Riprogrammare cellule somatiche umane in cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) Utilizzo vettore retrovirale con GFP

L'obiettivo generale di questa procedura è generare cellule iPS umane mediante sovraespressione mediata da retrovirus di OCT4, SOX2, KLF4 e c-MYC, utilizzando un sistema reporter GFP. Questo viene ottenuto innanzitutto aggiungendo la quantità appropriata di retrovirus individuali esprimenti GFP. Successivamente, le cellule infettate con il virus esprimente GFP vengono trasferite in piastre rivestite con gelatina 0,1% in presenza di fibroblasti embrionali di topo.

Il terzo passaggio della procedura consiste nel sostituire il mezzo con del mezzo di coltura per cellule staminali embrionali umane. Infine, vengono isolate le colonie IPS con GFP silenziato che mostrano una morfologia simile a quella delle cellule staminali embrionali umane. In definitiva, i risultati mostrano l'espressione di marcatori pluripotenti endogeni mediante colorazione immunofluorescente e R-T-Q-P-C-R.

Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la colorazione vitale con marcatori di superficie pluripotenti e l'osservazione di un cambiamento morfologico, è l'iPad desiderabile. Le colonie cellulari possono essere facilmente isolate utilizzando la perdita di espressione di GFP come marcatore per le cellule pluripotenti per iniziare la coltura. Coltivare i fibroblasti umani nel mezzo per fibroblasti un giorno prima dell'infezione, seminando una volta 10 alla quinta fibroblasti umani in un pozzetto di una piastra a sei pozzetti. Il giorno successivo, aspirare il mezzo per rimuovere le cellule morte e aggiungere due millilitri di mezzo fresco per fibroblasti contenente cinque microgrammi per millilitro di solfato di protamina.

Quindi aggiungere con attenzione la quantità appropriata di ciascun virus esprimente GFP corrispondente a una multiplicità di infezione di cinque. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius durante la notte un giorno dopo l'infezione. Rimuovere il sopranatante virale e lavare tre volte con due millilitri di PBS.

Quindi aggiungere due millilitri di mezzo per fibroblasti tre giorni dopo l'infezione. Verificare la fluorescenza di GFP e reintegrare la pozzetta con due millilitri di mezzo per fibroblasti. Il giorno successivo, piastrare una volta 10 alla quarta per centimetro quadrato di fibroblasti embrionali di topo irradiati o cellule feeder meth in mezzo per fibroblasti su una piastra Petri da 10 centimetri rivestita con Gelatina 0,1%.

Incubare le cellule a 37 gradi Celsius durante la notte. Il giorno successivo, staccare i fibroblasti umani infetti con un millilitro di tripsina EDTA 0,05% per cinque minuti a 37 gradi Celsius e centrifugare per cinque minuti a 200 G. Ri-sospendere le cellule in 10 millilitri di mezzo per fibroblasti e ripiattare le cellule su gelatina pre-trattata 0,1% con mfs. 24 ore dopo.

Sostituire il mezzo con il mezzo di coltura per cellule staminali embrionali umane (HESC) e cambiare il mezzo ogni giorno. Dopo l'insorgenza di colonie simili a ESC, visibili al microscopio a fluorescenza, si osserveranno colonie di tipo ESC a partire da 20 a 27 giorni dall'infezione. Verificare l'assenza di fluorescenza GFP in una colonia che presenta una morfologia simile a quella delle cellule staminali ematopoietiche (HSC).

Utilizzando una pipetta da 10 microlitri, selezionare singole colonie di IPSC e posizionarle in un pozzetto di una piastra da 12 con rivestimento di gelatina e metile, integrata con mezzo HESC. Cambiare il mezzo ogni giorno e passare le cellule lavando la piastra con un millilitro di DMM F12.

Quindi aggiungere 0,5 millilitri di collagenasi e incubare per 10 minuti a 37 gradi Celsius. Lavare le cellule due volte con DM A MF 12. Successivamente, aggiungere due millilitri di mezzo HESC fresco.

Quindi utilizzare un distaccacellule per frammentare le colonie in piccoli pezzi e staccare le cellule rimanenti dalla piastra. Trasferire i frammenti di colonie risospesi in un pozzetto di una piastra a sei pozzetti rivestita con gelatina e MEF e incubare a 37 gradi Celsius per due giorni.

Per analizzare le cellule mediante immunofluorescenza, lavarle tre volte con PBS e fissarle con paraformaldeide al 4% per 20 minuti a temperatura ambiente. Lavare delicatamente le cellule tre volte con PBS e permeabilizzarle con Triton X-100 allo 0,2% in PBS per 30 minuti.

Bloccare il legame non specifico incubando le cellule con BSA al 3% in PBS per due ore. Successivamente, incubare le cellule con l'anticorpo primario tutta la notte a quattro gradi Celsius. Quindi lavare le cellule tre volte con PBS e incubarle con l'anticorpo secondario per un'ora a temperatura ambiente al buio.

Lavare le cellule tre volte con PBS durante l'ultimo lavaggio. Aggiungere dappy e incubare a temperatura ambiente per cinque minuti. Acquisire le immagini delle cellule utilizzando un microscopio a fluorescenza per analisi quantitativa in tempo reale.

PCR isolare l'RNA totale da IPC umane derivate da fibroblasti umani. Utilizzando un kit di isolamento dell'RNA. Sintetizzare il cDNA del primo filamento utilizzando la trascrittasi inversa.

Quindi utilizzarlo come stampo per la QPCR al fine di rilevare i geni di pluripotenza. I fibroblasti umani BJ, infettati con un cocktail di retrovirus contenenti OCT4, SOX2, KLF4 e c-Myc, mostrano qui le modifiche morfologiche osservate durante il riprogrammamento dal giorno 5. Al giorno 10, 14 e 21, le cellule iniziano a mostrare una morfologia simile a quella delle cellule staminali embrionali umane dopo 21 giorni, e le cellule iPSC sono identificate mediante fluorescenza GFP.

Le cellule staminali pluripotenti, come le ESC e le IPC, esprimono il macchinario molecolare necessario per reprimere l'espressione genica provirale. Tuttavia, i vettori retrovirali utilizzati in questo caso esprimono GFP insieme ai geni di riprogrammazione tramite LTR retrovirali. Pertanto, le cellule che esprimono costantemente GFP sono considerate esprimenti transgeni senza silenziamento genico provirale, come mostrato qui; in modo accurato, le colonie di iPSC riprogrammate che acquisiscono la Rete Molecolare di Pluripotenza mostrano l'assenza di espressione di GFP.

Questa figura mostra l'analisi di immunohistochimica di colonie derivate da fibroblasti Detroit 5 51 con anticorpi contro TRA 180 1, TRA one 60 SSEA four T four e nano, come si può vedere con successo. Gli IPC riprogrammati esprimono tutti questi marcatori. Inoltre, è stata eseguita una R-T-P-C-R quantitativa per analizzare l'espressione genica, rivelando che T four SOX two, KLF four M e nano erano significativamente aumentati rispetto alle cellule fibroblasti parentali, ma paragonabili a quelli delle HSC H nine.

Dopo aver guardato questo video, dovresti avere una buona comprensione di come infettare il virus, identificare e selezionare le cellule IPA completamente programmate con lipidi utilizzando la microscopia fluorescente.