questi esperimenti perché un cofattore FAD legato è necessaria per la catalisi. Un&#39;altra possibile limitazione di questo metodo è se i processi in un enzima avvenire più velocemente di 2 ms (tempo morto di stopped-flow) che non verrà osservato, ma there sono riportate le strategie in cui i tassi può essere diminuita per superare questo problema. Un esempio di questo include l&#39;utilizzo di una elevata concentrazione di NaCl nella reazione di ferredossina-NADP + riduttasi 11. Il lavaggio di ossigeno dal circuito flusso del stopped-flow è spesso un passo difficile in questo esperimento e richiede una particolare attenzione. La glucosio ossidasi-glucosio sistema qui descritto viene utilizzato con successo nella maggior parte dei laboratori in quanto è un metodo efficace ed economico. Tuttavia, ci sono alcuni svantaggi che includono la produzione di H 2 O 2 e per alcune applicazioni alternative come protocatechuate-diossigenasi protocatechuate sistema deve essere considerato 12. L&#39;utilizzo di un glove box anaerobico rende più facile assicurare condizioni anaerobiche, ma non è essenziale. Ossigeno deve essere rimosso dal circuito di flusso del stopped-flow, come si vuole l&#39;enzima di ridurre in assenza di ossigeno o di reagire con ossigeno a concentraziones che abbiamo specificato. Sebbene il stopped-flow è nel vano portaoggetti, vi è ossigeno nel circuito di flusso se usato buffer aerobiche in esperimenti precedenti. Oltre alle misurazioni di assorbanza, saggi di dicroismo circolare e fluorescenza può essere eseguita in Applied Photophysics SX20 stopped-flow spettrofotometro con relativi accessori.

<table border="1"><tbody><tr><td> Attrezzatura generale di laboratorio </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> Pompa del vuoto </td><td> Welch </td><td> - </td></tr><tr><td> Büchner fiaschi </td><td> Pescatore </td><td> 70340-500 </td></tr><tr><td> Mescolare bar </td><td> Pescatore </td><td> 14-512-129 </td></tr><tr><td> Mescolare piastre </td><td> Pescatore </td><td> 11-100-49S </td></tr><tr><td> Schlenk linee </td><td> Kontes Glass </td><td> - </td></tr><tr><td> Serbatoio di Argon </td><td> Airgas </td><td> AR UPC300 </td></tr><tr><td> Serbatoio di azoto </td><td> Airgas </td><td> NI200 </td></tr><tr><td> Azoto serbatoio, ultra elevato grado di purezza </td><td> Airgas </td><td> NI UHP200 </td></tr><tr><td> Serbatoio di ossigeno </td><td> Airgas </td><td> OX 40 </td></tr><tr><td> 5% di idrogeno equilibrio serbatoio di azoto </td><td> Airgas </td><td> X02NI95B200H998 </td></tr><tr><td> SX20 Stop-flow spettrofotometro </td><td> AppliedPhotophysics </td><td> - </td></tr><tr><td> Glove box </td><td> Schivo </td><td> - </td></tr><tr><td> Bagnomaria </td><td> Brinkmann Lauda </td><td> - </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Forniture </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 50 mL tubi BD Falcon </td><td> Pescatore </td><td> 14-432-23 </td></tr><tr><td> 15 mL tubi conici BD Falcon </td><td> Pescatore </td><td> 05-527-90 </td></tr><tr><td> 1.5 mL microcentrifuga Eppendorf tubi </td><td> Pescatore </td><td> 05-402-18 </td></tr><tr><td> 50 e 25 flaconi di vetro ml </td><td> Pescatore </td><td> 06-402 </td></tr><tr><td> Tappi di gomma </td><td> Pescatore </td><td> 06-447H </td></tr><tr><td> Alluminio guarnizioni </td><td> Pescatore </td><td> 06-406-15 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Reagents </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Fosfato di potassio, monobasico </td><td> Pescatore </td><td> AC2714080025 </td></tr><tr><td> Fosfato di potassio, dibasico </td><td> Pescatore </td><td> P288-500 </td></tr><tr><td> Sodio Acetato </td><td> Sigma </td><td> S-2889 </td></tr><tr><td> Glucosio ossidasi da A. Niger </td><td> Sigma </td><td> G7141-250KU </td></tr><tr><td> D-Glucosio </td><td> Pescatore </td><td> D16-500 </td></tr><tr><td> β-NADPH </td><td> Pescatore </td><td> ICN10116783 </td></tr><tr><td> L (+)-ornitina cloridrato </td><td> Pescatore </td><td> ICN10116783 </td></tr></tbody></table>

