Name: Uno screening genetico per isolare Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 56 s
Description: Scopri un metodo di screening fenotipico per isolare mutanti di Toxoplasma gondii con difetti nell'egressione cellulare. Questa tecnica utilizza mutagenesi chimica e selezione a temperatura sensibile per studiare i meccanismi molecolari del parassita.

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Questo lavoro è stato finanziato dalla American Heart Association Scientist Development Grant 0635480N e National Institutes of Health assegno di ricerca AI081220. BIC è supportato da una Cavalieri Templari Eye Foundation assegno di ricerca.

Panoramica I protocolli sono forniti per definire la prima dose di mutageno portando ad una uccisione 70% dei parassiti (protocollo 1). La procedura successiva è prevista per arricchire i mutanti egress indotte da un pool mutagenizzato parassita (protocollo 2, Figura 2). Questo è seguito da un protocollo per testare l&#39;incidenza di mutanti egress in piscina arricchito, o per convalidare il fenotipo uscita in mutanti individuali (protocollo 3). Infine, viene fornito un protocollo per generare cloni singolo parassita da popolazioni arricchiti mediante diluizione limitante (protocollo 4). 1. Titolazione del mutageno Usare particolare cautela, come guanti doppi, quando si lavora con composti altamente mutageni e liquidi. Raccogliere separatamente i rifiuti liquidi per il corretto smaltimento. <ol><li> Inoculare T25 fiaschette per coltura tissutale confluenti con fibroblasti umani prepuzio (HFF) cellule con 1 ml di tachizoiti fresco e lisate crescere 18-25 hr a 37 °; C in 5% CO 2 in Ed1 medio (D-MEM supplementato con 1% inattivato al calore siero fetale bovino, 0,2 mM L-glutammina, 50 U / ml penicillina, 50 pg / ml streptomicina, e 0,25 mg / ml di amfotericina B ). Vedi Roos et al. per la crescita generale e dei media di cellule HFF e parassiti 21. </li><li> Sostituire il mezzo con 10 ml 0,1% di siero bovino fetale media (Ed1 diluito 1:10 in D-MEM) e lasciare in umidificata incubatore a 37 ° C inferiore al 5% di CO 2 (denominata &quot;37 ° C incubatore&quot; da qui in poi) per 10 min . </li><li> Aggiungere 0, 12.5, 25, 50, o 100 ENU pl (1 Stock M in DMSO) o EMS (1 Stock M in DMSO) per pallone (diluizioni mutageni di lavoro sarà 1,25, 2,5, 5, e 10 mm, rispettivamente). Aggiungere DMSO a 100 pl per ogni beuta. Incubare per 4 ore a 37 ° C incubatore. </li><li> Lavare tre volte per 10 secondi a temperatura ambiente risciacquando il monostrato con 10 ml di PBS freddo (pre-raffreddata a 4 ° C). </li><li> Aggiungere 5 ml di PBS, raschiare il monostrato sciolto con un poliziotto in gomma (cella scrAPER), passare le cellule raschiate con un ago 26,5 G rimuovere fisicamente il parassita dai fibroblasti (clip dall&#39;albero fuori l&#39;ago con le forbici pesanti per non esporre l&#39;ago), e filtro a 3.0 micron filtro in policarbonato. Passaggi aghi multipla aumenterà l&#39;efficienza di rilascio parassiti dalla cellula ospite. </li><li> Contare la concentrazione parassita utilizzando un emocitometro. Lasciate che i parassiti accontentarsi di 5 min in hemocytomer prima del conteggio. </li><li> Diluire i parassiti a 10.000 parassiti per 3 ml a Ed1 (per 10 ml 33.333 parassiti sono necessari). </li><li> Inoculare un pozzetto in una piastra da 6 pozzetti con 3 ml di parassiti diluiti (contenente 10.000 parassiti). Diluire serialmente i parassiti di 10 volte nell&#39;arco di 3 pozzi in un 6-ben confluenti piastra con cellule HFF contenenti 2,7 ml Ed1 mediante il trasferimento di 300 ml dal primo pozzo. Lasciare le piastre indisturbati nel 37 ° C incubatore per 7 giorni. </li><li> Aspirare il terreno, fissare 15 min con 3 ml / pozzetto di etanolo 100%, macchiacon 3 ml / pozzetto soluzione di violetto cristallo (12,5 g cristalvioletto in 125 ml di etanolo miscelati con 500 ml di ossalato di ammonio 1%) per 15 min, lavare con 3 ml / pozzetto di PBS (1 minuto) e aria secca. Tutti a temperatura ambiente. </li><li> Contare placche e selezionare concentrazione di mutageno necessario per ottenere la sopravvivenza del 30% dei parassiti esposti (70% uccisione dosaggio: vedi Figura 1). Una dose di 70% abbattimento è stato usato storicamente 14 e indotte meno di 100 mutazioni puntiformi per genoma (Farrell, Marth, Gubbels et al., Manoscritto). </li></ol> 2. Arricchimento di mutanti egress (figura 2) <ol><li> Eseguire mutagenesi come sopra descritto utilizzando un dosaggio mutageno indurre il 70% uccisione. Crescere la popolazione mutagenizzato per un passaggio in un pallone nuovo di cellule ospiti. </li><li> Infettare un T25, HFF confluenti pallone di coltura tissutale con 120.000 parassiti appena lisati di una popolazione mutagenizzato in 10 ml Ed1. Incubare per 2 ore in un incubatore a 35 ° C in 5% CO2 e umidificata (D&#39;ora in poi chiamato &quot;35 ° C incubatore&quot;). </li><li> Aspirare il terreno e risciacquare 10 secondi con 10 ml di PBS freddo e quindi aggiungere 10 ml Ed1 terreno supplementato con 25 mg / ml di solfato di destrano (DS) 13. Incubare per 26 ore in un incubatore a 40 ° C sotto 5% di CO 2 e umidificata (D&#39;ora in poi chiamato &quot;40 ° C incubatore&quot;). </li><li> Preparare la soluzione di lavoro di esaltatori di uscita. Diluire l&#39;induttore di uscita scelta alla concentrazione di lavoro in un tubo Falcon da 15 ml contenente 10 ml HBSSc supplementato con 25 mg / ml DS. Pre-riscaldare le diluizioni per 30 min a 37 ° C a bagno-maria. Vedi Tabella 1 per le concentrazioni di lavoro. </li><li> Aspirare il terreno dalle parassitiferi fiaschi e aggiungere pre-riscaldato soluzione induttore di uscita. Incubare a 37 ° C incubatore per i tempi indicati in tabella 1. </li><li> Aspirare il terreno di 10 secondi e sciacquare con 10 ml di PBS freddo e poi aggiungere 10 ml Ed1 integrato con 25 mg / ml DS e 50 uM pirrolidina ditiocarbammato (PDTC: add 5 pl di 100 mM Archivio PDTC in PBS) 13. Incubare 5 ore a 35 ° C incubatore. </li><li> Aspirare il terreno di 10 secondi e risciacquare una volta con 10 ml di PBS (temperatura ambiente) e poi aggiungere 10 ml Ed1 