Name: Riprogrammare cellule somatiche umane in cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) Utilizzo vettore retrovirale con GFP (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: Scopri come generare cellule staminali pluripotenti indotte umane utilizzando vettori retrovirali con GFP. Questo metodo consente di identificare facilmente le colonie iPSC attraverso la silenziamento del reporter fluorescente.

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Questo lavoro è stato finanziato dalla Yale School of Medicine e Salute Child Research Award da Charles Hood Foundation.

1. Riprogrammazione da Retrovirus Esprimere Fattori Riprogrammazione <ol><li> Fibroblasti umani vengono coltivate in mezzo di fibroblasti (10% FBS in DMEM con Pen / Strep). </li><li> Un giorno prima dell&#39;infezione, piastra 1x10 5 fibroblasti umani in un pozzetto di una piastra da 6 pozzetti. </li><li> Aspirare il terreno per eliminare le cellule morte e aggiungere 2 ml di terreno di fibroblasti fresco. Aggiungere protammina solfato ad una concentrazione finale di 5 pg / ml. </li><li> Cautela aggiungere la quantità appropriata di ciascun GFP-esprime virus corrispondente ad una molteplicità di infezione (MOI) 5 5. </li><li> Un giorno dopo l&#39;infezione, rimuovere il supernatante virale, lavare tre volte con 2 ml di PBS, quindi aggiungere due medie fibroblasti ml. </li><li> Tre giorni dopo l&#39;infezione, controllare la fluorescenza GFP e riempire il pozzo con 2 ml di terreno di fibroblasti. </li><li> Quattro giorni dopo l&#39;infezione, la piastra 1x10 4 / cm 2 di fibroblasti embrionali di topo irradiati (MEF) in cellule di alimentazione di fibroblasti su un mezzo10-cm Petri rivestito con 0,1% di gelatina. Incubare a 37 ° C per una notte. </li><li> Cinque giorni dopo l&#39;infezione, staccare infettati fibroblasti umani con 1 ml di 0,05% typsin / EDTA per 5 minuti a 37 ° C, e centrifugare per 5 minuti a 200 g. Aspirare il mezzo e risospendere le cellule con 10 ml di mezzo fibroblasti. Trasferire le cellule in un pre-rivestito 10-centimetri piastra. </li><li> Dopo 24 ore, sostituire il mezzo con il mezzo hESC cultura (20% Knock-Out sostituzione siero, DMEM/F12, 0,1 ml di aminoacidi non essenziali, 4 ng / ml bFGF, Pen / Strep / glutammato, beta-merceptoethanol). Cambia il mezzo di tutti i giorni. ESC-colonie, come inizierà ad apparire di giorno 20-27 dopo l&#39;infezione. </li></ol> 2. Isolamento ed espansione di iPSCs <ol><li> Sotto un microscopio a fluorescenza, verificare l&#39;assenza di fluorescenza GFP in una colonia che mostra una morfologia simile a hESC. </li><li> Usando una pipetta 10 pl, raccogliere le singole colonie IPSC e inserirli in un pozzetto di una gelatina e MEF-CoATed 12-pozzetti e integrato con media hESC. Cambiare media giornaliera. </li><li> Per passaging, lavare la piastra con 1 ml di DMEM/F12, quindi aggiungere 0,5 ml di collagenasi, e incubare per 10 minuti a 37 ° C. </li><li> Lavare le cellule due volte con DMEM/F12. </li><li> Aggiungere 2 ml di terreno fresco hESC. Utilizzando un sollevatore cella, rompere le colonie in piccoli pezzi e staccare le cellule rimanenti dalla piastra. </li><li> Trasferire i pezzi di colonie risospeso in un pozzetto di una gelatina e MEF rivestita piastra da 6 pozzetti. </li></ol> 3. Analisi Immunofluorescenza di marcatori pluripotenti <ol><li> Lavare le cellule tre volte con PBS e fissare con 4% paraformaldeide per 20 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Lavare delicatamente le cellule tre volte con PBS e permeabile con 0,2% Triton X-100 in PBS per 30 min. </li><li> Blocco legame non specifico incubando le cellule con 3% BSA in PBS per due ore. </li><li> Incubare le cellule con anticorpo primario per una notte a 4 ° C. </li> &lt;li&gt; Lavare le cellule tre volte con PBS e incubare le cellule con anticorpo secondario specifico per un&#39;ora a temperatura ambiente, schermatura dalla luce. </li><li> Lavare le cellule tre volte con PBS e add DAPI durante l&#39;ultimo lavaggio seguito da incubazione a temperatura ambiente per 5 minuti. </li><li> Rilevare la colorazione con un microscopio a fluorescenza. </li></ol> 4. Quantitativa Real-time PCR per i marker pluripotenti <ol><li> Isolare RNA totale dalle iPSCs umane derivate da fibroblasti umani usando il kit RNeasy Qiagen. </li><li> Sintetizzare il primo filamento cDNA utilizzando trascrittasi inversa SuperScript II. </li><li> Eseguire qPCR per individuare i geni pluripotenziali usando i primer riportati in precedenza. 