monitoraggio dei riduttivo e ossidativa semireazioni di flavin-dependent monoossigenasi con stopped-flow spettrofotometria

Monitoring the Reductive and Oxidative Half-Reactions of a Flavin-Dependent Monooxygenase using Stopped-Flow Spectrophotometry

Aspergillus fumigatus sideroforo A (Sida) è una monoossigenasi contenente FAD che catalizza l&#39;idrossilazione della ornitina nella biosintesi di siderofori idrossamato che sono essenziali per la virulenza (ad es ferricrocin o N &#39;, N &quot;, N&#39;&#39;&#39;-triacetylfusarinine C) 1. La reazione catalizzata da Sida può essere divisa in riduttive e ossidativo semireazioni (Schema 1). Nella riduttiva semi-reazione, la FAD legato ossidato Sida A f, è ridotta NADPH 2,3. Nella ossidativo semireazione , il cofattore ridotta reagisce con l&#39;ossigeno molecolare per formare un C4a-hydroperoxyflavin intermedio, che trasferisce un atomo di ossigeno per ornitina. Qui, si descrive un procedimento per misurare le tariffe e rilevare le forme spettrali differenti di Sida utilizzando un stopped-flow strumento installato uno glove box anaerobico. Nel stopped-flow strumento, piccoli volumi di reagenti sono rapidamente mista, e dopo che il flusso viene interrotto da thsiringa e arresto (figura 1), le variazioni spettrali della soluzione posta nella cella di osservazione sono registrate nel tempo. Nella prima parte dell&#39;esperimento, si mostra come possiamo usare il stopped-flow strumento in modalità singola, in cui la riduzione anaerobica della flavina in A Sida f da NADPH viene misurata direttamente. Abbiamo quindi utilizzare doppie impostazioni di miscelazione dove A Sida f è prima anaerobicamente ridotto di NADPH per un determinato periodo di tempo in un ciclo di invecchiamento, e poi fatto reagire con ossigeno molecolare in cella di osservazione (Figura 1). Per eseguire questo esperimento, buffer anaerobiche sono necessari perché quando solo la metà riduttiva reazione viene controllata, l&#39;ossigeno nelle soluzioni reagirà con il cofattore ridotta flavina e formano un C4a-hydroperoxyflavin intermedio che infine decadono indietro nel ossidato flavina . Ciò non consente all&#39;utente di misurare accuratamente tassi di riduzione poiché non vi sarebbe turnover completa del EnzYME. Quando il ossidativo semireazione viene studiato l&#39;enzima deve essere ridotto in assenza di ossigeno in modo che solo le passi tra riduzione e ossidazione sono osservati. Uno dei buffer utilizzati in questo esperimento è saturo di ossigeno in modo da poter studiare la ossidativo semi-reazione a concentrazioni più elevate di ossigeno. Questi sono spesso le procedure eseguite quando si studia sia le ossidativi o riduttivi semireazioni con flavina contenenti monossigenasi. La scala di tempo dei pre-steady state sperimentazioni condotte con la stopped-flow è millisecondi a secondi, che consentono la determinazione di costanti di velocità intrinseche e il rilevamento e l&#39;identificazione di intermedi nella reazione 4. Le procedure qui descritte possono essere applicate ad altri flavina-dipendenti monossigenasi. 5,6

Si descrivono l&#39;uso di un stopped-flow strumento per studiare sia riduttive e ossidativo semireazioni di<em&gt; Aspergillus fumigatus</em&gt; Sideroforo A (Sida), un flavina-dipendente monoossigenasi. Abbiamo poi mostrano gli spettri corrispondenti alle specie di cui la reazione di Sida e calcolare le costanti di velocità per la loro formazione.