media. Mettere flaconi di nuovo nel 35 ° C fino a quando i parassiti incubatore distruggere il monostrato: flaconi shake al giorno. Il recupero richiede circa 7 giorni. </li></ol> 3. Validazione dei fenotipi mutanti mediante saggi egress Dopo aver eseguito lo schermo arricchimento e crescita della popolazione arricchito per un passaggio nelle cellule HFF, i fenotipi devono essere confermati da un test di uscita 11,13. Questa analisi dovrebbe anche essere utilizzato per convalidare singoli cloni Dopo il protocollo 4. <ol><li> Inoculare 20.000 parassiti per bene in un piastra da 24 pozzetti contenenti le cellule HFF confluenti coltivate su vetrini coprioggetto (1 ml Ed1 medium per pozzetto). Incubare in 8 ore a 35 ° C incubatore poi trasferire in un incubatore a 40 ° C per 24 ore. </li><li> Lavare con 1 ml / pozzetto PBS (10 secondi a temperatura ambiente). Aggiungere 1 ml (induttori egress includere un solo DMSO controllo negativo), pre-riscaldati e diluito in HBSSc e incubare per i tempi descritti nella Tabella 1. </li><li> Aspirare il terreno e fissare con 1 ml / pozzetto metanolo 100% per 15 min a temperatura ambiente. </li><li> Se i parassiti genitori che esprimono una proteina autofluorescente sono stati utilizzati per la mutagenesi, procedere al passaggio # 3.5 13. Se non che esprimono proteine ​​fluorescenti parassiti sono stati usati come linea parentale, macchia i coprioggetti fissi con Diff-Quick colorare per 1 min a temperatura ambiente 11. </li><li> Lavare 5 min con 1 ml / pozzetto in PBS della piastra da 24 pozzetti a temperatura ambiente. </li><li> Per i parassiti che esprimono proteine ​​fluorescenti: lavare rapidamente il vetrino in DDH 2 O (ad immersione) e montarlo su vetrini sotto gelmount per proteggere il segnale di fluorescenza. Per i Quick Diff parassiti macchiati, lavare per 10 secondi in 100% di etanolo e lasciare asciugare prima di montare sul vetrino. </li><li> Utilizzando un (fluorescenza) con un microscopio40-60x obiettivo conta la percentuale di vacuoli egressed rispetto ai vacuoli che rimasti intracellulare (vedi Figura 4). </li></ol> 4. Clone mutanti egress limitando la diluizione Dopo la convalida del fenotipo della popolazione mutante arricchito uscita utilizzando il protocollo 3, la popolazione policlonale deve essere clonato per ottenere cloni singolo parassita. <ol><li> Contare popolazione parassitaria in un emocitometro e diluire ad una concentrazione di 500 parassiti per ml in Ed1 media. </li><li> In una piastra a 384 pozzetti contenente un monostrato confluente di cellule HFF, sostituire il mezzo con 40 pl / pozzetto di Ed1 mezzo utilizzando una pipetta multicanale. Come mostrato in figura 5, quattro popolazioni policlonali può essere clonato per placca come segue: pipettare 40 pl / pozzetto di diluito mutante 1 in pozzetti C3-C12, mutante 2 in pozzetti C13-C22, mutante 3 in pozzetti H3-H12, e mutante 4 in pozzi H13-H22 (volume finale nei pozzetti è ora 80 pl). Utilizzando una pipetta multicanale, pipetta il soldistribuzione pesi su e giù per 5 volte, quindi trasferire 40 microlitri alla riga sotto la riga di partenza (da fila C a D o la riga H a I). Continua a queste diluizioni seriali di 2 volte attraverso fila G (mutanti 1 e 2) o riga N (mutanti 3 e 4). Eliminare l&#39;olio extra 40 microlitri dall&#39;ultima fila. Incubare in un incubatore a 35 ° C per 7-10 giorni senza disturbare la piastra. </li><li> Controllare i pozzetti su un microscopio invertito con un 10-20x obiettivo per la presenza di placche singole, come visibile dei fori &#39;in monostrato. </li><li> Pick 4 pozzi per mutante con una targa unica e trasferire i parassiti in una confluente pallone coltura di tessuti con le cellule HFF e pieno di Ed1 media. Crescere i parassiti in un incubatore a 35 ° C ed agitare i flaconi al giorno per disperdere i parassiti extracellulari. Ciò richiede in genere 7 giorni. </li></ol> 5. Risultati rappresentativi Il ENU mutageni e EMS non sono stabili quando conservati per lunghi periodi di tempo. Pertanto, il test di potenza mutagenole scorte è fondamentale per ottenere risultati riproducibili. Risultati della titolazione tipici e uccisione curve sia per ENU e EMS sono mostrati nella Figura 1. Tuttavia, si raccomanda di effettuare saggi placca per ogni esperimento mutagenesi per verificare che il dosaggio appropriato è stato usato. Per mantenere la diversità nella popolazione parassita mutagenizzato, è importante procedere alla schermata di uscita mutante più rapidamente possibile. In genere, un passaggio dei parassiti in un pallone nuovo viene eseguita per lasciare che i parassiti sopravvissuti recuperare prima di andare avanti con lo schermo. Va tenuto presente che questo avrà come conseguenza nella divisione dei mutanti. Pertanto non si può escludere che più mutanti isolati clonali dopo aver completato l&#39;intera procedura contenere esattamente lo stesso genotipo. Per evitare di isolare i mutanti più volte lo stesso si raccomanda di isolare solo un mutante singola uscita per mutagenesi, a meno che i fenotipi (ad esempio differenziali sensibilità induttori uscita) sonomolto diversi tra loro. D&#39;altra parte, non ogni schermata risultati in isolamento di mutanti con fenotipo desiderato. In particolare, il Ca 2 +-ionoforo A23187 fenotipo resistente è rara e richiede molteplici esperimenti di mutagenesi e gli schermi per isolare un mutante singola uscita. Pertanto si raccomanda di eseguire esperimenti di mutagenesi 5-10 e schermo in parallelo. Il potere arricchimento dello schermo è stata testata miscelando un mutante uscita noto con wild-type parassiti a diversi rapporti. Queste miscele sono state sottoposte allo schermo e l&#39;incidenza del fenotipo mutante nella popolazione arricchita è stata valutata. Utilizzando tipo selvatico parassiti esprimono citoplasmatica RFP e una linea mutante esprime YFP citoplasmatica le incidenze potrebbe rapidamente essere stabilita mediante citometria di flusso (figura 3) 13. I risultati mostrano che fenotipi mutanti possono essere regolarmente arricchito al 80% di purezza a partire da 1 parassita uscita mutante per 10.000 wild-type