Monitoraggio dei riduttivo e ossidativa semireazioni di Flavin-Dependent monoossigenasi con Stopped-Flow Spettrofotometria

Questa procedura utilizza uno strumento a flusso arrestato per rilevare le diverse forme spettrali della SID A e misurare le velocità. La reazione catalizzata dalla SID A può essere suddivisa in semireazioni riduttive e ossidative del FAD. La flavina ossidata si lega all'N-A-D-P-H e reagisce formando flavina ridotta e NADP più; la reazione con l'ossigeno molecolare e il legame dell'ornitina portano alla formazione del C quattro.

Un flavina idrossilata, successivamente all'idrossilazione dell'ornitina, la flavina idrossilata si disidrata per formare l'enzima ossidato. NA DP+ rimane legato per tutto il ciclo catalitico ed è l'ultimo substrato ad essere rilasciato. Lo strumento a flusso arrestato consente il rapido mescolamento di piccoli volumi di reagenti e la registrazione della reazione.

Le variazioni spettrali nel tempo registrate da uno spettrofotometro a flusso consentono di misurare la velocità di formazione e di scomparsa di intermedi transitori in una reazione catalizzata da enzimi. Due membri del mio laboratorio, Rita Robinson ed Enviro Romero, dimostreranno questi esperimenti utilizzando il sistema modello della flavina monoossigenasi. Versare 250 millilitri di tampone fosfato di potassio 100 millimolare in un matraccio di Büchner da 500 millilitri contenente una barretta magnetica.

Sigillare il pallone con un tappo di gomma, quindi posizionarlo su una piastra agitatrice e collegare il tubo corto del pallone a una linea a vuoto. Degasare il tampone sotto vuoto per un'ora a temperatura ambiente con agitazione, seguito da un risciacquo con argon. Ripetere cinque volte.

Infine, sciacquare il pallone con Argonne per 10 secondi. Scollegare il pallone dal manifold a vuoto e posizionarlo all'interno della camera a gas inerte. Continuare a mescolare energeticamente con il pallone aperto.

Riempire le siringhe del serbatoio con soluzioni di glucosio ossidasi a 18,13 unità per millilitro e di glucosio a 100 millimoli. Impostare ora le valvole di comando sulla posizione di caricamento. Riempire le siringhe di comando.

Successivamente, ruotare la valvola F in posizione di avanzamento. Utilizzando il software di controllo Pro Data, fare clic su "svuota la siringa di arresto", quindi spingere il tampone dalla siringa di avanzamento F attraverso il circuito di flusso aumentando manualmente il relativo pistone di avanzamento. Proseguire con le altre tre siringhe di avanzamento, equilibrando per un'ora.

Ora ricaricare le siringhe del serbatoio e ripetere il lavaggio del sistema a flusso interrotto. Per preparare il tampone saturato di ossigeno, far gorgogliare la soluzione con ossigeno al 100% per un'ora con agitazione.

Quindi rimuovere l'ago corto dalla fiala e attendere 10 secondi. Procedere rimuovendo l'ago lungo e posizionare la fiala chiusa nella cappa a flusso laminare. Per la soluzione di N-A-D-P-H.

Posizionare un tubo einor da 1,5 millilitro contenente un milligrammo di N-A-D-P-H all'interno della camera a guanti. Sciogliere in 300 microlitri di tampone fosfato di potassio 100 millimolare anaerobico, pH 7,5.

Rimuovere 30 microlitri per determinare la concentrazione di N-A-D-P-H. Per rimuovere l'ossigeno dalla soluzione enzimatica, trasferire la soluzione in un vial da 25 millilitri contenente un’asta magnetica, un tappo con guarnizione in teflon e chiusura in alluminio. Posizionare sul ghiaccio.

Collegarsi a una linea schlink, quindi sottoporre a degasaggio sotto vuoto per 20 minuti, seguito da un risciacquo con argon. Infine, risciacquare il vial con argon per 10 secondi e scollegarlo dalla linea a vuoto. Posizionare il vial sul ghiaccio all'interno della camera a guanti.

Nella finestra del pannello di controllo del software di controllo Pro Data, selezionare l'array di fotodiodi, il trigger esterno e la scala logaritmica. Avviare inoltre il software Pro Data Viewer e definire la directory per l'archiviazione dei file di dati.

Ora sostituire la soluzione nelle siringhe del serbatoio C e F con tampone fosfato di potassio anaerobico 100 millimolare a pH 7,5. Ruotare le valvole C e F in posizione di avanzamento. Fare clic su "svuota la siringa di arresto" nel software di controllo Pro Data.

Quindi spingere il tampone da entrambe le siringhe di alimentazione attraverso il circuito di flusso sollevando manualmente il relativo pistone di spinta. Ripetere il lavaggio con le siringhe del serbatoio C e F altre tre volte. Per garantire la completa rimozione della glucosio ossidasi dal circuito di flusso, procedere facendo clic su baseline nel software di controllo dati pro.