Monitoraggio dei riduttivo e ossidativa semireazioni di Flavin-Dependent monoossigenasi con Stopped-Flow Spettrofotometria

La siderofora A (SidA) di Aspergillus fumigatus è una monoossigenasi contenente FAD che catalizza l'idrossilazione dell'ornitina nella biosintesi di ...

Questa procedura utilizza uno strumento a flusso arrestato per rilevare le diverse forme spettrali della SID A e misurare le velocità. La reazione catalizzata dalla SID A può essere suddivisa in semireazioni riduttive e ossidative del FAD. Il flavina ossidato si lega al N-A-D-P-H e reagisce formando il flavina ridotto e NADP più; la reazione con l'ossigeno molecolare e il legame dell'ornitina portano alla formazione del C quattro.Un flavina idrossilata dopo l'idrossilazione dell'ornitina, la flavina idrossilata si disidrata per formare l'enzima ossidato. NA DP+ rimane legato per tutto il ciclo catalitico ed è l'ultimo substrato ad essere rilasciato. Lo strumento a flusso arrestato consente una rapida miscelazione di piccoli volumi di reagenti e la registrazione.Le variazioni spettrali nel tempo consentono di misurare, mediante spettrofotometria, la velocità di formazione e di scomparsa di intermedi transitori in una reazione catalizzata da enzimi. Due membri del mio laboratorio, Rita Robinson ed Enviro Romero, dimostreranno questi esperimenti utilizzando il sistema modello della flavina monoossigenasi. Versare 250 millilitri di tampone fosfato di potassio 100 millimolare in un matraccio di Büchner da 500 millilitri contenente una barretta magnetica.Sigillare il matraccio con un tappo di gomma, quindi posizionarlo su una piastra magnetica e collegare il tubo corto del matraccio a una linea di vuoto. Degasare il tampone sotto vuoto per un'ora a temperatura ambiente con agitazione, seguito da un risciacquo con argon. Ripetere cinque volte.Infine, risciacquare il pallone con Argon per 10 secondi. Scollegare il pallone dalla linea vuoto e posizionarlo all'interno della camera a gas inerte. Continuare a mescolare energeticamente lasciando il pallone aperto.Riempire le siringhe del serbatoio con soluzioni di glucosio ossidasi a 18,13 unità per millilitro e di glucosio a 100 millimoli per litro. Impostare ora le valvole di avanzamento sulla posizione di caricamento. Riempire le siringhe di avanzamento.Successivamente, ruotare la valvola F in posizione di avanzamento. Utilizzando il software di controllo Pro Data, fare clic su "svuota la siringa di arresto", quindi spingere il tampone dalla siringa di avanzamento F attraverso il circuito di flusso aumentando manualmente il relativo pistone di avanzamento. Proseguire con le altre tre siringhe di avanzamento, equilibrando per un'ora.Ora ricaricare le siringhe del serbatoio e ripetere il lavaggio del sistema a flusso arrestato. Per preparare il tampone saturato di ossigeno, far gorgogliare la soluzione con ossigeno al 100% per un'ora con agitazione.Quindi rimuovere l'ago corto dalla fiala e attendere 10 secondi. Procedere rimuovendo l'ago lungo e posizionare la fiala chiusa nella cappa a flusso laminare. Per la soluzione di N-A-D-P-H.Posizionare un tubo einor da 1,5 millilitro contenente un milligrammo di N-A-D-P-H all'interno della camera a guanti. Sciogliere in 300 microlitri di tampone fosfato di potassio 100 millimolare anaerobico, pH 7,5.Rimuovere 30 microlitri per determinare la concentrazione di N-A-D-P-H. Per rimuovere l'ossigeno dalla soluzione enzimatica, trasferire la soluzione in un vial da 25 millilitri contenente un’asta magnetica, un tappo con setto in gomma e un sigillo in alluminio. Posizionare sul ghiaccio.Collegarsi a una linea a vuoto, quindi sottoporre a degasaggio mediante vuoto per 20 minuti, seguito da un risciacquo con argon. Infine, risciacquare il vial con argon per 10 secondi e scollegarlo dalla linea di vuoto. Posizionare il vial sul ghiaccio all'interno della camera a guanti.Nella finestra del pannello di controllo del software di controllo pro data, selezionare l'array di fotodiodi, il trigger esterno e la scala logaritmica. Avviare inoltre il software pro data viewer e definire la directory per l'archiviazione dei file di dati.Ora sostituire la soluzione nelle siringhe del serbatoio C e F con tampone fosfato di potassio 100 millimolare anaerobico a pH 7,5. Ruotare le valvole C e F sulla posizione di avanzamento. Fare clic su "svuota la siringa di arresto" nel software di controllo Pro Data.Quindi spingere il tampone da entrambe le siringhe di avanzamento attraverso il circuito di flusso manualmente innalzando il relativo pistone di avanzamento. Ripetere il risciacquo con le siringhe del serbatoio C e F altre tre volte. Per assicurare