parasites 13. Tuttavia, quando l&#39;uscita mutante: wild-type rapporto avviamento parassita è 1:100.000 parassiti, la popolazione isolata è solo 1-2% (1:100) mutanti di uscita. Di conseguenza il potere di arricchimento dello schermo è di 1000 volte. Poiché lo schermo inizia con l&#39;inoculazione di parassiti 120.000, di cui in genere il 70% sono vitali, di solito eseguire due turni di arricchimento. I parassiti isolati sono cresciuti tra i round di arricchimento. Questa procedura porta ad una popolazione mutante 100% anche se a partire da 1:1.000.000 egress mutanti: wild-type parassiti. Il dosaggio uscita per convalidare e caratterizzare i fenotipi richiede una molteplicità di infezione della cellula ospite che consente la differenziazione di vacuoli individuali. Ciò è particolarmente importante quando si analizzano le condizioni con alte percentuali di uscita dei parassiti, come singoli sono sparsi in giro. Come mostrato in Figura 4, se le popolazioni egressed non sono ben separati è facile sottovalutare la percentualedi uscita contando due vacuoli egressed come uno vacuolo. Poiché uscita e l&#39;invasione sono relativi processi, e alcuni termosensibili fenotipi mostrano un fenotipo lieve a temperatura più bassa, non tutti i mutanti avranno efficienze invasione simili. Tali mutanti devono quindi essere inoculate in diversi dosaggi volte più elevate per ottenere un&#39;alta densità vacuolo sufficiente per una valutazione accurata del loro fenotipo uscita. Inoltre, alcuni induttori egress non efficacemente stimolare l&#39;uscita di vacuoli contenenti quattro parassiti o meno. Come tale, è importante che vacuoli contenere otto parassiti o più quando iniziare il test uscita. Nel nostro laboratorio mutanti schermo isolato con una particolare uscita enhancer contro esaltatori egress altri. Con la loro profilazione cross-reattività i mutanti possono essere raggruppati in classi diverse. Infine, non tutti i mutanti egress saranno sensibili alla temperatura. In particolare i mutanti isolati con induttori egress innescando passi prima del rilascio di intracellular Ca 2 + sono inclini a fenotipi non-sensibili di temperatura. Ciò è dovuto alle vie parallele che possono portare alla possano uscire converge prima che il segnale sul rilascio intracellulare di Ca 2 +. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3807/3807fig1.jpg" /> Figura 1. Chemical mutageno titolazione del dosaggio. Saggi placca A. eseguita in una piastra da 6 pozzetti utilizzando diverse concentrazioni EMS ei numeri diversi di parassiti come indicato per pozzetto. Le macchie bianche sono placche parassiti formati nel monostrato HFF. B, C. Le curve di sopravvivenza di parassiti su esposizione a vari dosaggi di EMS (B) e ENU (C). La sopravvivenza è stata valutata mediante analisi della placca. Un dosaggio inducendo 70% uccisione viene scelto per esperimenti di mutagenesi. Medie di tre esperimenti indipendenti + / - deviazione standard vengono visualizzati. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3807/3807fig2.jpg" /> <strong&gt; Figura 2. Rappresentazione schematica della schermata uscita arricchimento mutante. Temperatura è indicato l&#39;asse y, mentre progressione temporale è rappresentato dalla asse x. Parassiti verdi riflettono egress parassiti mutanti, parassiti rossi riflettono wild-type parassiti. I tempi di cambiamenti delle condizioni e lo stimolo induttore di uscita sono indicate in alto e sono contrassegnati da frecce sulla linea blu che riflette il profilo di temperatura. Adottato da Eidell et al. 13. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3807/3807fig3.jpg" /> Figura 3. Tipico di arricchimento egress fenotipi mutanti. Risultati di arricchimento di un mutante uscita mescolato wild-type parassiti a diversi rapporti (asse X). La percentuale di egress fenotipi mutanti nella popolazione cresciuta dopo lo schermo è tracciata sulla asse y ed è stata valutata mediante citometria a flusso (egress parassiti mutanti espressi YFP citoplasmatica, wild-type parassiti espresso cytoplasmic RFP). I risultati di tre esperimenti indipendenti sono rappresentati da punti dati rosse, blu e verde. Adottato da Eidell et al. 13. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3807/3807fig4.jpg" /> Figura 4. I risultati tipici di un saggio uscita. A segnare quattro frecce. Vacuoli contenenti diverse intatti parassiti 4-8. B. Frecce indicano quattro gruppi di parassiti riflettenti sparsi quattro vacuoli indipendenti egressed. Egress è stata indotta da A23187 (B) o DMSO come controllo negativo (A). Parassiti esprimere citoplasmatica YFP 22. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3807/3807fig5.jpg" /> Figura 5. Diluizione seriale per le linee clonali parassiti. Quattro popolazioni policlonali (rosso, blu, giallo, verde) sono diluiti serialmente in un singolo da 384 pozzetti confluenti piastra con cellule HFF. Row C e ricevo 10 parassiti per bene esono 2-volte diluito (40 pl + 40 pl) fino righe H e N, rispettivamente. La tonalità di grigio indica la diminuzione del numero di parassiti per bene. Tipicamente, singoli cloni si trovano in righe e JL DF. <table border="1"><tbody><tr><td> Composto </td><td> Stock </td><td> Concentrazione di lavoro </td><td> microlitri necessario per T25 (10 ml) </td><td> Tempo di incubazione (min) </td></tr><tr><td> DTT </td><td> 1 M in DMSO </td><td> 5 mM </td><td> 50 </td><td> 15 </td></tr><tr><td> etanolo </td><td> 190 Proof </td><td> 5% </td><td> 500 </td><td> 30 </td></tr><tr><td> A23187 </td><td> 2 mM in DMSO </td><td> 1 pM </td><td> 5 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> nigericin * </td><td> 2 mM in DMSO </td><td> 10 pM </td><td> 50 </td><td> 30 </td></tr></tbody></table> * Nigericin non può essere utilizzato nella arricchirezione dello schermo, come i parassiti non sopravvivono stimolo nigericin; utilizzare solo nigericin nella convalida dei mutanti di uscita. Tabella 1. Egress induttori usati nelle procedure. Diluire in 10 ml HBBSc contenente 25 mg / ml DS per lo schermo, o non DS per la convalida mutante (test uscita). Tutti i composti da Sigma-Aldrich.

