Riprogrammare cellule somatiche umane in cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) Utilizzo vettore retrovirale con GFP

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di generare cellule IPS umane tramite sovraespressione mediata da retrovirus di OCT quattro, SOX 2K, LF quattro e M con un sistema reporter GFP. Ciò si ottiene aggiungendo prima la quantità appropriata di retrovirus che esprime GFP individuale. Successivamente, le cellule infettate dal virus che esprimono GFP vengono trasferite in piastre rivestite di gelatina allo 0,1% con fibroblasti embrionali di topo.

La terza fase della procedura consiste nel sostituire il terreno con un terreno di coltura di cellule staminali embrionali umane. Infine, vengono isolate colonie di IPS silenziate GFP che mostrano una morfologia simile alle cellule staminali embrionali umane. In definitiva, i risultati mostrano l'espressione di marcatori pluripotenti endogeni attraverso la colorazione immunofluorescente e R-T-Q-P-C-R.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto al metodo esistente come la colorazione dello stile di vita con marcatore di superficie pluripotente e l'osservazione di un cambiamento morfologico è l'iPad desiderabile. Le colonie cellulari possono essere facilmente isolate utilizzando la perdita di espressione di GFP come marcatore per le cellule pluripotenti per iniziare la coltura. Fibroblasti umani in terreno di coltura di fibroblasti un giorno prima della piastra di infezione una volta per 10 al quinto fibroblasti umani in un pozzetto di una piastra a sei pozzetti il giorno successivo aspirano il terreno per rimuovere le cellule morte e aggiungono due millilitri di terreno di fibroblasti freschi con cinque microgrammi per millilitro di solfato di protamina.

Quindi aggiungere con attenzione la quantità appropriata di ciascun virus che esprime GFP corrispondente a una molteplicità di infezioni di cinque. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius durante la notte, un giorno dopo l'infezione. Rimuovere il lavaggio con surnatante virale tre volte con due millilitri di PBS.

Quindi aggiungere due millilitri, terreno fibroblastico tre giorni dopo l'infezione. Controllare la fluorescenza GFP e rabboccare il pozzetto con due millilitri. Piastra del terreno di fibroblasti il giorno successivo una volta da 10 a quattro per centimetro quadrato di cellule di topo irradiate, fibroblasti embrionali o alimentatori di metanfetamina in terreno di fibroblasti su una piastra di Petri di 10 centimetri rivestita con gelatina allo 0,1%.

Incubare le cellule a 37 gradi Celsius durante la notte. Il giorno successivo, staccare i fibroblasti umani infetti con un millilitro di tripsina EDTA allo 0,05% per cinque minuti a 37 gradi Celsius e centrifugare per cinque minuti a 200 G. Risospendere le cellule in 10 millilitri di terreno fibroblastico e riprodurre le cellule su gelatina pre-rivestita allo 0,1% con mfs. 24 ore dopo.

Sostituire il terreno con un terreno di coltura HESC e cambiare il terreno ogni giorno. Le colonie simili alle ESC inizieranno ad apparire da 20 a 27 giorni dopo l'infezione, dopo la comparsa delle colonie simili alle ESC al microscopio a fluorescenza. Verificare l'assenza di fluorescenza GFP in una colonia che mostra una morfologia simile alle HSC.

Utilizzando una pipetta da 10 microlitri. Raccogli le singole colonie di IPSC e mettile in un pozzetto di una piastra a 12 pozzetti ricoperta di gelatina e metanfetamina e integrata con terreno HESC. Cambiare il mezzo di passaggio giornaliero delle celle lavando la piastra con un millilitro di DMM F 12.

Quindi aggiungere 0,5 millilitri di collagenasi e incubare per 10 minuti a 37 gradi Celsius. Lavare le celle due volte con DM A MF 12. Quindi, aggiungi due millilitri di terreno HESC fresco.

Quindi usa un sollevatore di cellule per rompere le colonie in piccoli pezzi e staccare le cellule rimanenti dalla piastra. Trasferire i pezzi di colonie risospese in un pozzetto di gelatina e sei rivestiti di MEF. Preparare bene e incubare a 37 gradi Celsius per due giorni.

Per controllare le cellule mediante immunofluorescenza. Lavatele tre volte con PBS e fissatele con il 4% di paraldeide per 20 minuti a temperatura ambiente. Lavare delicatamente le cellule tre volte con PBS e permearle con tritton X 100 allo 0,2% in PBS per 30 minuti.

Bloccare il legame aspecifico incubando le cellule con il 3% di BSA in PBS per due ore. Successivamente, incubare le cellule con l'anticorpo primario durante la notte a quattro gradi Celsius. Quindi lavare le cellule tre volte con PBS e incubarle con anticorpi secondari per un'ora a temperatura ambiente al buio.

Lavare le celle tre volte con PBS durante l'ultimo lavaggio. Aggiungere il dappy e incubare a temperatura ambiente per cinque minuti. Immagini delle cellule utilizzando un microscopio a fluorescenza per ottenere una misurazione quantitativa in tempo reale.

La PCR isola l'RNA totale da IPC umani derivati da fibroblasti umani. Utilizzando un kit di isolamento dell'RNA. Sintetizzare il cDNA del primo filamento utilizzando la trascrittasi inversa.

Quindi usalo come modello per la QPCR per rilevare i geni della pluripotenza. I fibroblasti umani, BJ uno che sono stati infettati con un cocktail di retrovirus portatori di OCT quattro, SOX due, KLF quattro e Mick mostrati qui sono i cambiamenti morfologici osservati durante la riprogrammazione dal quinto giorno. Oggi, alle ore 10, 14 e 21, le cellule iniziano a mostrare la morfologia simile all'HESC dopo 21 giorni e le IPC sono riconosciute dalla fluorescenza GFP.

Le cellule staminali pluripotenti come le ESC e le IPC esprimono il meccanismo molecolare per reprimere l'espressione genica provirale. Tuttavia, i vettori retrovirali utilizzati qui esprimono GFP insieme ai geni di riprogrammazione mediante LTR retrovirale. Pertanto, si ritiene che le cellule che esprimono continuamente GFP esprimano transgeni senza silenziamento genico provirale come visto qui fedelmente, le colonie IPSC riprogrammate che acquisiscono la rete molecolare di pluripotenza mostrano l'assenza di espressione di GFP.

Questa figura mostra l'analisi immunoistochimica delle colonie derivate da Detroit 5, 51 fibroblasti con anticorpi contro TRA 180, 1, TRA uno, 60, SSEA quattro, T quattro e nano, come si può vedere con successo. Gli IPC riprogrammati esprimono tutti questi marcatori. Inoltre, è stato effettuato un R-T-P-C-R quantitativo per analizzare l'espressione genica e ha rivelato che T quattro SOX due, KLF quattro M e nano erano significativamente aumentati rispetto alle cellule dei fibroblasti parentali, ma commisurati a quello delle HSC H nove.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come infettare il virus, identificare e raccogliere le cellule IPA completamente programmate per le labbra utilizzando la microscopia fluorescente.