la rimozione completa della glucosio ossidasi dal circuito di flusso, procedere facendo clic su baseline nel software di controllo dei dati pro.Sostituire la soluzione nella siringa del serbatoio F con la soluzione enzimatica. Ruotare la valvola F in posizione di avanzamento. Fare clic su "svuota la siringa di arresto" nel software di controllo Pro Data.Spingere la soluzione enzimatica dalla siringa motrice F attraverso il circuito di flusso sollevando manualmente il relativo pistone motore. Tornare al software di controllo pro data e impostare il tempo di acquisizione a 60 secondi. Verificare che entrambe le siringhe motrici siano riempite con le rispettive soluzioni e che i pistoni motori siano a contatto con i pistoni delle siringhe motrici.Posizionare entrambe le valvole sulla posizione di azionamento e fare clic su acquisisci nel software di controllo Pro Data per eseguire l'azionamento. Acquisire i dati spettrali della forma ossidata dell'enzima in triplice replicato utilizzando il valore di A 4 52 nanometri ottenuto dagli azionamenti. Determinare la concentrazione dell'enzima prima del mescolamento e preparare quattro millilitri di soluzione di N-A-D-P-H.Con una concentrazione 1,5 volte superiore, riempire la siringa del serbatoio C con la soluzione di N-A-D-P-H e svuotare e riempire nuovamente la siringa di arresto per tre volte, come mostrato in precedenza. Ora, acquisire gli spettri durante la riduzione dell'enzima, lavando il contenuto dal circuito di flusso con tampone fosfato di potassio anaerobico 100 millimolare a pH 7,5. Ora fare clic su baseline nel software di controllo dati pro.Quindi mescolare 200 microlitri di soluzione madre dell'enzima con 1000 microlitri di tampone fosfato di potassio anaerobico 100 millimolare, pH 7,5. Sostituire la soluzione nella siringa del serbatoio A con la soluzione enzimatica.Portare la valvola A sulla posizione di avanzamento nel software di controllo Pro Data. Cliccare su siringa arresto vuota. Spingere la soluzione enzimatica dalla siringa di avanzamento A attraverso il circuito di flusso sollevando manualmente il relativo pistone di avanzamento.Impostare il tempo di ritardo a 0,5 secondi e il tempo di acquisizione a 60 secondi. Verificare che tutte le siringhe di alimentazione siano piene delle rispettive soluzioni e che i pistoni di alimentazione siano a contatto con i pistoni delle siringhe di alimentazione. Successivamente, posizionare tutte le valvole di alimentazione sulla posizione di alimentazione e fare clic su acquisisci nel software di controllo pro data.Ottenere i dati spettrali della forma ossidata dell'enzima in triplice replicato. Successivamente, sostituire la soluzione nella siringa del serbatoio B con una soluzione di N-A-D-P-H, 1,5 volte più concentrata rispetto alla soluzione enzimatica nella siringa A. Ruotare la valvola B in posizione di avanzamento e svuotare e riempire nuovamente la siringa di arresto per tre volte, come mostrato in precedenza nella finestra del pannello di controllo.Impostare il tempo di ritardo a 0,5 secondi. Dopo un'acquisizione di 20 secondi, sostituire la soluzione nella siringa del serbatoio con il tampone ossigenato. Ruotare la valvola C in posizione di avanzamento.Effettuare tre risciacqui nel software di controllo pro data. Impostare il tempo di ritardo a 15 secondi e il tempo di acquisizione a 900 secondi. Continuare ad acquisire gli spettri durante la ri-ossidazione dell'enzima completamente ridotto nello strumento a flusso arrestato.La riduzione anaerobica di SID A con N-A-D-P-H può essere monitorata misurando i cambiamenti nello stato redox della flavina utilizzando l'assorbanza a 452 nm. I cambiamenti spettrali vengono registrati nel tempo, dall'SID A ossidato allo spettro finale di SID A completamente ridotto. La velocità di questo passo enzimatico può essere determinata adattando i dati all'equazione appropriata. La velocità di ossidazione e gli intermedi della reazione possono essere inoltre determinate utilizzando la modalità di doppia miscelazione del flusso arrestato in questa reazione mediante AF Sid A. L'intermedio idrossi flavinico C quattro A è chiaramente rilevato con un lambda max di 380 nanometri, mentre l'enzima ossidato presenta un lambda max di 450 nanometri.Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in quattro-sei ore se eseguita correttamente. Ricordarsi di garantire che le soluzioni siano anaerobiche. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come indagare sia l'ione relativo che quello ulcerativo di FLA in ulteriori esperimenti a valle, come la chimica rapida.Quentin può contribuire a chiarire la triste natura degli intermedi.