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</ol>

Non abbiamo nulla da rivelare.

<html> Il protocollo descritto fornisce un metodo efficiente per isolare mutanti Toxoplasma con un difetto di uscita. Abbiamo isolato con successo mutanti lungo varie fasi del percorso di uscita, alcuni dei quali hanno un fenotipo duplice invasione 13. Eventuali effetti sulla invasione può essere determinata utilizzando la cosiddetta rosso-verde saggio, che differenzia invasa da non-invasi da parassiti colorazione differenziale anticorpi 23,24. Per entrambi i saggi invasione e di uscita pot...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Comments </td></tr><tr><td> ENU </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> N3385 </td><td> 1 Stock M in DMSO, conservare a -20 ° C </td></tr><tr><td> EMS </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M0880 </td><td> 1 Stock M in DMSO, conservare a -20 ° C </td></tr><tr><td> Destrano solfato </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D4911 </td><td></td></tr><tr><td> PDTC </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P8765 </td><td> 100 Stock mM in PBS </td></tr><tr><td> Diff Quick </td><td> EMD Chemicals </td><td> 65044-93 </td><td></td></tr><tr><td> Portafiltro </td><td> Cole-Parmer </td><td> 540100 </td><td></td></tr><tr><td> 3 um policarbonato filtro </td><td> WhatmanSchleicher &amp; Schuell </td><td> 110612 </td><td></td></tr><tr><td> Emocitometro </td><td> Hausser Scientific </td><td> 1475 </td><td></td></tr><tr><td> CO 2 incubatori </td><td> Diversi produttori </td><td></td><td> Umidificato, 5% CO 2, a 35, 37 e 40 ° C </td></tr><tr><td> Microscopio a fluorescenza </td><td> Diversi produttori </td><td></td><td> Idealmente invertito, a grande campo con l&#39;obiettivo di petrolio 63x o 100x </td></tr></tbody></table> HBSSc (secondo Black et al 11.): <ul><li> 98,0 ml di soluzione salina bilanciata di Hanks (numero di catalogo Hyclone SH30588) </li><li> 100 MgCl ul 1M 2 (100 mM end) </li><li> 100 pl 1M CaCl 2 (100 mM end) </li><li> 2,0 ml 1M Hepes pH 7.3 (20 mM end) </li><li> 84 mg NaHCO 3 (10 mM end) </li></ul>