Sostituire la soluzione nella siringa del serbatoio F con la soluzione enzimatica. Ruotare la valvola F in posizione di avanzamento. Fare clic su "svuota la siringa di arresto" nel software di controllo Pro Data.

Spingere la soluzione enzimatica dalla siringa motrice F attraverso il circuito di flusso sollevando manualmente il relativo pistone motore. Tornare al software di controllo pro data e impostare il tempo di acquisizione a 60 secondi. Verificare che entrambe le siringhe motrici siano riempite con le rispettive soluzioni e che i pistoni motori siano a contatto con i pistoni delle siringhe motrici.

Portare entrambe le valvole in posizione di azionamento e fare clic su acquisisci nel software di controllo pro data per eseguire l'azionamento. Acquisire i dati spettrali della forma ossidata dell'enzima in triplice replicato utilizzando il valore di A 4 52 nanometri ottenuto dagli azionamenti. Determinare la concentrazione dell'enzima prima del mescolamento e preparare quattro millilitri di soluzione di N-A-D-P-H.

Utilizzare una siringa del serbatoio riempitrice C con una soluzione di N-A-D-P-H 1,5 volte più concentrata ed eseguire lo svuotamento e il ripieno della siringa di arresto per tre volte come mostrato in precedenza. Ora, acquisire gli spettri durante la riduzione dell'enzima, lavando il contenuto dal circuito di flusso con tampone fosfato di potassio 100 millimolare anaerobico a pH 7,5. A questo punto, fare clic su linea di base nel software di controllo dati Pro.

Quindi mescolare 200 microlitri di soluzione madre dell'enzima con 1000 microlitri di tampone fosfato di potassio anaerobico 100 millimolare, pH 7,5. Sostituire la soluzione nella siringa del serbatoio A con la soluzione enzimatica.

Portare la valvola A sulla posizione di avanzamento nel software di controllo Pro Data. Cliccare su siringa arresto vuota. Spingere manualmente la soluzione enzimatica dalla siringa di avanzamento A attraverso il circuito di flusso sollevando manualmente il relativo pistone di avanzamento.

Impostare il tempo di ritardo a 0,5 secondi e il tempo di acquisizione a 60 secondi. Verificare che tutte le siringhe di alimentazione siano riempite con le rispettive soluzioni e che i pistoni di alimentazione siano a contatto con i pistoni delle siringhe di alimentazione. Quindi posizionare tutte le valvole di alimentazione sulla posizione di alimentazione e fare clic su acquisisci nel software di controllo pro data.

Ottenere i dati spettrali della forma ossidata dell'enzima in triplice replicato. Successivamente, sostituire la soluzione nella siringa del serbatoio B con una soluzione di N-A-D-P-H 1,5 volte più concentrata rispetto alla soluzione enzimatica nella siringa A. Ruotare la valvola B in posizione di avanzamento e svuotare e riempire nuovamente la siringa di arresto per tre volte, come mostrato in precedenza nella finestra del pannello di controllo.

Impostare il tempo di ritardo a 0,5 secondi. Dopo un'acquisizione di 20 secondi, sostituire la soluzione nella siringa del serbatoio con il tampone ossigenato. Ruotare la valvola C in posizione di avanzamento.

Effettuare tre risciacqui nel software di controllo pro data. Impostare il tempo di ritardo a 15 secondi e il tempo di acquisizione a 900 secondi. Continuare ad acquisire gli spettri durante la ri-ossidazione dell'enzima completamente ridotto nello strumento a flusso arrestato.

La riduzione anaerobica di SID A con N-A-D-P-H può essere monitorata misurando le variazioni dello stato redox della flavina utilizzando l'assorbanza a 452 nm. Le variazioni spettrali vengono registrate nel tempo, partendo da SID A ossidata fino allo spettro finale di SID A completamente ridotta. La velocità di questo passaggio enzimatico può essere determinata adattando i dati all'equazione appropriata. La velocità di ossidazione e gli intermedi della reazione possono essere determinate anche utilizzando la modalità di miscelazione doppia del flusso arrestato in questa reazione mediante AF Sid A. L'intermedio idrossiflavina C quattro A è chiaramente rilevato con un lambda max di 380 nanometri, mentre l'enzima ossidato presenta un lambda max di 450 nanometri.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in quattro-sei ore se eseguita correttamente. Ricordarsi di verificare che le soluzioni siano anaerobiche. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come indagare sia il rapporto che l'ione ulcera dell'FLA indipendente mono in ulteriori esperimenti a valle come la chimica rapida.

Quentin può contribuire a chiarire la triste natura degli intermedi.