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Fonte:Elettra Leo1, Luiza H.D. Cardoso1, Sabine Schmitt1, Erich Gnaiger11Strumenti OroborosQuesto video spiega come il flusso di ossigeno viene utilizzato per valutare la respirazione mitocondriale nelle cellule di mammifero viventi e permeabilizzate. Dimostra l'uso sequenziale della digitonina, dei substrati metabolici, dell'ADP, di un disaccoppiatore e di un inibitore per caratterizzare diversi stati respiratori. Il profilo del flusso di ossigeno risultante rivela la funzione mitocondriale e...

Misure del flusso di ossigeno per valutare la respirazione mitocondriale in cellule viventi e permeabilizzate

I mitocondri contengono parecchi enzimi flavina-dipendenti in grado di produrre le specie reattive dell'ossigeno (ROS). Monitoraggio ROS rilascio dai singoli siti nei mitocondri è difficile a causa di reazioni collaterali indesiderate. Presentiamo un metodo semplice e poco costoso per valutazione diretta delle tariffe native per rilascio ROS mediante flavoenzymes purificata e micropiastre fluorometria.

Misura simultanea di perossido di idrogeno/del superossido e produzione di NADH di Flavin-contenente deidrogenasi mitocondriale

Qui presentiamo un protocollo per la purificazione della proteina anaerobica, la concentrazione di proteina anaerobica e successiva caratterizzazione cinetica utilizzando un sistema di elettrodi di ossigeno. Il metodo è illustrato utilizzando l'enzima Giuroma90, un enzima diossigenasi che è più stabile e attivo quando purificato e conservati in un ambiente anaerobico.