uno screening genetico per isolare toxoplasma gondii host-cell egress mutants

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

La diffusa, intracellulare obbligato, protozoo parassita Toxoplasma gondii causa malattia opportunistica in pazienti immuno-compromessi e causa difetti di nascita al momento dell&#39;infezione congenita. Il ciclo di replica litico è caratterizzato da tre fasi: 1. invasione attiva di una cellula ospite nucleata; 2. la replicazione all&#39;interno della cellula ospite; 3. uscita attiva dalla cellula ospite. Il meccanismo di uscita è sempre più apprezzato come un processo unico e altamente regolamentato, che è ancora poco conosciuta a livello molecolare. I percorsi di segnalazione sottostanti uscita sono stati caratterizzati mediante l&#39;uso di agenti farmacologici che agiscono su diversi aspetti dei percorsi 1-5. Come tali, diversi inneschi indipendenti di uscita sono stati identificati quali convergono tutti rilascio intracellulare di Ca 2 +, un segnale che è anche critica per l&#39;invasione della cellula ospite 6-8. Questa intuizione ha informato di un approccio del gene candidato che ha portato alla identizione degli impianti come il calcio proteina chinasi dipendente (CDPK) coinvolti in uscita 9. Inoltre, molti recenti scoperte in uscita comprensione sono state realizzate con (chimica) approcci genetici 10-12. Per combinare la ricchezza di informazioni farmacologica con l&#39;accessibilità crescente genetica di Toxoplasma abbiamo recentemente istituito una schermata che permette l&#39;arricchimento per i mutanti parassita con un difetto della cellula ospite in uscita 13. Anche se mutagenesi chimica utilizzando N-etil-N-nitrosourea (ENU) o etile metanosolfonato (EMS) è stata utilizzata per decenni nello studio della biologia Toxoplasma 11,14,15, solo recentemente ha la mappatura genetica delle mutazioni alla base dei fenotipi diventano routine 16 -18. Inoltre, generando termosensibili mutanti, processi essenziali possono essere sezionati e le sottostanti direttamente geni identificati. Questi mutanti comportano come tipo selvatico sotto la temperatura permissiva (35 ° C), ma non proliferate alla temperatura restrittivo (40 ° C) come risultato della mutazione in questione. Qui illustrano un nuovo metodo di screening per isolare mutanti fenotipica con un sensibile alla temperatura fenotipo uscita 13. La sfida per schermi egress è quello di separare egressed da non egressed parassiti, che è complicata dal rapido re-invasione e l&#39;adesività generale dei parassiti per le cellule ospiti. Una schermata di uscita precedentemente stabilito si basava su una serie complessa di passaggi biotinilazione per separare intracellulare dai parassiti extracellulari 11. Questo metodo inoltre non generare mutanti condizionali conseguente fenotipi deboli. Il metodo qui descritto supera il forte attaccamento di egressing parassiti includendo un concorrente glicano, solfato di destrano (DS), che impedisce parassiti di attaccarsi alla cellula ospite 19. Inoltre, i parassiti extracellulari sono specificamente ucciso da pirrolidina ditiocarbammato (PDTC), che lascia i parassiti intracellulariilleso 20. Pertanto, con una nuova schermata fenotipica per isolare specificamente parassiti mutanti con difetti in uscita indotta, il potere della genetica possono ora essere pienamente dispiegato per svelare i meccanismi molecolari alla base della cellula ospite uscita.

Forward genetica è un metodo efficace per svelare il livello molecolare di come<em&gt; Toxoplasma</em&gt; Egresses dalla sua cellula ospite. I protocolli sono fornite mutagenizzare chimicamente parassiti, per arricchire mutanti con difetti in uscita indotta, e convalidare il fenotipo di mutanti clonati.

Uno screening genetico per isolare Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

Il parassita protozoo obbligato intracellulare e ampiamente diffuso Toxoplasma gondii causa malattie opportunistiche nei pazienti immunocompromessi e provoca difetti congeniti...