6 </li></ol> 5. Risultati rappresentativi <ol><li> Cambiamento morfologico durante la riprogrammazione Noi fibroblasti umani infettati BJ1 e Detroit 551 con un cocktail di retrovirus che trasportano Oct4, Sox2, Klf4 e MYC,e sono stati in grado di rilevare i cambiamenti morfologici durante riprogrammazione (Figura 1). Ventun giorni dopo l&#39;infezione, riconosciamo piccole colonie IPSC dalla loro hESC-come morfologia. Inoltre, riconosciamo iPSCs dalla fluorescenza GFP. Le cellule staminali pluripotenti, come CES e iPSCs, esprimono il macchinario molecolare di reprimere l&#39;espressione genica provirale 7-9. Il nostro unico vettore retrovirale esprime GFP insieme riprogrammazione geni LTR retrovirale. Così, le cellule esprimenti GFP continuo sono considerati per esprimere transgeni senza silenziamento genico provirale. Fedelmente riprogrammati colonie IPSC che acquisiscono la rete pluripotenza molecolare dimostrare l&#39;assenza di espressione di GFP (Figura 2) 10. </li><li> Caratterizzazione della pluripotenza delle iPSCs umani Abbiamo analizzato le colonie derivate da Detroit-551 fibroblasti via immunoistochimica con Tra-1-81, Tra-1-60, SSEA-4, SSE-3, e gli anticorpi OCT4 Nanog ( <strong&gt; Tabella 2). IPSCs successo riprogrammati esprimere tutti questi marcatori (Figura 3A). Abbiamo anche analizzato espressione genica tramite RT-PCR quantitativa analisi. Abbiamo osservato che l&#39;espressione di Oct4, Sox2, Klf4, MYC e Nanog era significativamente maggiore rispetto alle cellule di fibroblasti dei genitori, ma commisurata a quella di hESC H9 (Figura 3B). </li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3804/3804fig1.jpg" /> Figura 1. Cambiamenti morfologici di fibroblasti umani infettati da retrovirus. (AD) progressivo cambiamento morfologico nelle colonie da Detroit-551 fibroblasti infettati con i fattori di riprogrammazione. Giorno 5 (A), Giorno 10 (B), Giorno 14 (C), giorno 21 (D). Le cellule mostrano la hESC-come morfologia dopo 21 giorni. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3804/3804fig2.jpg" /> Figura 2. Rappresentante espressione fluorescente GFP in cellule in fase di riprogrammazione. </strong&gt; BJ e Detroit 551 fibroblasti sono state infettate con retrovirus che esprime quattro fattori di riprogrammazione 4, e incubate in un mezzo hESC per quattro settimane. Fibroblasti BJ (A, B) e Detroit 551 (C, D) mostrano simili morfologica. Dal giorno 21, colonie GFP negativi cominciano a formarsi, che rappresentano le iPSCs buona fede 10. (E, F) mostrano trasformato Detroit 551 cellule che non hanno subito corretta riprogrammazione. (A, C, E) colonie sotto vista a contrasto di fase. (B, D) correttamente riprogrammato cellule che mostrano il silenziamento GFP. (F) espressione GFP luminoso da colonia trasformata. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3804/3804fig3.jpg" /> Figura 3. Caratterizzazione delle cellule staminali pluripotenti indotte umane. (A) 551-umane iPS-K1 colonie di cellule esprimono marcatori comuni alle cellule pluripotenti. Colorazione DAPI indica il contenuto totale delle cellule per campo. (B) quantitativa real time-PCR (RT-qPCR) per l&#39;espressione di Oct4, Sox2, Klf4, MYC in f genitoriibroblast e 551-IPS-K1 iPSCs e H9 cellule staminali embrionali umane (hESC). I dati sono stati normalizzati contro la β-actina gene housekeeping e tracciati rispetto al livello di espressione nelle cellule di fibroblasti parentali 4.