Purificazione della proteina anaerobica e analisi cinetica tramite elettrodo di ossigeno per lo studio di inibizione e attività di Dioxygenase di Giuroma90

Qui, presentiamo un protocollo per studiare il meccanismo molecolare della traslocazione di protoni attraverso le membrane del lipido di liposomi singoli, utilizzando citocromo bo3  come esempio. Combinando elettrochimica e microscopia a fluorescenza, le variazioni del pH in lumen del singole vescicole, contenenti singole o multiple enzima, possono essere rilevati e analizzati singolarmente.

Liposoma singole misurazioni per lo studio degli enzimi di membrana Proton-pompaggio usando microscopia fluorescente ed elettrochimica

La valutazione della fosforilazione ossidativa mediante respirometri ad alta risoluzione è diventata parte integrante dell'analisi funzionale dei mitocondri e del metabolismo energetico cellulare. Qui, presentiamo protocolli per l'analisi del metabolismo energetico cellulare utilizzando respirometri ad alta risoluzione basati su camera e micropiastre e discutiamo i principali vantaggi di ciascun dispositivo.

Respirometria ad alta risoluzione per valutare la bioenergetica nelle cellule e nei tessuti utilizzando respirometri a camera e a piastre

Qui, proponiamo un protocollo sistematizzato, accessibile e riproducibile per rilevare le specie reattive dell'ossigeno cellulare (ROS) utilizzando la sonda di diacetato 2′,7′-diclorofluoresceina (DCFH-DA) nelle cellule gliali di Müller (MMC). Questo metodo quantifica i livelli totali di ROS cellulare con un citometro a flusso. Questo protocollo è molto facile da usare, adatto e riproducibile.

Quantificazione di specie reattive dell'ossigeno utilizzando la sonda di diacetato di 2′,7′-diclorofluoresceina e la citometria a flusso nelle cellule gliali di Müller

Qui presentiamo un protocollo per inattivare i batteri patogeni con specie reattive dell'ossigeno prodotte durante la fotolisi del mononucleotide flavina (FMN) sotto irradiazione di luce blu e viola di bassa intensità. La fotolisi FMN ha dimostrato di essere un metodo semplice e sicuro per i processi sanitari.

Inattivazione di agenti patogeni tramite fotolisi in luce visibile della riboflavina-5′-fosfato

Qui, presentiamo una raccolta di saggi per misurare direttamente la funzione mitocondriale nelle cellule di mammifero indipendentemente dalla loro capacità di consumare ossigeno molecolare.

Saggi indipendenti dall'ossigeno per misurare la funzione mitocondriale nei mammiferi

Qui presentiamo un protocollo di respirometria ad alta risoluzione per analizzare la bioenergetica nei moscerini della frutta mutanti PINK1B9-null. Il metodo utilizza il protocollo SUIT (Substrate-Uncoupler-Inhibitor-Titration).

Analisi della funzione mitocondriale in un mutante PINK1B9-null di Drosophila melanogaster utilizzando la respirometria ad alta risoluzione

Questo studio introduce una metodologia per lo studio degli effetti degli xenobiotici sulla funzione mitocondriale tramite saggi respirometrici ed enzimatici. Esamina la modulazione della catena di trasporto degli elettroni in varie specie, offrendo approfondimenti per lo sviluppo mirato di biopesticidi contro le malattie trasmesse da insetti vettori.

Svelare il trasporto e gli effetti degli xenobiotici nei mitocondri isolati: approfondimenti da saggi respirometrici ed enzimatici

Scopri la spettroscopia stopped-flow per analizzare le semireazioni riduttive e ossidative di SidA, una monoossigenasi dipendente dal flavine. Questo metodo permette di misurare le costanti cinetiche degli intermedi enzimatici.

Monitoraggio dei riduttivo e ossidativa semireazioni di Flavin-Dependent monoossigenasi con Stopped-Flow Spettrofotometria

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