Questo video illustra un nuovo metodo di screening fenotipico per isolare mutanti con un fenotipo di uscita sensibile alla temperatura. Mutageno e parassiti vengono applicati a colture di fibroblasti umani della prepuzio infettati da toxoplasma. Per due ore, i parassiti non invasivi vengono rimossi e il matraccio viene trasferito a 40 gradi Celsius per indurre lo sviluppo del fenotipo.Dopo 26 ore, le vacuole contengono da otto a 16 parassiti. Successivamente, le cellule vengono stimolate con composti induttori dell'egresso. I parassiti mutanti con un difetto nell'egresso rimarranno intracellulari, mentre i parassiti di tipo selvaggio usciranno nel mezzo.I parassiti di tipo selvatico vengono rimossi mediante lavaggio e le cellule rimanenti sono nuovamente incubate a 35 gradi Celsius per arricchire la popolazione di mutanti. Infine, il fenotipo mutante viene verificato e singole linee clonali di parassiti vengono isolate dalla popolazione arricchita mediante diluizione limite. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come il metodo di inalazione bio, è che l'arricchimento specifico dei mutanti per l'uscita è molto più efficiente.Abbiamo ottenuto per la prima volta l'ID per questo metodo quando abbiamo identificato un mutante di uscita da un pannello di mutanti con difetti di crescita. Utilizzando tale mutante, ottimizziamo la procedura di screening mescolandolo in diversi rapporti con parassiti di tipo selvatico. A dimostrare la procedura sarà Bradley Coleman, un ricercatore postdottorato del mio laboratorio.Questa procedura utilizza composti e liquidi altamente mutageni, nonché il parassita infettivo. Per Toxoplasma Gandhi, l'uso di dispositivi di protezione adeguati, tra cui camice da laboratorio, doppi guanti e cappa a sicurezza biologica, è essenziale. Tutti i rifiuti liquidi prodotti devono essere raccolti separatamente per lo smaltimento appropriato.Iniziare inoculando cellule fibroblastiche di prepuzio umano o cellule HFF confluenti con un millilitro di tachy Lloyds appena lisati in un mezzo ed uno. Quindi, posizionare il matraccio in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius con 5%CO2 per 18-25 ore. Il giorno successivo, sostituire il mezzo con 10 millilitri di mezzo contenente 0,1% di siero bovino fetale e incubare a 37 gradi Celsius per 10 minuti.Dopo l'incubazione, aggiungere a ciascun flacone zero, 12,5, 25, 50 o 100 microlitri di mutagene ENU. I diluizioni di lavoro saranno rispettivamente 1,25, 2,55 e 10 millimolari. Aggiungere fino a 100 microlitri di DMSO in ogni flacone.Incubare per quattro ore in un incubatore a 37 gradi Celsius. Lavare il monostrato con 10 millilitri di PBS freddo, 3 volte per 10 secondi. Aggiungere 5 millilitri di PBS e utilizzare una spatola per cellule per staccare il monostrato.Quindi, utilizzando forbici resistenti, tagliare l'estremità del cappuccio dell'ago in modo che l'ago non sia esposto. Successivamente, trasferire le cellule in una siringa e farle passare attraverso un ago calibro 26,5. Per rimuovere fisicamente il parassita dai fibroblasti, ripetere più volte il passaggio attraverso l'ago aumenterà l'efficienza del rilascio dei parassiti dalla cellula ospite.Collegare un filtro in policarbonato da 3,0 micrometri a una siringa. Caricare l'ago con le cellule nella siringa e spingerle attraverso il filtro in un tubo, quindi trasferire i parassiti su un emocitometro per il conteggio. L'aspetto più difficile di questa procedura è distinguere i parassiti dai detriti.Per assicurare il successo, è importante lasciare sedimentare i parassiti prima di contarli. Dopo aver lasciato sedimentare i parassiti per cinque minuti, procedere al conteggio. Una volta determinata la concentrazione di toxoplasma, diluirli a 3.333 parassiti per millilitro in ED uno per 10 millilitri.Sono necessari 33.333 parassiti. Aggiungere tre millilitri nella prima pozzetta di una piastra a sei pozzette contenente cellule HFF per inoculare 10.000 parassiti. Successivamente, diluire in modo seriale i parassiti di dieci volte nelle successive tre pozzette trasferendo 300 microlitri da una pozzetta all'altra.Lasciare le piastre indisturbate nell'incubatrice a 37 gradi Celsius per sette giorni. Trascorsa una settimana, aspirare il mezzo e fissare le cellule aggiungendo tre millilitri di etanolo al 100% in ogni pozzetto per 15 minuti. Dopo aver rimosso l'etanolo, colorare le cellule aggiungendo tre millilitri di soluzione di violetto cristallo in ogni pozzetto per 15 minuti.Infine, lavare ogni pozzetto con tre millilitri di PBS per un minuto. Una volta che la piastra è asciutta, contare le placche e selezionare la concentrazione di mutageno necessaria per ottenere la sopravvivenza del 30% dei parassiti esposti. Una dose che determina una mortalità del 70% è stata storicamente utilizzata ed induce meno di 100 mutazioni puntiformi per genoma.Il passo successivo della procedura consiste nell'arricchire i mutanti di egresso nella popolazione. Una volta espansa la popolazione, aggiungere 120.000 parassiti appena lisi a cellule HFF confluenti in 10 millilitri. Incubare ED uno per due ore a 35 gradi Celsius.Questo sincronizzerà la popolazione limitando il tempo di invasione. Al termine dell'incubazione, aspirare il mezzo e risciacquare le cellule per 10 secondi con 10 millilitri di PBS freddo, quindi aggiungere 10 millilitri di mezzo ED uno integrato con 25 milligrammi per millilitro di solfato di dextrano.Questo saturerà le proteine di superficie leganti i glicani sui parassiti, consentendo loro di riattaccarsi e reinfectare la cellula ospite. Incubare il matraccio per 26 ore in un incubatore umidificato a 40 gradi Celsius con 5%CO2. Durante questo periodo, le proteine normalmente ripiegate verranno sostituite da proteine sensibili alla temperatura malripiegate.Il giorno successivo, diluire l'induttore di uscita scelto alla concentrazione di lavoro in un tubo da 15 millilitri contenente 10 millilitri di H-B-S-S-C integrato con 25 milligrammi per millilitro di dextran solfato. Posizionarlo in un bagnomaria per preriscaldare la soluzione per 30 minuti.Aspirare il mezzo dai flaconi infettati dai parassiti e aggiungere la soluzione induttore di uscita preriscaldata. Incubare a 37 gradi