<ol><li>Murry, C. E., Keller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+embryonic+stem+cells+to+clinically+relevant+populations%3A+lessons+from+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Differentiation of embryonic stem cells to clinically relevant populations: lessons from embryonic development.</a> Cell. 132, 661-680 (2008).</li>
<li>Takahashi, K., Tanabe, K., Ohnuki, M., Narita, M., Ichisaka, T., Tomoda, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li>
<li>Yu, J., Vodyanik, M. A., Smuga-Otto, K., Antosiewicz-Bourget, J., Frane, J. L., Tian, S., Nie, J., Jonsdottir, G. A., Ruotti, V., Stewart, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318, 1917-1920 (2007).</li>
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<li>Park, I. H., Lerou, P. H., Zhao, R., Huo, H., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human-induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation of human-induced pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 3, 1180-1186 (2008).</li>
<li>Park, I. H., Zhao, R., West, J. A., Yabuuchi, A., Huo, H., Ince, T. A., Lerou, P. H., Lensch, M. W., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+human+somatic+cells+to+pluripotency+with+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors.</a> Nature. 451, 141-146 (2008).</li>
<li>Hotta, A., Ellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+vector+silencing+during+iPS+cell+induction%3A+an+epigenetic+beacon+that+signals+distinct+pluripotent+states%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Retroviral vector silencing during iPS cell induction: an epigenetic beacon that signals distinct pluripotent states.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 105, 940-948 (2008).</li>
<li>Matsui, T., Leung, D., Miyashita, H., Maksakova, I. A., Miyachi, H., Kimura, H., Tachibana, M., Lorincz, M. C., Shinkai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proviral+silencing+in+embryonic+stem+cells+requires+the+histone+methyltransferase+ESET%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Proviral silencing in embryonic stem cells requires the histone methyltransferase ESET.</a> Nature. 464, 927-931 (2010).</li>
<li>Wolf, D., Goff, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cells+use+ZFP809+to+silence+retroviral+DNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cells use ZFP809 to silence retroviral DNAs.</a> Nature. 458, 1201-1204 (2009).</li>
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<li>Kim, D., Kim, C. H., Moon, J. I., Chung, Y. G., Chang, M. Y., Han, B. S., Ko, S., Yang, E., Cha, K. Y., Lanza, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+direct+delivery+of+reprogramming+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins.</a> Cell Stem Cell. 4, 472-476 (2009).</li>
<li>Warren, L., Manos, P. D., Ahfeldt, T., Loh, Y. H., Li, H., Lau, F., Ebina, W., Mandal, P. K., Smith, Z. D., Meissner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+reprogramming+to+pluripotency+and+directed+differentiation+of+human+cells+with+synthetic+modified+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells with synthetic modified mRNA.</a> Cell Stem Cell. 7, 618-630 (2010).</li>
<li>Ban, H., Nishishita, N., Fusaki, N., Tabata, T., Saeki, K., Shikamura, M., Takada, N., Inoue, M., Hasegawa, M., Kawamata, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+transgene-free+human+induced+pluripotent+stem+cells+%28iPSCs%29+by+temperature-sensitive+Sendai+virus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of transgene-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) by temperature-sensitive Sendai virus vectors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 14234-14239 (2011).</li>
<li>Wolf, D., Goff, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRIM28+mediates+primer+binding+site-targeted+silencing+of+murine+leukemia+virus+in+embryonic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">TRIM28 mediates primer binding site-targeted silencing of murine leukemia virus in embryonic cells.</a> Cell. 131, 46-57 (2007).</li>
<li>Park, I. H., Arora, N., Huo, H., Maherali, N., Ahfeldt, T., Shimamura, A., Lensch, M. W., Cowan, C., Hochedlinger, K., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease-specific+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Disease-specific induced pluripotent stem cells.</a> Cell. 134, 877-886 (2008).</li>
<li>Kim, K. Y., Hysolli, E., Park, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+maturation+defect+in+induced+pluripotent+stem+cells+from+patients+with+Rett+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Neuronal maturation defect in induced pluripotent stem cells from patients with Rett syndrome.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 14169-14174 (2011).</li>
</ol>