Celsius come indicato nel documento allegato. Successivamente, aspirare il mezzo e risciacquare per 10 secondi.Con 10 millilitri di PBS freddo, aggiungere 10 millilitri di ED uno integrato con 25 milligrammi per millilitro di dextran solfato e 50 micromolari di piridina DIO carbamato, quindi incubare per cinque ore a 35 gradi Celsius. Al termine dell'incubazione, aspirare il mezzo e sciacquare una volta con PBS per 10 secondi.Quindi aggiungere 10 millilitri. EED un mezzo medio, reinserire il matraccio nell'incubatrice a 35 gradi Celsius. Agitare quotidianamente per disperdere i parassiti in uscita.Continuare l'incubazione fino a quando i parassiti non avranno distrutto il monolayer. Circa sette giorni dopo lo screening di arricchimento, la popolazione viene propagata per un passaggio. Successivamente, i fenotipi vengono confermati mediante un saggio di uscita.Inoculare 20.000 parassiti in ogni pozzetto di una piastra a 24 pozzetti contenente cellule HFF confluenti cresciute su coprivetrini, incubare per otto ore in un incubatore a 35 gradi Celsius per consentire l'invado di tutti i parassiti nel mezzo alla temperatura permissiva. Successivamente, trasferire la piastra in un incubatore a 40 gradi Celsius per 24 ore per indurre il fenotipo e far crescere olos contenenti da otto a 24 parassiti dopo aver lavato ogni pozzetto con un millilitro di PBS per 10 secondi. A temperatura ambiente, aggiungere un millilitro di induttore di egresso preriscaldato e diluito in H-B-S-S-C, incubare per i tempi indicati nel protocollo scritto allegato.Aspirare il mezzo e fissare aggiungendo un millilitro di metanolo al 100% in ogni pozzetto e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente. Quindi lavare con un millilitro di PBS a temperatura ambiente. Dopo il lavaggio e il montaggio dei vetrini, utilizzare un microscopio con un obiettivo da 40 a 60 x per contare la percentuale di uscita di S rispetto alle vacuole intracellulari. Dopo la validazione del fenotipo della popolazione arricchita di mutanti per l'uscita, la popolazione policlonale viene clonata per ottenere cloni singoli di parassiti.Dopo aver determinato la concentrazione del parassita diluita a 500 parassiti per millilitro in mezzo ED uno in una piastra 384 pozzetti contenente un monolayer confluenziale di cellule HFF, sostituire il mezzo con 40 microlitri per pozzetto di mezzo ED uno utilizzando una pipetta multicanale. Quattro popolazioni policlonali rappresentate in rosso, blu, giallo e verde.In questa illustrazione si può clonare su una piastra per ottenere questa pipetta. 40 microlitri per pozzetto di mutante diluito uno nei pozzetti C3 fino a C12, mutante due nei pozzetti C13 fino a C22, mutante tre nei pozzetti H3 fino a H12 e mutante quattro nei pozzetti H13 fino a H22. Il volume totale in ciascun pozzetto ora dovrebbe essere di 80 microlitri.Quindi, utilizzando una pipetta multicanale, pipettare la soluzione su e gi&ugrave; cinque volte, trasferire 40 microlitri alla riga successiva rispetto alla riga iniziale. Continuare queste diluizioni seriali a due raddoppi fino alla riga H per i mutanti uno e due o fino alla riga N per i mutanti tre e quattro. Scartare i 40 microlitri in eccesso dell'ultima riga.Incubare in un incubatore a 35 gradi Celsius per sette-dieci giorni senza disturbare la piastra. La settimana successiva, esaminare le pozzette al microscopio invertito con un obiettivo da 10 a 20 x per verificare la presenza di singole placche visibili come fori nel monostrato. Selezionare quattro pozzette per mutante contenenti una singola placca e trasferire i parassiti in un fiasco per colture cellulari T 12,5 confluenti con cellule HFF e riempito con cinque millilitri.Coltivare i parassiti in un incubatore a 35 gradi Celsius in mezzo ED uno. Agitare i flaconi ogni giorno per disperdere i parassiti extracellulari. Questo processo richiede tipicamente sette giorni.I saggi delle placche sono stati eseguiti in una piastra a sei pozzetti utilizzando diverse concentrazioni del mutageno EMS e diversi numeri di parassiti per pozzetto. Come mostrato in questo video, le macchie bianche nei pozzetti qui raffigurati sono placche di parassiti formate nel monolayer di HFF su piastre trattate con EMS. I risultati di questi saggi delle placche sono stati utilizzati per generare curve di sopravvivenza di parassiti esposti a dosaggi crescenti di EMS ed ENU.La dose che induceva il 70% di mortalità è stata quindi scelta per gli esperimenti di mutagenesi. In un esperimento diverso, la percentuale di fenotipo mutante per l'uscita nella popolazione dopo l'arricchimento è stata valutata mediante citometria a flusso come mostrato qui. Quando il rapporto iniziale tra parassiti mutanti per l'uscita e parassiti di tipo selvatico era di uno su 10.000, è stata raggiunta una purezza dell'80% attraverso l'arricchimento.Tuttavia, quando il rapporto iniziale era di un parassita ogni 100.000, la popolazione isolata costituiva solo dall'1 al 2%. Questi dati suggeriscono che il potere di arricchimento dello screening è di 1000 volte. In un terzo esperimento, l'uscita è stata indotta dall'ione calcio A 23187. In queste immagini, le frecce indicano quattro VAE diverse contenenti da quattro a otto parassiti che esprimono YFP nei controlli.Tuttavia, le frecce indicano quattro gruppi di parassiti dispersi che riflettono quattro eventi indipendenti di uscita (egress VAs). Pertanto, il rapporto tra fenotipi mutanti e di tipo selvatico può essere facilmente determinato contando seguendo questa procedura. Possono essere eseguiti ulteriori metodi, come la complementazione cosmica o il sequenziamento dell'intero genoma, per identificare la mutazione responsabile e quindi il gene di interesse.Dopo aver visionato questo video, dovresti avere una buona comprensione di come titolare un mutageno di interesse, mutagenizzare una popolazione di parassiti Toxoplasma e isolare singoli mutanti sensibili alla temperatura per l'egresso da quella popolazione mutagenizzata. Non dimenticare che lavorare con parassiti Toxoplasma resistenti alla parametamina può essere estremamente pericoloso, e precauzioni come l'uso di occhiali di sicurezza devono essere sempre adottate durante l'esecuzione di questa procedura.