<p class="jove_content"&gt; Non abbiamo nulla da rivelare.</p

Espressione di quattro fattori di trascrizione riprogramma i fibroblasti umani a iPSCs. Molti tentativi sono stati fatti per generare iPSCs umani utilizzando non-integrazione o non-genetica approcci per generare iPSCs clinicamente sicuro. Finora, questi metodi presentano efficienza estremamente bassa e richiedono ulteriore ottimizzazione per migliorare la riproducibilità 11-14. Metodi Retro-o lentivirali sono facilmente utilizzati per ricavare e applicare iPSCs per l&#39;uomo in modelli di malattia <...

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12</td><td>Invitrogen</td><td>11330057</td><td>80%</td></tr><tr><td>Sostituto del siero Knockout</td><td>Invitrogen</td><td>10828-028</td><td>20%</td></tr><tr><td>L-Glutammina (200 mM)</td><td>Invitrogen</td><td>25030081</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>Aminoacidi non essenziali (10 mM)</td><td>Invitrogen</td><td>11140050</td><td>0,1 mM</td></tr><tr><td>&amp;#946;-Mercapt&amp;#8211;etanolo (14,3 M) o MTG</td><td>Invitrogen</td><td>M-6250</td><td>0,1 mM</td></tr><tr><td>bFGF-2 10 &amp;mu;g/ml</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>GF003AF</td><td>4 ng/ml</td></tr><tr><td>Penicillina/Streptomicina</td><td>EMD Millipore</td><td>15140-122</td><td>1%</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11965118</td><td>90%</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>10407028</td><td>10%</td></tr><tr><td>Penicillina/Streptomicina</td><td>EMD Millipore</td><td>15140-122</td><td>1%</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Tabella 1. Mezzo di coltura&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>OCT4</td><td>Abcam</td><td>Ab19857</td><td>1:500</td></tr><tr><td>SSEA3</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB4303</td><td>1:100</td></tr><tr><td>SSEA4</td><td>BD Biosciences</td><td>BD560218</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Tra-1-81</td><td>BD Biosciences</td><td>BD560173</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Tra-1-60</td><td>BD Biosciences</td><td>BD560174</td><td>1:100</td></tr><tr><td>NANOG</td><td>Abcam</td><td>Ab21624</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Alexa-Flur 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11008</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>Alexa-Flur 555</td><td>Invitrogen</td><td>A21422</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td>1:5000</td></tr><tr><td>pMIG-OCT4</td><td>Addgene</td><td>17225</td><td></td></tr><tr><td>pMIG-SOX2</td><td>Addgene</td><td>17226</td><td></td></tr><tr><td>pMIG-KLF4</td><td>Addgene</td><td>17227</td><td></td></tr><tr><td>pMIG-MYC</td><td>Addgene</td><td>18119</td><td></td></tr><tr><td>Collagenasi tipo IV</td><td>Invitrogen</td><td>17104019</td><td>1 mg/ml</td></tr><tr><td>Gelatina, suina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G 1890</td><td>0,1%</td></tr><tr><td>Triton</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-500ML</td><td>0,2%</td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47608</td><td>4%</td></tr><tr><td>BSA</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB01800</td><td>3%</td></tr><tr><td>Cellule MEF come cellule nutrici</td><td>EMD Millipore</td><td>PMEF-N</td><td></td></tr><tr><td>Cell Lifter</td><td>Corning</td><td>3008</td><td></td></tr><tr><td>Microscopia a fluorescenza: microscopio invertito con filtro GFP</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Tabella 2. Reagenti e attrezzature&lt;/strong&gt;</td></tr></tbody></table>

riprogrammare cellule somatiche umane in cellule staminali pluripotenti indotte (ipscs) utilizzo vettore retrovirale con gfp

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Cellule staminali embrionali umane (hESC) sono pluripotenti e una fonte inestimabile per cellulari in vitro modelli di malattia e della medicina rigenerativa 1. E &#39;stato precedentemente dimostrato che cellule somatiche umane può essere riprogrammato per pluripotenza dall&#39;espressione ectopica di quattro fattori di trascrizione (Oct4, Sox2, Klf4 e Myc) e diventare cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) 2-4. Come hESC, iPSCs umani sono pluripotenti e una fonte potenziale di cellule autologhe. Qui descriviamo il protocollo per riprogrammare cellule di fibroblasti umani con i quattro fattori di riprogrammazione clonati in GFP-retrovirale contenente backbone 4. Utilizzando il seguente protocollo, generiamo iPSCs umani in 3-4 settimane sotto condizione umana della cultura ESC. Umani colonie IPSC assomigliano hESC nella morfologia e visualizzare la perdita di fluorescenza GFP come risultato di silenziamento del transgene retrovirale. colonie IPSC isolato meccanicamente con un microsco fluorescenzape si comportano in modo simile a come hESC. In queste cellule, si rileva l&#39;espressione di geni multipli pluripotenziali e marcatori di superficie.

Un metodo per generare umani cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) tramite retrovirus-mediata espressione ectopica di Oct4, Sox2, Klf4 e MYC è descritto. Un modo pratico per identificare umani IPSC colonie sulla base di GFP è anche discusso.

Riprogrammare cellule somatiche umane in cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) Utilizzo vettore retrovirale con GFP

Le cellule staminali embrionali umane (hESC) sono pluripotenti e rappresentano una fonte cellulare inestimabile per la modellizzazione delle malattie in vitro e la medicina rigenerativa1. È stato...

L'obiettivo generale di questa procedura è generare cellule iPS umane mediante sovraespressione mediata da retrovirus di OCT4, SOX2, KLF4 e c-MYC, utilizzando un sistema reporter GFP. Questo viene ottenuto innanzitutto aggiungendo la quantità appropriata di retrovirus individuali esprimenti GFP. Successivamente, le cellule infettate con il virus esprimente GFP vengono trasferite in piastre rivestite con gelatina 0,1% in presenza di fibroblasti embrionali di topo.Il terzo passaggio della procedura consiste nel sostituire il mezzo con del mezzo di coltura per cellule staminali embrionali umane. Infine, vengono isolate le colonie IPS con GFP silenziato che mostrano una morfologia simile a quella delle cellule staminali embrionali umane. In definitiva, i risultati mostrano l'espressione di marcatori pluripotenti endogeni mediante colorazione immunofluorescente e R-T-Q-P-C-R.Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la colorazione vitale con marcatori di superficie pluripotenti e l'osservazione di un cambiamento morfologico, è l'iPad desiderabile. Le colonie cellulari possono essere facilmente isolate utilizzando la perdita di espressione di GFP come m

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Questo video mostra la procedura per la generazione di cellule staminali pluripotenti indotte con lentivirus inducibile che esprimono Oct4, Sox2, c-Myc e Klf4.

Generare cellule iPS dal MEF attraverso l&#39;espressione forzata di Sox-2, Oct-4, c-Myc e Klf4

Il Stemgent inducibile Dox Mouse Set TF Lentivirus possibile riprogrammare i fibroblasti embrionali di topo (MEF) per pluripotenti indotte staminali (iPS), cellule. Qui mostriamo il protocollo per DOX-inducibile espressione di fattori di trascrizione del mouse riprogrammazione Oct4, Sox2, Klf4 e c-Myc di generare colonie iPS che esprimono i marcatori comune MES pluripotenza.

Generazione di cellule staminali pluripotenti indotte da Riprogrammazione fibroblasti embrionali di topo con un fattore quattro trascrizione, Doxiciclina inducibile lentivirali sistema di trasduzione

Dimostriamo il protocollo per la generazione di cellule staminali pluripotenti indotte da cellule somatiche umane utilizzando lentivirus-mediata consegna dei fattori umani Oct4, Sox2, Nanog, e Lin28. Pluripotenza è stata confermata dalla morfologia e la presenza di staminali embrionali (ES) cellulo-specifici marcatori.