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Immunologia e Infezioni

Dimostriamo qui che riprogrammazione epigenetica tramite trasferimento nucleare di cellule somatiche (SCNT) può essere utilizzato come uno strumento per generare modelli di topo con pre-definito recettore delle cellule T (TCR) specificità. Questi topi transnuclear esprimono il corrispondente TCR dal loro luogo endogena sotto il controllo del promotore endogeno.

I topi con Transnuclear predefiniti Specificità cellule T contro il recettore Toxoplasma gondii Ottenuto Via SCNT

Qui riportiamo un metodo per l'utilizzo di tipo I e tipo...

La manipolazione genetica in<em&gt; Δku80</em&gt; Ceppi per analisi genomica funzionale di<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Descriviamo una metodologia per effettuare l'analisi genetica in Chlamydia sulla base di mutagenesi chimica e il sequenziamento dell'intero genoma. Inoltre, un sistema di scambio di DNA all'interno delle cellule infettate è descritto che può essere utilizzato per la mappatura genetica. Questo metodo può essere ampiamente applicabile a sistemi microbici privi sistemi di trasformazione e strumenti genetici molecolari.

Approcci genetici in avanti<em&gt; Chlamydia trachomatis</em

La genetica in avanti è un potente approccio per identificare i geni nei patogeni intracellulari importanti per la resistenza all'immunità autonoma cellulare. L'approccio attuale utilizza cellule immunitarie innate, in particolare macrofagi, per identificare nuovi geni Toxoplasma gondii importanti per l'evasione immunitaria.

Forward Genetica schermi usando macrofagi per identificare<em&gt; Toxoplasma gondii</em&gt; geni importanti per la Resistenza di IFN-γ-Dependent cellulare Immunità autonoma

Coxiella burnetii è un batterio Gram-negativi obbligato intracellulare responsabile della zoonotici malattia febbre Q. Qui si descrivono i metodi per la generazione di Coxiella mutanti di trasposoni fluorescente nonché l'identificazione automatizzata e l'analisi dei risultanti internalizzazione, replica e citotossici fenotipi.

Generation e Multi-fenotipica Screening-Alto contenuto di<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Mutants transposon

Sono mostrati i dettagli su come mappare QTL con una mappa genetica basata su una sequenza intero di genoma può essere utilizzata per identificare un gene di resistenza alla droga in Toxoplasma gondii e come questo può essere verificato con il sistema CRISPR / Cas9 che modifica in modo efficiente un obiettivo genomico, in questo caso il Gene di resistenza alla droga.

Mapping QTL e modifica CRISPR / Cas9 per identificare un gene di resistenza alla droga in<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Presentato qui è un protocollo per valutare l'efficacia dell'inibizione dei composti chimici contro la crescita intracellulare in vitro di Toxoplasma gondii utilizzando un analisi della crescita basata sulla luciferasi. La tecnica viene utilizzata per confermare la specificità dell'inibizione mediante la delezione genetica del gene bersaglio corrispondente. L'inibizione di LHVS contro la proteasi TgCPL viene valutata come esempio.

Determinazione dell'efficienza dell'inibitore chimico contro la crescita intracellulare del Toxoplasma Gondii utilizzando un saggio di crescita basato su Luciferase

Questo protocollo utilizza promotori-reporter fluorescenti, microscopia a cellule vive e estrazione di inclusione individuale in un approccio genetico diretto in avanti per identificare e isolare i mutanti dello sviluppo della Chlamydia trachomatis.

Approccio genetico in avanti a cellule vive per identificare e isolare i mutanti dello sviluppo nella chlamydia trachomatis

Questo lavoro descrive un protocollo per uno screening genetico multicopia soppressore in Schizosaccharomyces pombe. Questa schermata utilizza una libreria plasmidica dell'intero genoma per identificare cloni soppressori di un fenotipo con perdita di funzione associato a un ceppo mutante di query. Nuovi soppressori genetici del mutante nullo ell1 sono stati identificati utilizzando questa schermata.

Screening genetico per l'identificazione di soppressori multicopia in Schizosaccharomyces pombe

Qui presentiamo un protocollo per identificare rapidamente e genotipare i ceppi di Toxoplasma gondii utilizzando il sequenziamento nanoporo portatile di marcatori genetici selezionati, consentendo un'identificazione scalabile e mirata dei ceppi in isolati mantenuti in laboratorio, con potenziali applicazioni future in contesti di sorveglianza.

Sequenziamento multi-locus per la tipizzazione a deformazione di Toxoplasma gondii

Scopri un metodo di screening fenotipico per isolare mutanti di Toxoplasma gondii con difetti nell'egressione cellulare. Questa tecnica utilizza mutagenesi chimica e selezione a temperatura sensibile per studiare i meccanismi molecolari del parassita.

Uno screening genetico per isolare Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

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