Generazione di cellule staminali pluripotenti indotte da fibroblasti umani Riprogrammare con il Stemgent Lentivirus umani TF Set

Nonostante i recenti progressi nella modificazione genetica, trasfezione di cellule staminali embrionali umane (hESC) rimane un processo capriccioso. A nostra conoscenza, metodi sistematici ed efficiente per trasfettare umani cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) non sono stati segnalati. Qui, descriviamo i protocolli affidabili per trasfettare in modo efficiente e nucleofect iPSCs umani.

Trasfettando e Nucleofecting umani cellule staminali pluripotenti indotte

Vi presentiamo un protocollo efficace per la riprogrammazione di cellule somatiche umane in cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC) che utilizzano vettori retrovirali codificanti Oct3 / 4, Sox2, Klf4 e c-myc (OSKM) e l'individuazione di hiPSC correttamente riprogrammata mediante colorazione dal vivo con Tra- 1-81 anticorpo.

Selezione e isolamento di colonie di cellule pluripotenti indotte umane staminali riprogrammato da fibroblasti adulti

Qui vi presentiamo il nostro metodo stabilito per riprogrammare cellule somatiche umane in libera-transgene iPSCs umane con virus di Sendai, che mostra esito coerente e una maggiore efficienza.

Efficiente generazione indotta umane pluripotenti cellule staminali da cellule somatiche umane con Sendai-virus

Descriviamo un protocollo per la derivazione di cellule staminali pluripotenti umane indotte prive di fattori riprogrammate e caratterizzate su base lentivirale e la conversione in condizioni cliniche putative.

Derivazione e caratterizzazione di un free-Transgene umana indotta pluripotenti staminali Cell Line e Conversione in definite condizioni clinico-grade

L'editing genetico mediato da TALEN presso il locus AAVS1 consente l'aggiunta di transgeni ad alta efficienza nelle iPSC umane. Questo protocollo descrive le procedure per la preparazione delle iPSC per la somministrazione di TALEN e del vettore donatore, la trasfezione delle iPSC e la selezione e l'isolamento di cloni di iPSC per ottenere un'integrazione mirata di un gene GFP per generare linee reporter.

Transfection, selezione, e Colonia-picking di cellule staminali umane pluripotenti indotte TALEN-mirati con Gene GFP nel AAVS1 Safe Harbor

Generazione di cellule staminali pluripotenti indotte fornisce prospettive affascinanti per la derivazione di trapianto autologo. Tuttavia, la progressione attraverso uno stato pluripotente e laborioso ri-differenziazione impedisce ancora di traduzione clinica. Qui si descrive la derivazione di fibroblasti umani adulti e la loro conversione diretta in cellule progenitrici neurali indotte e la successiva differenziazione in linee neurali.

Derivazione di adulti fibroblasti umani e la loro conversione diretta in celle espandibile progenitrici neurali

Cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) rappresentano una fonte di tessuti paziente-specifici per le applicazioni cliniche e di ricerca di base. Qui vi presentiamo un protocollo dettagliato per riprogrammare le cellule umane mononucleari di sangue periferico (PBMNCs) ottenute da buffy coats congelati in iPSCs-virali gratuito utilizzando non integrano plasmidi episomiale.

Generazione di pluripotenti indotte cellule staminali da congelata Buffy cappotti con non-integrazione episomiale Plasmidi

La riprogrammazione cellulare richiede l'introduzione di geni chiave, che regolano e mantengono lo stato cellulare pluripotente. Il protocollo descritto consente la formazione di colonie di cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) da fibroblasti dermici umani senza metodi virali/integranti, ma utilizzando RNA non modificati (NM-RNA) combinati con fattori di evasione immunitaria che riducono i meccanismi di difesa cellulare.

Isolamento di fibroblasti dermici umani adulti dalla pelle addominale e generazione di cellule staminali pluripotenti indotte utilizzando un metodo non integrato

Scopri come generare cellule staminali pluripotenti indotte umane utilizzando vettori retrovirali con GFP. Questo metodo consente di identificare facilmente le colonie iPSC attraverso la silenziamento del reporter fluorescente.

Riprogrammare cellule somatiche umane in cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) Utilizzo vettore retrovirale con GFP

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